流式细胞术的原理及应用ppt课件.ppt

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1、流式细胞术的原理及应用临床实验诊断教研室施琼1流式细胞术（FlowCytometry,FC/MFACS）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性的技术，同时可以对特定群体加以分选研究对象为生物颗粒，如各种细胞、染色体、微生物、及人工合成微球等研究的微粒特性包括多种物理及生物学特征，并加以定量流式细胞术的概念2流式细胞仪特点单细胞悬液或生物颗粒分析速度高多参数精度高当代最先进的细胞定量分析技术3FACSCalibur特点：光路调节系统固定自动化程度高操作简便使用寿命长配备1-2根激光

2、细胞分选速度慢，主要用于细胞分析临床型（台式机）4BDLSR5FACSVantageDiVa科研型（大型机）特点：多数字化适用于各类细胞分选4路分选6FACSAria科研型特点：分辨率高选配多种波长和类型激光器可把感兴趣细胞分选到特定培养孔或板上（4路和24孔板）适用于高速分选和多色分析7流式细胞仪检测范围细胞大小细胞粒度细胞表面面积核浆比例DNA含量与细胞周期RNA含量蛋白质含量细胞结构特异性抗原（细胞表面/胞浆/核）细胞内细胞因子细胞活性酶活性激素结合位点细胞受体细胞功能8流式细胞术发展简史1934年，Mol

3、davan开创流式细胞自动计数的基础。1950s，Coulter公司设计细胞自动计数器，初步解决了流动细胞的通路问题。1965年，在细胞分选中应用了超声震动器。1969年，Stanford、California大学的研究组发明了第一台较满意的流式细胞仪。1972年，FACS-І型仪器试制成功，并在美国建国200周年纪念会上与人造卫星并列展示。9流式细胞仪的工作原理10FCM的工作系统1.液流系统：细胞悬液被吸入检测室后，在鞘液(sheath)的约束下，通过喷嘴，使其形成单细胞悬液。112.光学系统：激光是较常用的

4、光源,稳定性好、单色性好。散射光和荧光信号被收集、处理转化为数字信号。3.数据处理系统：对实验数据分析、存储、显示。具有智能化、自动化特点。12流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统细胞分选系统13液流系统：流动室、液流驱动系统InjectorTipFluorescencesignalsFocusedlaserbeamSheathfluid14液流中心由单列匀速运动颗粒组成的液柱15光学系统入射光系统：激光(Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳

5、定光照。发射光系统：散射光和荧光光收集系统是由若干组透镜、滤波片和小孔组成,将产生的光信号引导至检测器16入射光—激光光源单波长、高强度、高稳定性多采用氩离子激光器或氦氖激光器一般选配2-4根激光，488nm、633nm、355nm和407nmUV激光最多检测13个荧光参数1718发射光散射光信号前向散射光（fowordscatter,FS）：在激光束正前方的检测器，用于检测细胞或其他粒子物体的表面属性，如大小、形状等。侧向散射光（sidescatter，SS）：与激光束垂直方向的检测器为侧向检测器，主要用于检测

6、细胞内部结构属性，可获得细胞内超微结构和颗粒性质的参数。荧光信号19散射光FSC（小角散射光)它反应细胞的相对大小和截面积的大小SSC(90度角散射光)代表细胞的颗粒度和精细结构的变化全血细胞流式FSC-SSC图它反应细胞的物理特性,根据前侧向散射光，可以把不同类型的细胞群加以区分20ForwardAngleLightScatterFALSSensorLaser2190DegreeLightScatterFALSSensor90LSSensorLaser22LaserFluorescenceDetectorsFl

7、uorescenceFALSSensorFluorescencedetector(PMT3,PMT4etc.)PurdueUniversityCytometryLaboratories23LongpassShortpass　　Bandpass460500540460500540460500540SP500LP500BP500/50光收集系统：滤光片24电子系统：光电倍增管（PMT）25FACSCalibur光路图26细胞分选系统27当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干

8、涉检测器(interferencedetector)，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescencedetector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷，移动时就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。细胞分选的原理28FluorescenceActivatedCellS