基因敲除技术.doc

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1、基因敲除技术研究进展综述摘要：基因敲除在20世纪80年代发展起來后已经应用到许多领域，如建立人类疾病的转基因动物模型(糖尿病转基因小鼠、神经缺损疾病模型等)。这些疾病模型的建立使研究者可以在动物体内进行疾病的研究：研究发育过程屮各个基因的功能，研究治疗人类遗传性疾病的途径。关键字：基因敲除；Cre/LoxP系统；基因载体；生物模型1.概述：基因敲除又称为基因打靶，是指从分子水平上将一个基因去除或替代，然后从整体观察实验动物，推测相应基因功能的实验方法，是功能基因组学研究的重要研究工具。是口80年代末以来发

2、展起来的一种新型分子生物学技术。通常意义上的基因敲除主要是应用DNA同源重组原理，用设计的同源片段替代靶基因片段，从而达到基因敲除的H的。随着基因敲除技术的发展，除了同源重组外，新的原理和技术也逐渐被应用，比较成功的有基因的插入突变和iRNA,它们同样可以达到基因敲除的H的。基因敲除己成为当前医学和生物学研究的最热点与最前沿，并己对生物学和医学的许多研究领域产生深刻的影响，成为革命性的研究工具，具有极其重要的理论意义和实践意义。基于基因敲除技术对医学牛物学研究做出的重大贡献，在该领域取得重大进展的三位科学

3、家，70岁的美国人马里奥•卡佩奇(MarioCapecchi)>82岁的美国人奥利弗•史密西斯(OliverSmithies)和66岁的英国人马丁•埃文斯(MartinEvans)分享了2007年诺贝尔生理学或医学奖。2•基因敲出技术发展历史80年代末期的基因敲除技术为第一代技术，属完全性基因敲除，不具备时间和区域特异性。关于第二代区域和组织特异性基因敲除技术的研究始于1993年。Tsien等于1996年在《Cell》首先报道了第一个脑区特貝性的基因敲除动物，被誉为条件性基因敲除研究的里程碑。该技术以Cr

4、e/LoxP系统为基础，Ore在哪种组织细胞屮表达，基因敲除就发生在哪种组织细胞屮。2000年Shimizu等〔于^Science》报道了以吋间可调性和区域特异性为标志的第三代基因敲除技术，其同样以Cre/LoxP系统为基础，利用四环素等诱导Cre的表达。该技术使H的基因的敲除在时间上可人为控制，避免了死胎或动物出生后不久即死亡等现象的出现。2004年该实验室Cui〔等乂报道了第四代基因工程技术，即可诱导的区域性蛋白质敲除技术，用这一技术构建的模式动物可在几分钟内反转性地激活或敲除特定蛋白质的功能，从根本

5、上改变了前三代基因敲除技术对蛋白质代谢速度的内在依赖性，达到空前的吋间精度，成为口前功能基因组和功能蛋白质组研究最先进的工具之一。然而，长期以来上述基因敲除技术只能在小鼠上完成，因为只有小鼠的ES细胞能在体外培养屮无限增殖并同时保持多分化潜能。但我们知道，大鼠、家兔、猪以及猴等人动物模型在疾病研究屮更接近于人类，人动物更有益于某些繁琐的手术操作，同吋血浆及组织样本量较多，更有益于研究。3•基因敲出的一般步骤：利用基因打靶技术产生转基因动物的程序一般为：a.ES细胞的获得：现在基因敲除一般应用于鼠，血最常用

6、的鼠的种系是129及其杂合体，因为这类小鼠具有自发突变形成I畸胎瘤和畸胎肉瘤的倾向，是基因敲除的理想实验动物。而其他遗传背景的胚胎干细胞系逐渐被发展应用，最近来自于C57BL/6XCBN/JNCrjFl小鼠的胚胎干细胞系成功地用于基因敲除。C57BL/6小鼠种系等己经广泛的应用于免疫学领域，并以此为背景建立了许多成功的转基因模型。b.基因载体的构建：把口的基因和与细胞内靶基因特异片段同源的DNA分子都重组到带有标记基因（如门eo基因，TK基因等）的载体上，此重组载体即为打靶载体。因基因打靶的Fl的不同，此

7、载体有不同的设计方法，可分为替换性载体和插入型载体。如为了把某一外源基因引入染色体DNA的某一位点上，这种情况下应设计的插入型载体耍包括外源基因（即FI的基因）、同源基因片段及标记基因等部分。如为了使某一基因失去其生理功能，这时所要设计的替换型打靶载体,应包括含有此靶基因的启动子及第一外显子的DNA片段及标记基因等诸成分。c.将基因打靶载体通过一定的方式（常用电穿孔法）导入同源的胚胎干细胞（EScell）屮，使外源DNA与胚胎干细胞基因组屮相应部分发生同源重组，将打靶载体屮的DNA序列整合到内源基因组屮从

8、而得以表达。一般地，显微注射命屮率较高，但技术难度较大，电穿孔命屮率比显微注射低，但便于使用。d.用选择性培养基筛选已击屮的细胞：一般地，筛选使用正、负选择法，比如用G418筛选所有能表达neo基因的细胞,然后用Ganciclovir淘汰所有HSV-TK止常表达的细胞，剩下的细胞为命屮的细胞。将筛选出来的靶细胞导入鼠的囊胚屮，再将此囊胚植人假孕母鼠体内，使其发育成嵌合体小鼠。e.通过观察嵌和体小鼠的生物学形状的变化进血了解H的