扩展青霉脂肪酶定点突变随机突变易错pcr硕士论文

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1、扩展青霉脂肪酶热稳定性的分子突变【关键词】扩展青霉脂肪酶;定点突变;随机突变;易错PCR;【英文关键词】Penicillumexpaasumlipase;Site-directedmutagenesis;Randommutagenesis;error-pronePCR;【中文摘要】本研究利用定点突变和随机突变的方法,对扩展青霉脂肪酶(Penicilliumexpansumlipase,PEL)进行了蛋白质工程改造。1.PEL的定点突变采用重叠延伸PCR的方法,对扩展青霉脂肪酶进行多个点突变,选取了十一个突变位点,构建了7个单点突

2、变体和8个叠加突变体(与随机突变体ep8叠加)。将获得的突变基因在毕赤酵母中表达,并进行酶学性质的研究。(1)P197E的单点突变及叠加突变：PEL-P197E酶活为556U/mL,Tm值比野生型提高了0.90C。PEL-ep8-P197E酶活为592U/mL,其Tm值比野生型脂肪酶PEL的提高2.80C,比随机突变体PEL-ep8提高2.2℃；此外,叠加突变体PEL-ep8-P197E的底物特异性发生了改变。(2)K152R的单点突变及叠加突变：PEL-K152R酶活为530U/mL,PEL-ep8-K152R酶活为416U/

3、mL,二者的热稳定性与与野生型无明显差别。(3)P102L的单点突变及叠加突变：PEL-P102L酶活为300U/mL。PEL-ep8-P102L的酶活为612U/mL,最适作用温度提高了50...【英文摘要】InordertoimprovetheenzymepropertiesofthePenicillumexpaasumlipase(PEL),thePELgenewasmutatedbysite-mutagenesisandrandommutagenesis.1.Site-directedmutagenesisofPELIn

4、ordertoimprovethethermostabilityofPenicilliumexpansumlipase(PEL),Elevenmutationswerecreatedbysite-directedmutagenesis.MutationsweregeneratedbyoverlapextensionPCRusingthecDNAofwild-typelipasegene(lip07)orasinglesitemutantlipaseep8asthetemplateandtwospecialprimersthatc

5、orresp...摘要2-4Abstract4-6中文文摘7-13第一章绪论13-351理性设计14-152非理性设计15-342.2突变体库的构建策略16-292.2.1基于PCR而实现的随机突变16-192.2.2基于同源重组而实现的随机突变19-272.2.3基于非同源重组而实现的随机突变27-292.3定向进化筛选策略29-342.3.1表型观察选择和筛选29-302.3.2微孔板滴定法30-312.3.3各种展示技术31-343半理性设计34-35第二章材料与方法35-511实验材料35-381.1菌种和质粒351.2

6、酶与试剂351.3常用培养基及缓冲液35-371.4寡核苷酸引物37-381.5常用仪器382实验方法38-512.1扩展青霉脂肪酶的定点突变38-472.1.1P197E、K152R、P102L、N166D的单点突变及叠加突变38-442.1.2P163A、M193V、K120R的叠加突变44-462.1.3G205A、K94R、W169N、K94D的单点突变46-472.2扩展青霉脂肪酶的随机突变47-512.2.1突变体库的获得47-482.2.2随机突变基因表达载体的构建及表达482.2.3酶学性质的测定48-492.2

7、.4突变体脂肪酶基因的序列测定49-51第三章结果与分析51-831.PEL的定点突变51-781.1突变点的选择51-521.2P197E的单点突变及叠加突变52-581.3K152R的单点突变及叠加突变58-641.4P102L的单点突变及叠加突变64-671.5N166D的单点突变及叠加突变67-711.6P163A的叠加突变71-731.7K120R、M193V的叠加突变73-761.8G205A、K94R、K94D、W169N的单点突变76-782PEL的随机突变78-832.1随机突变基因的获得78-792.2表达质

8、粒库的构建及在毕赤酵母中的表达79-802.3突变体的酶学性质80-822.4突变体核苷酸序列测定82-83第四章小结与讨论83-891PEL的定点突变83-862PEL的随机突变86-89结论89-931定点突变89-902随机突变90-93参考文献