南京农业大学考研生化试验.docx

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1、精品文档实验一缓冲液配制和pH值测定实验二荧光光度法测定核黄素的含量实验三茚三酮比色法测定赖氨酸含量实验四考马斯亮蓝G-250比色法测定蛋白质含量实验五2,6-二氯酚靛酚滴定法测定L-抗坏血酸的含量实验六间隔法测定过氧化物酶的活力实验七连续记录法测定过氧化氢酶的活力实验八纸电泳分离鉴定三种腺苷酸综合性开放实验一.目的了解配制缓冲液和pH计的基本原理。掌握配制缓冲液和使用pH计的基本方法。二.原理在一定的酸或碱作用下，能够自动调整和保持溶液pH值基本不变的溶液称为缓冲液。以HAc和NaAc组成的缓冲液为例，

2、它的pH符合下面关系：pH=pKa-lg[HAc]/[Ac-]，因此改变[HAc]/[Ac-]的比值，可以在一定范围内配制不同pH值的缓冲液。缓冲液的缓冲容量大小不仅与其总浓度有关，而且与其组分比也有关。总浓度越大，缓冲容量越大；总浓度一定，其组分浓度比越接近1，缓冲容量越大。缓冲液适当稀释或浓缩，其pH值基本保持不变。测定pH值的pH计（或称酸度计），一般是由一支对H+敏感的玻璃电极和一支不随溶液中被测离子活度变化而改变其本身电位的甘汞电极以及一个测量电位的电位计所组成，两支电极和测试溶液构成一个伏特电

3、池，电极在不同的pH值溶液中产生不同的电位，它符合电化学理论中的Nernst方程，即E=E0-(2.303RT/F)pH。测定中，首先测得已知pH的标准缓冲液中产生的电位Es，然后，由测得未知pH缓冲液中产生的电位Ex通过公式可直接算出该缓冲液的pH（pHx）。为了方便，pH计上装有一个定位调节器，当测量标准缓冲液pH时，利用它可把读数直接指示在标准的pH值上，这样在以后测未知pH的缓冲液时，该电位读数也就直接表示相应的pH值。在本实验使用的BeckmanF61pH计计中，以上过程均由仪器自动完成。三.实

4、验试剂及设备1.试剂磷酸氢二钠（NaHPO·12HO）、磷酸二氢钠（NaHPO·2HO）242242冰醋酸、醋酸钠（NaAc·3HO）、三羟甲基氨基甲烷（Tris）2甘氨酸、盐酸、标准pH缓冲液（pH4.01、7.00、10.01）2.仪器电子天平（感量0.001g）pH计3.器材9欢。迎下载精品文档容量瓶：100mL×2量筒：50mL×1移液管：10mL×1烧杯：100mL21200mL22漏斗、洗瓶、洗耳球、移液管架、玻棒：各1四.操作步骤1.磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液配制（0.1mol/L，pH7

5、.0）(1)由附录“常用缓冲溶液的配制”表中通过计算，分别称取NaHPO·12HOg，NaHPO·2HOg，用蒸馏水溶解后，定容至100mL。242242(2)将配好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用。2.醋酸-醋酸钠缓冲液配制（0.1mol/L，pH5.4）(1)0.1mol/L醋酸钠母液的配制：称取NaAc·3HOg，用蒸馏水溶解后，定容至50mL。2(2)0.1mol/L醋酸母液的配制：吸取冰醋酸mL，用蒸馏水定容至1000mL。(3)取0.1mol/L醋酸钠母液43mL，0.1mol/L醋酸7

6、mL，于烧杯中混匀，用pH计测定pH值，使混合液的pH值最终达到5.4。(4)将配制好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用。3.Tris-Gly-HCl缓冲液配制（0.025mol/L，pH8.3）(1)称取三羟甲基氨基甲烷（Tris）0.300g，甘氨酸1.44g，加入80mL蒸馏水，加热溶解。(2)冷却后，用pH计测定pH值，并不断滴加2.5mol/L盐酸，使pH值最终达到8.3。(3)用蒸馏水定容至100mL。(4)将配制好的缓冲液倒入试剂瓶，贴上标签，保存备用五.思考题1.配制缓冲液时，选取合适

7、的缓冲试剂，主要根据什么原则？一.目的了解荧光法测定核黄素的原理和方法。学习荧光光度计的操作和使用。二.原理核黄素（维生素B2）是一种异咯嗪衍生物，它在中性或弱酸性的水溶液中为黄色并且有很强的荧光。这种荧光在强酸和强碱中易被破坏。核黄素可被亚硫酸盐等还原成无色的二氢化物，同时会失去荧光，因而检测样品时要防止荧光的衰减。二氢化物在空气中易重新氧化，恢复其荧光，其反应如下：2.配制缓冲液，常用的方法有哪几种？9欢。迎下载精品文档图2核黄素氧化还原机理图核黄素的激发光波长范围约为440—500nm（一般为440

8、nm），发射光波长范围约为510—550nm（一般为520nm）。利用核黄素在稀溶液中荧光的强度与核黄素的浓度成正比，可进行定量测定。根据核黄素的荧光特性亦可进行定性鉴别。注意：在所有的操作过程中，要避免核黄素受阳光直接照射。三.实验材料及设备1.材料核黄素药片2.仪器荧光光度计天平（感量0.0001g）3.器材普通试管：25mL×10容量瓶：100mL×2(棕色)移液管：10mL×15mL×11mL×1烧杯：50mL×225