《逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
＇．．’＇＇￣｜．ｆ＂，＾．—－一读：ｖｅ．＾ｒ苗；；．巧＾芒蹲；堯ｉｒ；於擁扣．苗．沪’＇、‘游节巧＇、巧：ｒ磯汾听边．在１０、文丢矣新销献接乎学位单位巧巧：４３４ｉ一．人評令巧生学号：扇４１賴’．，巧卷Ｖ，皆券巧和ｉ豁＇．、’＇‘：璋’＾’．．．．．．．．．．＇．＾’；．’：皆．二＾去’．，：ｔｅｓ法＾；；？ｖ讲：巧誠＼．令给錫‘＇ｖｔ部＾、‘、强ｖ＇．：．．．与．－，轮公．参Ａ碱纖Ｖ為．Ｖ罐谭耀Ｉ絮欺，雜＇：，山乂：每誕络觀．屬１入导攀細：翊雞Ｖ馨、硕±黨：管论１：■？＾－＇－■’、■．－＇．＞；＇、＇■－，＾．／＇誘妒，；兴滅Ｉ＇，、梦＇幹护拓．＾．１Ｃ壤蜀磋转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病奏的抑制作用及药物选韻麵ｐｒ择巧下禽白血病病奉耐药秦株的产生Ｓｊ、＇＇■■－－．：．－；？，．ｏｆＶＮＲＴＩｓａｎｄ化Ｖ觀邸ｉｒｕｓｏｆＣｈｉｃｋｅｎｂＡｅａｒｉｎｏｊｊ棘中拆抑ｙ畔ｐｐｇ４＇．．＾义－咬＇Ｄｒｕ民ｅｓｉｓｔ撕ｃｅＡＷＳ化ａｉｎ；於．ｇ；、舜．占若Ｓｉ．，；；寧早，塌補＇‘‘．’＇．＇、．一、：＂＇巧？＾气店早＇－佔＇：：串：．户：：证’。冷产护心；社ｈＶ齡糸Ｗ奇皆、．＞生．带；满巧；《飾變臻讓隱曼顯震議議蘇瑪麵Ｉ…分缉議鑛赞謂載ｒ繁！、＇■雖＾碱辨诫縣薇葛富治Ｖ資．捷心謂堯化昼斯Ｉ庙崔中教＇、＇‘、＇一’．＇．＇＇＇＂＇、‘心、．＇‘、．＇户－＾．扣、叫＇：站；＇Ｘ：诚嗎’．．西如，Ｖｉ分；：私／據绵萨下像，線、Ｖ於＂２Ｄ’．；；、．；；ｇ；親＾細藏善鸭把巧．满讀作？画：》．－心沪＾：誘．謂靡扣掌＾嚇游马從爾ｔ：讀ｒ顯严义； 论文提交日期：2016.04.28论文答辩日期：2016.06.04学位授予日期：2016.06学位类别：农学答辩委员会主席：高迎春 本研究由国家自然科学基金青年科学基金项目（31402226）资助ThisstudywassupportedbytheNationalNaturalScienceFoundationofChinaYouthFundProject（31402226） 符号说明英文缩写英文全称中文名称ALVavianleukosisVirus禽白血病病毒ALV-AavianleukosisVirussubgroupAA亚群禽白血病病毒ALV-BavianleukosisVirussubgroupBB亚群禽白血病病毒ALV-CavianleukosisVirussubgroupCC亚群禽白血病病毒ALV-EavianleukosisVirussubgroupEE亚群禽白血病病毒ALV-JavianleukosisvirussubgroupJJ亚群禽白血病病毒ALV-KavianleukosisvirussubgroupKK亚群禽白血病病毒RSVroussarcomavirus劳斯肉瘤病毒LLlymphoidleukosis淋巴白血病LTRlongterminalrepeatsequence长末端重复序列gaggroupantigen群抗原polprotease/polymerase蛋白酶/核酸聚合酶envenvelopegene囊膜糖蛋白基因gp85glycoprotein85糖蛋白85gp37glycoprotein37糖蛋白37p27protein27衣壳蛋白SUsurfaceprotein外膜蛋白TMtransmembraneprotein穿膜蛋白CEFchickenembryofibroblast鸡胚成纤维细胞FITCfluoresceinisothiocyanate异硫氰酸荧光素indirectfluorescenceantibodyIFA间接免疫荧光分析assayenzymelinkedimmunosorbentELISA酶联免疫吸附反应assaymediantissuecultureinfectiveTCID50半数组织细胞感染量doseREVreticuloendotheliosisvirus禽网状内皮组织增生症病 毒MDVmarek’sdiseasevirus马立克氏病毒NDVnewcastlediseasevirus新城疫病毒H9-AIVavianinfluenzavirussubtypeH9H9亚型禽流感病毒PCRpolymerasechainreaction聚合酶链式反应reversetranscription-polymeraseRT-PCR反转录-聚合酶链式反应chainreactionPBSphosphate-buffersaline磷酸盐缓冲液SPFspecificpathogenfree无特定病原DMEMdulbeco'smodifiedeaglemedia极限必需培养基AZTAzidothymidine齐多夫定LAMLamivudine拉米夫定minminute分钟hhour小时dday天wweek周 目录中文摘要.....................................................................................................................................IAbstract...................................................................................................................................III1前言..........................................................................................................................................11.1禽白血病病毒的研究进展...................................................................................................11.1.1禽白血病病毒的分类地位................................................................................................21.1.2亚群分类............................................................................................................................21.1.3J亚群禽白血病病毒的形态学与理化特征.....................................................................31.1.3.1形态学特征.....................................................................................................................31.1.3.2理化特征.