Rab7负向调控巨噬细胞中TLR34信号转导通路的研究.pdf

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1、分类号Q75学校代码10129UDC577学号2008210021Rab7负向调控巨噬细胞中TLR3/4信号转导通路的研究ResearchonthenegativeregulationofRab7ontheTLR3/4signalingpathwaysinmacrophages申请人：王宁飞学科门类：理学学科专业：生物化学与分子生物学研究方向：天然免疫的调控指导教师：王玉珍副教授论文提交日期：二〇一一年六月摘要Toll样受体家族可以识别几乎所有的病原微生物的一些结构组分和代谢产物，通过信号转导通路诱发细胞因子和趋化因子等启动机体的天然免疫，构成了机体抵抗病原微生物的第一道防线，在免疫学研究

2、中一直是一个很受关注的家族。TLRs的活化是一把双刃剑。一方面TLRs的活化在启动天然免疫应答和适应性免疫应答中发挥重要作用，另外一方面过渡活化或者活化异常可能引起急慢性疾病。因此TLR信号转导通路的负相调控成为天然免疫研究中的热点问题。目的：本实验通过建立稳定表达Rab7及其突变体的巨噬细胞系，分析稳定表达细胞系的生物学特性，研究Rab7及其突变体基因过表达后对LPS和PolyI:C刺激的巨噬细胞表达细胞因子的影响。方法：将Rab7及其突变体Rab7(T22N)的真核表达载体通过脂质体法转染RAW264.7细胞，G418选择性培养基筛选，建立稳定表达Rab7及Rab7T22N的细胞系。通

3、过RT-PCR和WesternBlot方法鉴定稳定表达细胞系。通过观察细胞形态及MTT法分析稳定表达细胞系的生长特性。以LPS和PolyI:C刺激稳定表达细胞系不同时间后检测细胞因子的表达量变化。结果：与转染空质粒的细胞相比，转染Rab7和Rab7T22N的细胞中Rab7的mRNA和蛋白水平都显著增高。Rab7过表达后引起细胞形态变化并显著抑制了细胞增殖，Rab7T22N过表达后促进细胞增殖。Rab7过表达后，巨噬细胞在LPS和PolyI:C刺激后分泌的细胞因子显著降低，而Rab7T22N过表达后其的分泌又恢复。结论：成功建立了稳定表达Rab7及其突变体的细胞系。Rab7过表达后抑制了细胞

4、增殖，负向调控了TLR信号通路。该研究为进一步阐明Rab7在TLRs信号通路中的作用奠定了基础。关键字：TLR3；TLR4；PolyI:C；LPS；Rab7ResearchonthenegativeregulationofRab7ontheTLR3/4signalingpathwaysinmacrophagesAbstractTherecoganitionofthestructuralcomponentsandmetabolitesofpathogenicmicroorganismbyToll-likereceptorscaniniatiateinnateimmunitybypromoti

5、ngtheproductionofcytokinesandchemokines,andthusconstituethefirstlineofdefencetopathogenicmicroorganism.StudyontheTolllikereceptorhasbeenapopularconcerninimmunologicalresearch.However,theactivationofTLRsisadoubleedgedsword.Ononehand,activationofTLRsplayavitalroleintheinnateandadaptiveimmuneresponse

6、s,ontheotherhand,overreactionofthesignalingofTLRshasreportedtobeassociatedwithacuteandchronicdiseases.Therefore，negativeregulationontheTLRsignalingpathwaysbecomeahotissue.Objective:ToestablishandanalyzethebiologicalcharacteristicsoftransformedmacrophagecelllinesstablyexpressingRab7anditsdominantne

7、gativemutantRab7T22N,andstudytheproductionofcytokinesintransformedmacrophagecelllinesafterstimulationwithLPSandPolyI:C.Methods:theeukaryoticexpressionvectorsofRab7andRab7T22NweretransfectedintoRAW264.7cellsbylipo