基因工程5基因克隆载体-质粒ppt课件.ppt

《基因工程5基因克隆载体-质粒ppt课件.ppt》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。

1、基因克隆载体生物与食品工程学院1.载体的概念克隆载体是一种能携带外源DNA片段进入受体细胞，并在受体细胞中得以维持或表达的DNA分子。生物学本质：质粒、噬菌体、动植物病毒改造后的产物。特点：能在受体细胞内稳定存在和复制。2.载体的一般特征1.容易进入受体细胞2.自主复制3.筛选标记4.多克隆位点5.安全3.载体的种类1.质粒载体2.噬菌体载体3.病毒载体4.质粒生物学本质：细胞内染色体外的遗传物质。广泛存在于细菌细胞中，也出现在某些蓝藻、绿藻、眼虫、衣藻和真菌等细胞中。结构特征：供价闭环双链环状DNA。4.质粒4.显性质粒

2、与隐蔽质粒是否能使宿主细胞呈现出新性状。受检测手段的限制，现定为隐蔽性的质粒，未必是真正的隐蔽质粒。4.常见的显性质粒F质粒结合作用R质粒抗生素的抗性质粒Col质粒大肠杆菌素合成基因降解芳香烃、农药等毒物的降解质粒诱导植物形成冠瘿廇的Ti质粒4.质粒迁移自然条件下，某些质粒能通过结合作用转移到新宿主细胞内。质粒的转移受一系列基因的控制细菌产生鞭毛，合成细胞表面物质，促使宿主细胞与受体细胞结合，导致质粒从一个细胞转移到另一个细胞接合质粒非接合质粒4.质粒的复制在质粒复制过程中，同时会合成阻遏物，当质粒复制到一定拷贝数时，合成

3、的阻遏物累积到阻止质粒继续复制的程度，质粒复制停止。严谨型质粒松弛型质粒失控的质粒载体（温度）4.质粒的不亲和性两种质粒可能共存于同一宿主细胞之中，有的则不行。1.受相同的阻遏物阻止。2.相同的膜结合位点。受体细胞最好不含内源质粒5.质粒的提取氯化铯梯度离心EtBr嵌入的差别碱变性法6.构建质粒克隆载体的策略1.复制起始点2.限制性酶切位点3.标记基因4.载体本身应尽可能小5.根据需要组装各种小原件pSC101质粒第一个用于克隆真核基因的大肠杆菌质粒载体有四环素抗性基因含有EcoRI等酶的酶切位点严谨型复制质粒ColE1质

4、粒编码大肠杆菌毒素E1基因和使宿主细胞对E1免疫的基因pBR322质粒pBR322质粒是由多个质粒通过DNA重组技术构建的质粒。pSC101质粒四环素抗性基因ColE1->pMB1质粒提供复制起始点R1drd19质粒氨苄青霉素抗性基因缩小体积pBR322质粒大小：4.3kb抗氨苄青霉素抗四环素抗性基因内部酶切位点抗性基因外部酶切位点pBR322质粒的使用使用同一种酶切割pBR322和目的基因正确连接目的基因的质粒自身连接的质粒细菌没有吸收pBR322质粒通过筛选基因进行筛选pUC18/19pUC18/19由pBR322衍生

5、构建而成删除了pBR322的抗四环素基因保留氨苄青霉素的抗性基因添加乳糖操纵子的一个片段lacZ’（启动子、调节因子、β-半乳糖苷酶的α-肽基因）添加多克隆位点MCSpUC18/19TA载体TA载体是针对PCR而设计的一种质粒载体耐热性DNA聚合酶（Taq酶）具有一种非模板依赖活性，可在PCR产物的3’端加上一个非配对的A，根据该特性，设计出一种5’端带一个不配对的T，通过该质粒，可以直接将PCR产物以TA连接方式进行克隆，即TA克隆。质粒表达载体在克隆载体的基础上添加表达原件，构建成表达载体。在受体细胞内可以稳定维持并表

6、达外源目的基因。融合型表达载体pGEX非融合型表达载体pKK223-3分泌型表达载体pinIII影响质粒稳定性的因素1.代谢负荷有质粒的细胞代谢负荷大，复制慢2.拷贝数差度细胞个体之间质粒拷贝数的差3.重组体系质粒重组后以2倍的速度进行复制ThankYou