柑橘全爪螨代谢抗性相关基因表达差异研究

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1、柑橘全爪螨代谢抗性相关基因表达差异研究　　摘要：【目的】为了明确谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因、羧酸酯酶（CarE）基因，过氧化氢酶（CAT）基因在柑橘全爪螨Panonychuscitri抗性中的作用，【方法】在室内用噻螨酮对柑橘全爪螨进行抗性选育，进一步构建抗/敏品系数字基因表达谱，采用RPKM法对柑橘全爪螨敏感品系和噻螨酮抗性品系3种代谢抗性相关基因进行表达差异分析。【结果】经过20代抗性选育，获得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系，与敏感品系比较，柑橘全爪螨对噻螨酮的抗性倍数达到3532.12倍。基因差异性分析发现，抗性品系中有11条GST基因、17

2、条CarE基因和6条CAT基因表达上调；14条GST基因、24条CarE基因和3条CAT基因表达下调。上调倍数最高的GST基因、CarE基因和CAT基因分别为Unigene31530[log2ratio（RS/SS）=1.05]、Unigene23121[log2ratio（RS/SS）=2.05]和Unigene31477[log2ratio（RS/SS）=10.04]。进一步对Unigene31477进行荧光定量PCR分析发现，抗性和敏感品系基因表达水平没有显著差异。【结论】根据柑橘全爪螨抗/敏性品系基因表达差异推断，GST、CarE和CAT基因

3、可能与柑橘全爪螨对噻螨酮产生的抗性没有密切关系。13关键词：柑橘全爪螨；噻螨酮；抗性品系；敏感品系；代谢酶；基因表达差异中图分类号：S666文献标志码：A文章编号：1009-9980？穴2013？雪01-0022-06柑橘全爪螨Panonychuscitri（McGregor）又名柑橘红蜘蛛，属蜘蛛纲蜱螨目叶螨科，是一种世界广泛分布的重要害螨。柑橘全爪螨主要吸食柑橘叶片、嫩梢、花蕾和果实汁液，严重时引起落叶、落花、落果，造成减产。化学防治仍是控制柑橘全爪螨最有效的措施，但由于其个体小、世代多、繁殖力强，对药剂极易产生抗性。目前，柑橘全爪螨已对大多数登

4、记的有机磷、菊酯类杀螨剂产生了抗性[1-4]，专用杀螨剂抗性也极其突出[5-6]。噻螨酮属噻唑烷酮类低毒选择性专用杀螨剂，对柑橘全爪螨卵、幼螨、若螨活性极强，是低温下防治柑橘全爪螨的理想产品，在许多柑橘主产国广泛应用[7-8]。由于施用不当，柑橘全爪螨对噻螨酮已产生严重的抗性[9]，因而有必要建立其科学的抗性治理策略。弄清抗性机理是进行抗性治理的基础。13水解酶和保护酶活性增强是昆虫（螨类）对杀虫（螨）剂产生抗性的重要机制[10-11]，而基因的上调是3种代谢酶活性增强最直接的原因，因此，弄清代谢抗性相关基因表达差异是深入研究昆虫（螨类）抗性分子机理

5、的重要途径。鉴于此，笔者通过室内选育，获得了柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系，进一步探讨了抗性和敏感品系之间谷胱甘肽S-转移酶（GST）基因、羧酸酯酶（CarE）基因，过氧化氢酶（CAT）基因的表达差异，旨在弄清柑柑橘全爪螨抗性与3种代谢抗性相关基因表达差异的关系，从而明确柑橘全爪螨抗性产生可能的分子机理，为抗性治理提供理论依据。1材料和方法1.1材料供试虫源：柑橘全爪螨于2005年采自中国农业科学院柑桔研究所多年未施用药剂的柠檬上，后经室内不接触药剂连续饲养至今，视为相对敏感品系。柑橘全爪螨饲养温度为（25±1）℃、相对湿度为70%～80%，光周期L∶D=

6、14h∶10h。供试药剂：50g·L-1噻螨酮（hexythiazox）乳油，日本曹达株式会社生产。1.2柑橘全爪螨的生物测定采用联合国粮农组织推荐的玻片浸渍法[12]。在预备试验的基础上，在柑橘全爪螨雌成螨死亡率20%～90%内按等比级数将供试药剂分别配成5～7个浓度，现配现用。处理时将双面胶带剪成3cm长贴在载玻片的一端，用细毛笔挑起健康雌成螨，背部贴在胶带上，每块载玻片60头，每处理重复5次，共300头。将载玻片分别浸入药液，轻轻摇动5s后取出，用吸水纸吸净螨体多余的药液，在室温下晾干，1513min后放入光照培养箱（温度（25±1）℃，相对湿

7、度为70%～80%，光周期L∶D=14∶10），24h后在双筒解剖镜下分别观察死、活螨数，以清水处理为对照。1.3柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系选育柑橘全爪螨噻螨酮抗性品系从敏感品系选育而来。测定敏感品系（F0）对噻螨酮的敏感基线，然后以杀死品系70%～90%的噻螨酮浓度处理成螨，记录存活数量，存活个体继续饲养和药剂汰选，选择压力相近，每隔2代测定1次LC50（方法同1.2），观察抗性增长速度。1.4柑橘全爪螨代谢抗性相关基因差异性分析谷胱甘肽S-转移酶（GST）、羧酸酯酶（CarE）、过氧化氢酶（CAT）的基因信息从本课题组柑橘全爪螨转录组数据库获得[1

8、3]。基因表达谱文库构建参照Wang等[14]的方法，采用TRIzol试剂盒分别提取柑橘全爪螨噻螨酮抗/敏品