........................................................................................................................31.1.4J亚群禽白血病病毒的基因组结构及蛋白组成.............................................................41.1.4.1gag/pro基因及编码蛋白................................................................................................41.1.4.2pol基因及编码蛋白.......................................................................................................51.1.4.3env基因及编码蛋白......................................................................................................51.1.4.4UTR区............................................................................................................................51.1.4.5LTR区............................................................................................................................61.1.5J亚群禽白血病病毒的复制周期.....................................................................................61.1.6流行病学特点....................................................................................................................71.1.7J亚群禽白血病病毒的致病性研究.................................................................................81.1.8ALV-J的诊断....................................................................................................................81.1.9ALV-J的预防...................................................................................................................81.2禽网状内皮组织增生症（REV）的研究进展..................................................................91.2.1病原学................................................................................................................................91.2.1.1病毒分类及毒株分类.....................................................................................................91.2.1.2核酸及蛋白质组成.........................................................................................................91.2.1.3病毒复制.......................................................................................................................101.2.1.4病毒稳定性...................................................................................................................111.2.2流行病学..........................................................................................................................111.2.2.1水平传播途径...............................................................................................................11 1.2.2.2垂直传播途径...............................................................................................................121.2.2.3昆虫传播途径...............................................................................................................121.2.2.4疫苗污染途径...............................................................................................................121.2.3发病机理..........................................................................................................................131.2.4临床及病理变化..............................................................................................................131.2.4.1病理变化.......................................................................................