测量蛋白质含量的方法.doc

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1、蛋白质含量测定蛋白质含量测定方法，是生物化学研究中最常用、最基本的分析之一。目前常用的方法有凯氏定氮法(Kjedahl）、双缩脲法(Biuret)、紫外吸收法、考马斯亮蓝法(Bradford)。其中Bradford法灵敏度最高，比紫外吸收法灵敏10~20倍Biuret法灵敏100倍以上。凯氏定氮法虽然比较复杂，但较准确，往往以定氮法测定的蛋白质作为其他方法的标准蛋白质。1.凯氏定氮法1．1原理凯氏定氮法测定蛋白质分为样品消化、蒸馏、吸收和滴定4个过程。其原理是样品中含氮有机化合物与浓硫酸在催化剂作用下共热消化，含氮有机物分解产生氨，氨又与—酸作用，变成硫酸铵。然后

2、加碱蒸馏放出氨，氨用过量的硼酸溶液吸收，再用盐酸标准溶液滴定求出总氮量换算为蛋白质含量。1．2特点凯氏定氮法是目前分析有机化合物含氮量常用的方法，是测定试样中总有机氮最准确和最简单的方法之一，被国际国内作为法定的标准检验方法。该凯氏定氮法适用范围广泛，用于标准蛋白质的准确测定，干扰少，干扰是非蛋白氮（可用三氯乙酸沉淀蛋白质而分离）测定结果准确，重现性好，但操作复杂费时，试剂消耗量大。费时太长，通常8-10个小时，灵敏度低，测定范围是0.2-1.0mg。2.双缩脲法2．1原理双缩脲(N}I3C0NHC0NH是两个分子脲经180℃左右加热，放出1个分子氨后得到的产物。

3、在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能够以1个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。2.2特点双缩脲法中样品的取用量对测定结果的准确性有显著影响.采用0．5g样品，40mL双缩脲试剂的比例具有较高的检测精度。双缩脲法对不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，不受温度的影响。可快速测定蛋白质含量，试剂单一，方法简便，干扰物质少，如硫酸铵，Tris缓冲液，某些氨基酸。但灵敏度差，测定范围为l～2Omg蛋

4、白质，20-30min。适用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定，常用于谷物蛋白质含量测定。3.紫外光吸收法3．1原理蛋白质分子中，酪氨酸、苯丙氨酸和色氨酸残基的苯环含有共轭双键，使蛋白质具有吸收紫外光的性质，吸收峰在280nm处，其吸光度(即光密度值)与蛋白质含量成正比。此外，蛋白质溶液在238nrll的光吸收值与肽键含量成正比。利用一定波长下，蛋白质溶液的光吸收值与蛋白质浓度的正比关系，可以进行蛋白质含量的测定。3．2特点最常用的紫外吸收法是280nm的光吸收法，紫外吸收法简便、较灵敏、快速，不消耗样品，低浓度盐类不干扰测定，测定后仍能回收使用。较高灵敏

5、，测定范围是50-100ug，用于层析柱流出液的检测，时间较快，5-10min。缺点是，准确度较差，干扰物质多，用标准曲线法测定蛋白质含量时，对于那些与标准蛋白中酪氨酸和色氨酸含量差异大的蛋白质，有一定的误差若样品中含有嘌呤、嘧啶及核酸关，等吸收紫外光的物质，会出现较大的干扰。核酸的干扰可以通过查校正表，再进行计算的方法加以适当的校正。但是因为不同的蛋白质和核酸的紫外吸收是不相同的，虽然经过校正，测定的结果还是存在一定的误差。紫外吸收法测定时，由于蛋白质吸收高峰常因pH的改变而有变化，因此要注意溶液的pH值，测定样品时的pH要与测定标准曲线的pH相一致。4.考马斯

6、亮蓝法(Bradford)4.1原理Bradford法是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。考马斯亮蓝是一种有机染料，在游离状态下呈红色，在稀酸溶液中与蛋白质的碱性氨基酸(特别是精氨酸)和芳香族氨基酸残基结合后变为蓝色，其最大吸收波长从465nm变为595nm，蛋白质在1～1000ug范围内，蛋白质一色素结合物在595nm波长下的吸光度与蛋白质含量成正比，故可用于蛋白质的定量测定。4.2特点考马斯亮蓝G-250与蛋白质结合反应十分迅速而稳定，2min左右即达到平衡其结合物室温下1h内保持稳定，且在5～20min之间，颜色的稳定性最好，颜色深浅随蛋白质不同而变化该法

7、方法简便，易于操作，所用试剂较少，显色剂易于配制。干扰物质少，如糖、缓冲液、还原剂和络合剂等均不影响显色，灵敏度高，测定范围是1-5ug。速度快，5-15min。此法的缺点是由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用y一球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。该方法适用于要求灵敏度高、快速定量测定微量蛋白质的测定。亲爱的用户：烟雨江南，画屏如展。在那桃花盛开的地方，在这醉人芬芳的季

8、节，愿你生