蛋白质的理化性质及其分离纯化ppt课件.ppt

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1、第三节蛋白质的理化性质及其分离纯化一、蛋白质的理化性质（一）蛋白质的两性电离（二）蛋白质的胶体性质（三）蛋白质的变性、沉淀和凝固（四）蛋白质的紫外吸收（五）蛋白质的呈色反应（一）蛋白质的两性电离蛋白质是由氨基酸构成的，其两端及侧链都含有可解离的酸性基团或碱性基团，因此在不同pH的介质中，蛋白质的带电状态就不同。蛋白质的等电点（pI）概念：当蛋白质溶液处于某一pH时，蛋白质解离成正、负离子的趋势相等，即成为兼性离子，净电荷为零，此时溶液的pH称为蛋白质的等电点。pI是蛋白质的特征性常数。利用蛋白

2、质两性电离的性质，可通过电泳、离子交换层析、等电聚焦等技术分离蛋白质。pH>pI带负电荷pH

3、子的特定空间构象被破坏，从而导致理化性质的改变和生物活性的丧失。变性本质：二硫键和非共价键的破坏引起空间结构的改变，不涉及一级结构的改变。核糖核酸酶变性因素：物理因素：加热、加压、超声波、紫外线化学因素：胍、脲、有机溶剂、强酸强碱、SDS-巯基乙醇、重金属离子生物碱试剂蛋白质变性后的理化和生物学性质改变：溶解度↓生物活性丧失及易被蛋白酶水解粘度↑结晶能力消失、应用：消毒灭菌低温保存生物制剂复性(renaturation)：蛋白质的变性程度较轻，去除变性因素后，又恢复了原有的空间构象和生物活性。

4、不可逆变性2.沉淀(precipitation)蛋白质的沉淀：蛋白质的肽链相互聚集而从溶液中析出的现象。+++++++-------+-蛋白质胶体颗粒的沉淀（沉淀）（疏水胶体）（疏水胶体）蛋白质的凝固作用（coagulation）蛋白质经强酸、强碱作用发生变性后，仍能溶解于强酸或强碱溶液中，若将pH调至pI，则变性蛋白质立即结成絮状的不溶解物，此絮状物仍可溶解于强酸和强碱中。如再加热则絮状物可变成比较坚固的凝块，此凝块不易再溶于强酸和强碱中，这种现象称为蛋白质的凝固作用。（四）蛋白质的紫外吸收波

5、长：280nm引起紫外吸收的因素：主要是色氨酸和酪氨酸(Trp,Tyr)的共轭双键。可用于蛋白质的定量（五）蛋白质的呈色反应茚三酮反应：肽和氨基酸的自由氨基与茚三酮生成蓝紫色化合物。双缩脲反应：蛋白质和肽类分子中的肽键在稀碱溶液中与硫酸铜共热，呈紫红色。呈色反应可用于蛋白质的定性和定量。二、蛋白质的分离和纯化（一）丙酮沉淀及盐析（二）电泳（三）透析（四）层析（五）分子筛（六）超速离心（一）丙酮沉淀及盐析原理：破坏亲水胶体的两个稳定因素。丙酮沉淀：0～4℃，10倍于蛋白质体积的丙酮，沉淀后立即分离

6、。盐析：将大量中性盐（如硫酸铵）加到蛋白质溶液中，破坏蛋白质在水溶液中的稳定因素，而使之从溶液中沉淀析出的现象。（二）电泳（electrophoresis）蛋白质在电场中可向其所带电荷相反的方向移动，这种现象叫电泳。由于不同的蛋白质带电多少、分子量大小及分子形状不同，因此在电场中泳动的速度就不同，从而可将蛋白质分离开来。应用：分离蛋白质和测分子量（三）透析（dialysis）蛋白质是高分子化合物，不能透过半透膜。将蛋白溶液装入用半透膜制成的透析袋中，可将蛋白质溶液中的小分子化合物除去，这种方法叫

7、透析。如在袋外放吸水剂（如聚乙二醇）还可达到浓缩的目的。应用：除盐和浓缩超滤利用超滤膜在压力下使大分子滞留，而小分子及溶剂滤过的方法叫超滤。超滤法在蛋白质溶液除盐、浓缩及分离纯化中有广泛的应用。（四）层析（chromatography）离子交换层析：根据蛋白质的电荷与层析载体（离子交换剂）电荷之间的相互作用而达到分离目的。应用：分离蛋白质阴离子交换树脂（五）分子筛根据多孔载体对不同大小，形状的蛋白分子的排阻能力不同而将各个组分分开的一种层析，又称凝胶过滤层析。应用：分离蛋白质、除盐（六）超速离心

8、（ultracentrifugation）不同蛋白质的密度与形态各不相同，在离心力场中沉降的速度也不同，从而将其分离。蛋白质在离心场中的行为用沉降系数（S）表示。S与蛋白质大体上和分子量成正比关系。S与蛋白质的密度和形状相关，如分子量相同，紧密颗粒的摩擦系数小－沉降快；而疏松颗粒的摩擦系数大－沉降慢。应用：蛋白质的分离纯化和测分子量。多肽链AA序列分析改进的Sanger法分析已纯化蛋白质的氨基酸残基组成。测定多肽链的N-端与C-端的氨基酸残基。把肽链水解成肽段，再分离纯化肽段。测各肽段的氨基酸