................................131.2.4.2生长抑制综合征...........................................................................................................131.2.5诊断..................................................................................................................................141.2.5.1病毒分离及鉴定...........................................................................................................141.2.5.2血清学检测...................................................................................................................141.2.6预防和控制......................................................................................................................141.3艾滋病研究进展.................................................................................................................151.3.1病原学..............................................................................................................................151.3.1.1病毒分类及毒株分类...................................................................................................151.3.1.2病毒结构及核酸和蛋白质组成...................................................................................151.3.2病毒的复制......................................................................................................................161.3.3艾滋病的临床药物治疗..................................................................................................171.3.3.1药物作用靶点及作用原理...........................................................................................171.3.3.2临床治疗药物和治疗方案...........................................................................................181.3.4HIV逆转录酶及其抑制剂..............................................................................................191.3.4.1逆转录酶及临床应用...................................................................................................191.3.4.2核苷类逆转录酶抑制剂的作用机理...........................................................................191.3.4.3临床应用的HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）............................................191.3.4.4齐多夫定（AZT）.......................................................................................................201.3.4.5拉米夫定（LAM）......................................................................................................211.4本研究的目的和意义.........................................................................................................222材料与方法............................................................................................................................232.1试验材料.............................................................................................................................232.1.1毒株和细胞......................................................................................................................232.1.2试验动物..........................................................................................................................23 