实验一 培养基的配制与灭菌技术

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1、实验一培养基的配制与灭菌技术一、目的要求1掌握配制培养基的一般方法和步骤。2学习高压灭菌锅的操作方法。二、基本原理牛肉膏蛋白胨培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基，它含有牛肉膏、蛋白胨和NaCl。其中牛肉膏为微生物提供碳源和能源，磷酸盐、蛋白胨主要提供氮源，而NACL提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化，一般实际应用时在下面垫以石棉网煮沸溶化，以免琼脂烧焦。琼脂在40℃时凝固，通常不被微生物分解利用。由于这种培养基多用于培养细菌，因此，要用稀酸或稀碱将

2、其pH调至中性或微碱性，以利于细菌的生长繁殖。高氏1号培养基是分离和培养放线菌的合成培养基，是由可溶性淀粉作碳源，KNO3作氮源，NaCl，K2HPO4.3H2O，MgSO4.7H2O，FeSO4.7H2O为微生物提供钠、钾、磷、镁、硫等离子。高压蒸汽灭菌是将待灭菌的物品放在一个密闭的加压灭菌锅内，通过加热，使灭菌锅隔套间的水沸腾而产生蒸汽。待水蒸气急剧地将锅内的冷空气从排气阀中驱尽，然后关闭排气阀，继续加热，此时由于蒸汽不能溢出，而增加了灭菌器内的压力，从而使沸点增高，得到高于100℃的温度，导致菌体蛋白质凝

3、固变性而达到灭菌的目的。在同一温度下，湿热的杀菌效力比干热大，其原因有三：一是湿热中细菌菌体吸收水分，蛋白质较易凝固；二是湿热的穿透力比干热大；三是湿热的蒸汽有潜热存在，这种潜热，能迅速提高被灭菌物体的温度，从而增加灭菌效力。灭菌的温度及维持的时间随灭菌物品的性质和容量等具体情况而有所改变。通常为15磅/英寸2(121.3℃)灭菌15—20分钟；不耐高压的培养基则可采用流通蒸汽灭菌或间歇灭菌。含糖培养基用112.6℃（8磅/英寸2）灭菌15分钟。紫外线灭菌是用紫外线灯进行的，紫外线杀菌机制主要是因为它诱导了胸腺

4、嘧啶二聚体的形成，从而抑制了DNA的复制；由于辐射能使空气中的氧电离成[O]再使O2氧化生成臭氧O3或使水H2O氧化生成过氧化氢H2O2，O3和H2O2均有杀菌作用。紫外线穿透力不大，所以，只适用于无菌室、接种箱的空气及物体表面的灭菌。三、器材天平，高压蒸汽灭菌锅，电烘箱，1mol/LNaOH,1mol/LHCl，培养皿，试管，吸管，酒精灯，三角烧瓶，烧杯，量筒，玻棒，接种环，牛角匙，pH试纸(pH5.5—9.0)，棉花，纱布，牛皮纸，记号笔，麻绳。四、操作步骤1．称量培养基的配方见附录Ⅰ。2．溶化（1）在上述

5、烧杯中可先加入少于所需要的水量，用玻棒搅匀，然后，在石棉网上加热使其溶解。待药品完全溶解后，补充水分到所需的总体积。（2）配制高氏1号培养基时，用少量冷水将淀粉调成糊状，再加入少于所需水量的沸水中，继续加热，使可溶性淀粉完全溶化，再称取其他各成分依次逐一溶化，对微量成分FeSO4.7H2O可先配成高浓度的贮备液后再加入，方法是先在100ml水中加入1g的FeSO4.7H2O配成0.01g/ml，再在1000ml培养基中加入1ml的0.01g/ml的贮备液即可。（3）将马铃薯块放入少于所需水量的水中，在石棉网上加

6、热，搅拌以免马铃薯块糊在烧杯底，煮沸20分钟，经常补充水分，将马铃薯及煮沸液经4层纱布过滤，补充水分到所需体积，加入称量的糖。3．调pH在未调pH前，先用精密pH试纸测量培养基的原始pH值，如果pH偏酸，用滴管向培养基中逐滴加入1mol/LNaOH，边加边搅拌，并随时用pH试纸测其pH值，直至pH达7.6。反之，则用1mol/LHCl进行调节。注意pH值不要调过头，以免回调，否则，将会影响培养基内各离子的浓度。对于有些要求pH值较精确的微生物，其PH的调节可用酸度计进行。4.分装按实验要求，可将配制的培养基分装

7、入试管内或三角瓶内（见图Ⅰ－1）。分装过程中注意不要使培养基沾在管口或瓶口上，以免沾污棉塞而引起污染。分装试管，其装量不超过管高的1/5，灭菌后制成斜面；分装三角瓶的量以不超过容积达一半为宜。5.加塞培养基分装完毕后，在试管口或三角瓶口上塞上棉塞，以阻止外界微生物进入培养基内而造成污染，并保证有良好的通气性能。应使棉塞长度的1/3在试管口外，2/3在试管口内。4．生理盐水的配置分装用吸管量取相应体积的生理盐水。图Ⅰ－1分装7.包扎加塞后，将全部试管用橡皮筋捆扎好，再在棉塞外保一层牛皮纸或报纸，以防止灭菌时冷凝水

8、润湿棉塞，其外再用橡皮筋扎好。用记号笔注明培养基名称，日期。8.灭菌（1）首先将内层灭菌筒取出，再向外层锅加入适量的水，使水面与三角搁架相平为宜。（2）放回灭菌桶，并装入待灭菌物品。三角瓶与试管口端均不要与桶壁接触，以免冷凝水淋湿包口的纸而透入棉塞，（3）加盖，将盖上的排气软管插入内层灭菌桶的排气槽内。再以两两对称的方式同时旋紧相对的两个螺栓。（4）通电加热，并同时打开排气阀，使水沸腾