酶的固定化技术课件.ppt

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1、主要内容为什么要固定化什么叫做固定化如何固定固定化的酶活力测量固定化酶的特征固定化酶的应用1、稳定性差2、回收困难，一次使用3、产物的分离纯化困难一、为什么要对酶进行固定化？二、什么是固定化酶固定化酶（Immobilizedenzyme）：固定在一定载体上，在一定空间范围内起催化作用的酶。水溶性酶水不溶性载体水不溶性酶（固定化酶）固定化技术必须注意维持酶的催化活性及专一性固定化应该有利于生产自动化、连续化固定化酶应该有最小的空间位阻酶与载体必须结合牢固固定化酶应有最大的稳定性固定化酶成本要低三、固定化酶的制备原则优点固定化酶可以重复，使用效率高，成本低极易将固定化酶与底物、产物分开

2、；在大多数情况下，能提高酶的稳定性；具有一定的机械强度可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；酶反应过程能够加以控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；较游离酶更适合多酶反应；可以增加产物的收率，提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。四、固定化酶的优缺点缺点固定化时，酶活力有损失；工厂初始投资大；只能用于可溶性底物；胞内酶必须经过酶的分离。吸附法、包埋法、结合法、交联法五、如何进行酶固定化固定化酶的模式图定义；利用各种固体吸附剂将酶或含酶细胞吸附在其表面上而使酶固定的方法称为物理吸附法，简称吸附法。常用的吸附剂：活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃、硅胶、

3、羟基磷灰石等。优点：操作简便、条件温和、不易变性失活、载体廉价、可反复使用。缺点：酶与载体结合不牢固，易脱落。（一）吸附法定义：将酶或含酶菌体包埋在各种多孔载体中，使酶固定化的方法称为包埋法。根据包埋的材料和包埋方法的不同，可分为：凝胶包埋法和半透膜包埋法两类。（二）包埋法将酶分子包埋在凝胶格子里。凝胶包埋法用得最多、最有效，但不适用于底物或产物分子很大的酶类的固定化。1、凝胶包埋法条件温和，操作简便，对酶活影响小，但强度差。天然凝胶：合成凝胶：琼脂凝胶、海藻酸钙凝胶、角叉菜胶、明胶等；聚丙烯酰胺凝胶、光交联树脂等强度高，对温度、pH值变化耐受性强，需要特定的聚合条件，酶易变性。包

4、埋材料将酶包埋在有各种高分子聚合物制成的小囊中，制成固定化酶。半透膜：聚酰胺膜、火棉胶膜等。适用于底物和产物都是小分子的酶的固定化。2、半透膜包埋法（微囊化法）（1）界面沉淀法：利用某些高聚物在水相和有机相的界面上溶解度极低而形成皮膜将酶包埋。例：先将含高浓度的酶液在与水互不相溶的有机相中乳化形成油包水的微滴,再将高聚物加入乳化液中,然后使高聚物在油水界面沉淀析出,形成膜,将酶包埋,最后移入水相中。此法条件温和,酶失活少,但是要除去膜上残留有机溶剂很麻烦。制备方法：（2）界面聚合法：利用亲水性单体和疏水性单体在界面发生聚合原理包埋酶。例：将酶和已二胺的水溶液与葵二酰氯的甲苯溶液混合

5、，再加SPAN乳化已二胺和葵二酰氯，在水相和有机相的界面聚合形成包埋酶的颗粒。1、离子键结合法通过离子键使酶与载体结合的固定化方法。载体：DEAE-纤维素、TEAE-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、CM-纤维素。优点缺点酶与载体结合不牢固，使用时需严格控制好pH值、离子强度、温度等操作条件。（三）结合法条件温和、操作简便、活力损失少。★通过共价键使酶与载体结合的固定化方法。载体主要有：纤维素、琼脂糖凝胶、葡聚糖凝胶、甲壳质、氨基酸共聚物、甲基丙烯醇共聚物等。※载体→活化→活化载体基团＋酶分子基团2、共价键结合法适用于含有苯氨基的不溶性载体载体先在稀HCl和亚硝酸钠中进行重氮反应，然后

6、再在温和条件下和酶分子上相应的基团如酚羟基或咪唑基进行偶联。（1）重氮法Tyr含量高的木瓜蛋白酶、脲酶、葡萄糖氧化酶、碱性磷酸酶、β-葡萄糖苷酶可与多种重氮化载体连接。（2）叠氮法含有酰肼基团的载体可用亚硝酸活化，生成叠氮化合物。活泼的叠氮基团可与酶分子中的-NH2形成肽键，此外叠氮基团还可与酶分子中的-OH、-SH等反应。使酶固定化。如：如：R-O-CH2–COOH+CH3OHR-O-CH2–COOCH3+H2OR-O-CH2–COOCH3+NH2-NH2R-O-CH2–CONH2-NH2+CH3OHR-O-CH2–CONH2-NH2+HNO2R-O-CH2–CON3+H2OR-

7、O-CH2–CON3+E-NH2R-O-CH2–CONH-ER-O-CH2–CON3+E-OHR-O-CH2–CO-O-ER-O-CH2–CON3+E-SHR-O-CH2–CO-S-ECMC(羧甲基纤维素)对于带-OH的载体如葡萄糖、纤维素、琼脂糖来说是最常用的反应。在碱性条件下载体-OH和BrCN反应生成极活泼的亚氨基碳酸酯衍生物，它们在碱性条件下可与酶的氨基进行共价偶联反应。（3）溴化氰法碱性氨基甲酸衍生物亚氨碳酸酯衍生物+ENZ异脲型亚氨碳酸酯型氨基甲酸酯型（4