2.1.3主要试剂和试剂盒..........................................................................................................232.1.4实验主要使用的药物......................................................................................................242.2方法.....................................................................................................................................242.2.1不同药物浓度的配制方法..............................................................................................242.2.2连续传代法确定DF-1细胞复制无影响的药物浓度...................................................242.2.3CCK-8测定药物对DF-1细胞活性的影响...................................................................242.2.4不同药物浓度对ALV-J在DF-1细胞复制的抑制作用...............................................252.2.5Reed-Muench法方法测定TCID50................................................................................262.2.6NX0101株在药物选择压下的连续传代.......................................................................262.2.7NX0101株在药物选择压下的耐药性形成的验证.......................................................262.2.8不同药物浓度对海兰褐鸡生产性能的影响..................................................................272.2.9血凝血抑测定抗体滴度..................................................................................................272.2.10不同药物浓度对ALV-J在海兰褐鸡体内复制的抑制作用.......................................282.2.11不同药物浓度对REV在DF-1细胞上复制的抑制作用............................................282.2.12疫苗毒种中REV污染去除（洁净性）的检验..........................................................292.2.13药物干预后毒种接种SPF鸡的检验...........................................................................292.2.14ELLISA测定血清中REV抗体...................................................................................292.2.15间接免疫荧光实验：....................................................................................................303结果........................................................................................................................................323.1AZT对ALV-J在体内和体外的抑制作用........................................................................323.1.1不同AZT添加浓度对DF-1细胞复制的影响..............................................................323.1.2不同AZT添加浓度对DF-1细胞活性的影响..............................................................323.1.3不同AZT添加浓度对ALV-J在DF-1细胞复制的抑制作用.....................................333.1.4不同浓度AZT对海兰褐鸡生产性能的影响................................................................343.1.5不同药物浓度对NDV和AIV-H9免疫后抗体反应的影响........................................353.1.6不同剂量AZT对ALV-J在海兰褐鸡内复制的抑制作用...........................................353.2在药物选择压下ALV-J耐药毒株的形成........................................................................363.2.1第50代不同传代系耐药性形成的验证........................................................................363.3利用逆转录酶抑制剂类药物去除疫苗中的REV污染...................................................383.3.1不同浓度AZT和LAM对REV在细胞复制的抑制作用...........................................38 3.3.2AZT和LAM单独或联合应用去除疫苗毒种中REV污染........................................383.3.3IFA检测净化后疫苗毒种中REV.................................................................................393.3.4SPF鸡接种法检测净化后疫苗毒种中REV污染........................................................394讨论.......................................................................................................................................405结论.......................................................................................................................................43参考文献...................................................................................................................................44致谢...........................................................................................................................................50硕士期间发表的论文..............................................................................................................51 山东农业大学硕士学位论文中文摘要禽白血病病毒（ALV）、禽网状组织增生症病毒(REV)与人的艾滋病病毒（HIV）同属于反转录病毒，由于反转录病毒极易突变的特性，迄今为止，由此类病毒引起的疾病均没有有效的疫苗，但是针对艾滋病，目前已经研发出很多药物能够对病毒产生抑制作用而使疾病得到一定的控制。本研究室在禽白血病病毒没有有效疫苗和目前使用的很多弱毒疫苗都存在REV污染并无有效方法去除的现状的基础上，根据病毒具有相似性的原理，利用对艾滋病有抑制作用的逆转录酶抑制剂类药物，试图探索此类药物在辅助禽白血病病毒净化中的可行性和在去除疫苗毒种中REV污染的可操作性。1、不同药物及其组合对ALV和REV的体外抑制作用及其应用首先通过在培养液中添加不同药物浓度连续传代以及利用CCK-8测定细胞活性的方法，确定了培养液中添加不超过5ug/ml的药物浓度对于DF-1细胞的复制没有影响。针对ALV的实验证实，当在培养液中添加不同的药物浓度时，药物浓度与抗病毒作用呈现正相关性，即药物浓度越高，对病毒复制的抑制作用越高；在针对REV的证实，当在培养液中分别添加5ug/ml的AZT或LAM以及两者联合应用时均可以显著抑制REV在DF-1细胞上的复制，通过在新城疫弱毒疫苗中人为添加REV模拟AZT或LAM以及两者联合应用对疫苗毒种中REV污染的净化作用，结果显示经药物干预4代后即将REV去除，并且净化后毒种检验合格。本研究证实了AZT或LAM在体外对REV的抑制作用，并在人工模拟实验中成功净化了疫苗毒种中污染的REV。2、在药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生经细胞活性实验和对病毒的抑制作用实验选定3ug/ml的AZT药物浓度作为药物选择压传代的最适浓度，在6孔细胞板中分别设置3个用药组和3个不添加药物组，在细胞上连传50代后，将6个毒株进行定量，再以相同的病毒量接种细胞，分别在0ug/ml、1ug/ml、3ug/ml、5ug/ml的浓度下进行培养，通过测定各组的p27判断出在3ug/ml药物浓度下，连传50代出现了耐药毒株。3、不同药物及其组合对ALV-J在海兰褐鸡体内复制的抑制作用通过给不同组别的鸡分别注射不同剂量的AZT后通过每周称重和检测对NDV和AIV-H9的抗体评估不同剂量AZT对鸡体重和免疫功能的影响，结果显示与对照组相比，体重和抗体水平差异均不显著。在人工攻毒ALV-J后，通过每周采集鸡抗凝血检I 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生测病毒血症阳性率，结果表明与不使用药物的对照组的持续病毒血症相比，10mg药物组的病毒血症在前6周没有出现，5mg药物组病毒血症在第7周时完全消失。综上所述，本研究不仅证实了AZT和LAM以及两种药物的联合用药对鸡反转录病毒的抑制作用，并且成功应用于降低ALV感染水平和去除疫苗中的REV污染，还构建了对AZT产生耐药性的ALV-J毒株，为进一步研究反转录病毒的耐药性产生的分子机制提供了良好的实验模型。关键词：禽白血病病毒；逆转录酶抑制剂类药物；齐多夫定；拉米夫定；网状内皮组织增生症病毒II 山东农业大学硕士学位论文AbstractAvianleukosisvirus、reticuloendotheliosisvirusandhumanimmunodeficiencyvirusbelongtoretrovirus.Becauseofthemutationoftheretrovirus,sofar,thereisnoeffectivevaccinethatcanpreventthediseasecausingbythesevirus.ButtoAIDS,therearesomedrugsthathavebeenresearchedtotreatingthediseasewhichcanmakethediseasetobecontrol.InthebasicoflackingeffectivevaccineofALVandsomevaccinebeingpollutedbyREVandhavingnoideatodislodgingatpresent,ourlabbaseonthesimilarityofthesevirus,usethedrugsNRTLsofusingfortreatingAIDStotryingtoexploringtheviabilityinassistingthepurificationofAvianleukosisandthemaneuverabilityindislodgingthepollutioninthevaccine.1InhibitionandapplicationofALVandREVbydifferentdrugsandcombinationFirstly,weusedthemethodofaddingdifferentdrugconcentrationtocontinuingpassageandusingCCK-8tomeasuringtheactivityofcelltodeterminethatthereisnoinfluencetothepassageofDF-1cellwhenthedrug(AZT)concentrationisatmost5ug/ml.IntheexperimentaboutALV,whenweaddeddifferentconcentrationofdrugintoDMEM,theconcentrationofdrughadpositiveassociatedwithantiviraleffect.Itwassaid,thehigherthedrugconcentrationwas,thebettertheantiviraleffectwas.IntheexperimentaboutREV,whenweusedAZT(5ug/ml)、LAM(5ug/ml)andcombined(3ug/ml+3ug/ml)thatcanmaketheinhibitionofREVinthecell.ToaddingREVtotheNDVpost-vaccinationartificially,wefoundthatAZT(5ug/ml)、LAM(5ug/ml)andcombined(3ug/ml+3ug/ml)candislodgetheREVpollutioninthevaccineafter4passages.ThisstudyaffirmedtheinhibitionofREVbyAZTandLAMinvitroanddislodgedtheREVpollutioninthevaccineonmanualsimulationsuccessfully.2Theappearingofdrug-resistanceALVstraininthepressureofthedrugBasingontheaforementionedexperiment,weselected3ug/mlasthebestconcentrationofthedrugpressuretopassagethecell.Inthe6holesofplate,weset3holestousingdrugand3holestocontrol.After50generation,wecalculatedthequantityofeverystrainandaddedthesamequantityofvirustothecellindifferentdrugconcentrationsof0ug/ml、1ug/ml、3ug/mland5ug/ml.Thenwetestedthep27ofeverygroupwhichcanconfirmtheappearingofdrug-resistanceALVstrain.III 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生3InhibitionofALV-JinHyline-browerchickensbydifferentdrugsandcombinationAfterinjectingdifferentdosagetodifferentgroupsofchickens,wetestedweightandtheantibodyofNDVandAIV-H9toassesstheinfluenceofweightandimmunologicfunctionofdifferentdosage.Contrastingwithcontrol,weightandantibodylevelhadnotobviousdifference.AfterweinjectedALV-Jtothechickens,wecollectedanti-freezingbloodtotestthepositiverateofviremiaeveryweek.Intheresult,thecontrolwithoutdrughadcontinuous,thegroupwithof10mgdosagehadnoin6weekandtheviremiacompletelydisappearedafter7weekinthegroupwithof5mgdosage.Basedontheabove,thestudynotonlyconfirmedthatusingAZTandLAMandthecombinationhadinhibitionofretrovirusofchickenandreducingtheinfectionlevelofALVanddislodgingthepollutionofREVinthevaccine,butalsoestablishedthestrainofALV-JtoAZTwhichwouldofferabetterexperimentalmodelformoreresearchontheproduceofthemolecularmechanismofthedrugresistance.Keywords:Avianleukosisvirus;NRTLs；Zidovudine(AZT)；Lamivudine(LAM)；ReticuloendotheliosisvirusIV 山东农业大学硕士学位论文1前言1.1禽白血病病毒的研究进展我国家禽的存栏数量和相关禽产品的总量一直居于世界领先地位，养禽业的规模化和集约化程度也是越来越高，禽类相关的疾病也趋向多样化和复杂化。在常见的禽类疫病中，免疫抑制性病毒造成的感染在我国很多鸡群中都有发生，给养禽业的生产带来很大的威胁，由此造成的经济上的损失将会很大。家禽肿瘤性疾病的致病病原种类繁多，在这之中，禽白血病病毒(Avianleukosisvirus.ALV)尤其是最近几年J亚群禽白血病病毒(ALVSubgroupJ，ALV-J)给我国肉鸡和蛋鸡养殖业造成了巨大的危害(Kimetal.,2004;Payneetal.,2012a;Zhangetal.,2011b;崔治中,2012)。禽白血病是由禽白血病/肉瘤病毒群中的病毒引起的禽类多种肿瘤性疾病的总称，目前已呈世界范围性的分布(Chengetal.,2010;Cuietal.,2014;Furukawaetal.,2014;Gaoetal.,2012a;Gaoetal.,2010;Kimetal.,2004;Panetal.,2012;Payneetal.,2012a;Stepanetsetal.,2003;Zhangetal.,2011b;杜岩等,2000)。这种病不仅能够引起感染该病的禽类的死亡、淘汰导致多个组织的肿瘤的形成，还会造成禽只的生产性能明显下降，同时造成疫苗免疫效应失败，进而影响到其它禽类相关的产品的生产与研究。禽白血病在鸡上还能导致许多种具有传染性的良性或者恶性肿瘤。其在临床上的表现形式多种多样，其中包括了淋巴细胞白血病（LL）、成红细胞白血病、成髓细胞白血病、骨细胞瘤、肾母细胞瘤、血管瘤、骨石症、骨髓细胞瘤、纤维瘤和纤维肉瘤等等。在2000年以前，禽白血病尽管在我国有发生的情况，但是并没有受到广泛的关注。但是进入21世纪以来，由于国内禽白血病的发病情况越来越常见，防控难度也越来越大，并且甚至有爆发大流行的趋势。尤其是J亚群禽白血病不再仅仅在肉鸡上发病(杜岩等,2000)，在蛋鸡(Gaoetal.,2012b;Gaoetal.,2010)甚至中国的纯地方品系鸡中(Dongetal.,2015;Sunetal.,2007b)也已经有病例出现，并在一定的地区呈地方的流行趋势，这就使得禽白血病的防制与净化变得越来越困难。鉴于禽白血病会造成如此巨大的经济上的损失，我国政府已经把它列入二类动物疫病的行列之中。在发布的“国家中长期动物疫病防治规划(2012-2020年)”中已经把禽白血病作为16种优先防治的国内动物疫病之一。国内的一些大型的种鸡场也已经开始进行禽白血病的相关净化工作。同时禽白血病的防治工作也已经成为了科研工作者们和养殖业从业人员以及政府相关部门关注的重点。因此，大力强化禽白血病方面的1 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生研究工作对于提高我国动物疫病的防控水平、促进我国家禽养殖业的健康持续发展具有重大意义。1.1.1禽白血病病毒的分类地位如图1-1所示，根据国际病毒分类委员会公布的(InternationalCommitteeforTaxonomyofvirus,ICTV)第9次分类报告(2009年)的2014年公布版本，所有登录的ALV病毒株属于反录病毒科(Retroviride)、正反录病毒亚科(Orthoretrovirinae)、甲型反录病毒属(Alpharetrovirus)，同时ALV也是甲型反录病毒属的代表种。之前曾经把ALV归入到反录病毒科、肿瘤病毒亚科，甲型反录病毒属的曾用名是禽C型反录病毒属，禽白血病病毒以前也叫C型肿瘤病毒。图1禽白血病病毒的分类地位Fig.1Taxonomicstatusofavianleukosisvirus(引自http://www.ictvonline.org/virusTaxonomy.asp?version=2014)1.1.2亚群分类禽白血病/肉瘤病毒可划分为A、B、C、D、E、F、G、H、I、J共10个亚群。自然发生感染鸡群的只有A、B、C、D、E和J六个亚群。在这六个亚群中，相对来说，J亚群与其它的亚群之间的抗原性存在较大差异，而且J亚群的致病性和传染性也是最强的。而E亚群对鸡一般是不致病的或者有很弱烦人致病性。除此之外，还有一些毒株的gp85序列与已知的A、B、C、D、E、J亚群有较大的区别，属于一个新出现的K亚群(王鑫,2012;Cuietal.,2014)。2 山东农业大学硕士学位论文1.1.3J亚群禽白血病病毒的形态学与理化特征1.1.3.1形态学特征J亚群禽白血病病毒是近似球形的病毒粒子，直径约80～100nm，衣壳呈20面体对称。病毒粒子包括外部的囊膜和内部的致密核芯。核芯直径大约45nm，位于病毒粒子的中间位置，由二倍体RNA、核衣壳、反转录酶、整合酶和蛋白酶五部分组成。病毒囊膜的外面有放射状的凸起，直径大约8nm，病毒粒子会以出芽的方式从细胞膜中释放出来(图2)。图2禽白血病病毒粒子从细胞膜出芽及其病毒粒子形态Fig.2ThemorphologyandbuddingofAvianleukosisvirus(ALV)A：禽白血病病毒粒子从细胞膜出芽;B：禽白血病病毒粒子的形态A:ALVbudding;B:ALVmorphology（Fenner'sVeterinaryVirology,FourthEdition）1.1.3.2理化特征ALV-J对热具有不稳定性，高温条件下会很快失去活性，但在-60℃的低温条件下可以维持病毒的感染力达数年，并且多次冻融将会导致病毒发生裂解，从而使病毒的特异性抗原释放出来，因此在病毒的日常保存工作中，温度是决定性因素。同时PH值对病毒也有影响，在PH为5～9的状态下有稳定性质，超出这一范围时其生存力将显著降低。由于病毒的囊膜含有脂类，所以乙醚、甲醛、脂溶剂（如氯仿）将会破坏病毒的囊膜进而使病毒的感染性被破坏。十二烷基硫酸钠（SDS）等去污剂类还可以将病毒进行裂解，使病毒释放核心蛋白和RNA(殷震,1997)。3 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生1.1.4J亚群禽白血病病毒的基因组结构及蛋白组成J亚群禽白血病病毒与其他亚群的ALV一样，基因组是一个单股、正链、线性RNA(ssRNA)的二聚体，主要为60~70SRNA和4~5SRNA。70SRNA在加热条件下可以变成两个约38S、3.3MD的RNA分子，是病毒的基因组。4-5SRNA主要为病毒宿主的tRNA。两条RNA通过5’端的氢键连接成70S的RNA，这两个RNA分子间的相互作用可能是在反转录的过程中起到一定的调节作用。每一段RNA大约的长度是8kb，同时具有5’端的帽子结构和3’端的多聚A(Yooetal.,1996)。ALV-J病毒的基因组包括编码区和非编码区两个部分。如图1-3所示，编码区包含gag/pro,pol和env基因，两端是非编码区UTR。肉瘤病毒等急性转化病毒还会有一些与致瘤转化相关的序列存在，如肉瘤病毒的结构基因表示为gag-pol-env-src。禽白血病病毒的RNA不是作为mRNA直接进行表达，而是会在宿主的细胞内经过反转录过程成为cDNA后，再将序列插入到宿主细胞的基因组序列中，并以前病毒(provirus)的形式存在，然后再从cDNA转录出病毒的基因组RNA。前病毒DNA的基因组序列与病毒RNA的相同，只在两端延长成U3-R-U5重复序列，称为长末端重复序列(longterminalrepeat，LTR)，这一序列与病毒RNA的复制和翻译相关。图3ALV前病毒的基因组结构图Fig.3GenomeStructureofALVprovirusgenomestructure1.1.4.1gag/pro基因及编码蛋白gag/pro基因的长度为2100bp左右，序列具有高度保守性。由gag/pro基因编码产生的初始产物是一个大的前体蛋白Pr76，该蛋白会在p15蛋白整合酶（PR）的作用下，被加工成3～6种非糖基化蛋白，分别是基质蛋白p19(MA)，衣壳蛋白p27(CA)，核衣壳蛋白p12(NC)，蛋白酶p15(PR)和一些多肽。p27是鉴别ALV的特异性抗原，4 山东农业大学硕士学位论文也是不同的亚群之间一段具有高度保守性的基因片段，p12蛋白主要参与RNA的加工和包装，p15则是用来剪切前体蛋白。1.1.4.2pol基因及编码蛋白pol基因的长度为2600bp左右，该基因的主要作用是帮助病毒基因组插入宿主细胞染色体基因组。其编码的蛋白产物也是一个较大的前体蛋白，蛋白酶p15剪切产生成两个酶蛋白，一个是反转录酶蛋白p68(RT)另一个是整合酶蛋白p32(IN)。反转录酶蛋白RT具有三种不同的活性，一种是依赖RNA的聚合酶活性，一种是依赖DNA的聚合酶活性以及降解DNA-RNA杂交链中RNA链的核糖核酸酶H活性。如果病毒缺少这种酶，其生命周期将会不完整。整合酶IN能够把前病毒DNA整合进宿主的基因组中，这是病毒基因组插入宿主细胞染色体基因组的关键所在。1.1.4.3env基因及编码蛋白env基因主要决定了病毒的抗原性、组织亲嗜性以及毒力，它是病毒致肿瘤的最关键的基因。不同的ALV-J毒株的env基因同源性会有很大的差异。env基因编码的囊膜糖蛋白由2条肽链组成，由gp37基因编码的为跨膜蛋白(Transmembraneprotein,TM)；由gp85基因编码表面蛋白或膜表面糖蛋白亚单位(Surfaceprotein,SU)，外观呈球形。他们能够形成二聚体，叫做病毒糖蛋白(VGP)。1.1.4.4UTR区5’R、U5、PBS、Leader、rTM、DR-1、E元件、U3和3’R组成了ALV的非编码区。ALV的5'UTR区由末端重复序列(R)、5’端独特区(5'uniqueregion,U5)和前导序列或先导序列(leadersequence)组成，先导序列由三个片段组成，即引物结合区(primerbindingsite,PBS)、剪辑供体位点(splicedonorsite)和打包序列(packagingsequences)。ALV-J的3'UTR区在不同毒株之间核苷酸的数目有很大的差别，由末端重复序列(R)、3’端独特区(3’uniqueregion,U3)、DRl区和E元件组成。其中5’R、PBS和3’R在反转录过程中发挥着十分重要的作用。5 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生1.1.4.5LTR区ALV-J前病毒基因组的两末端具有两段结构完全相同的长末端重复序列，LTR由三部分组成：3’端独特区(U3)、重复区(R)以及5’端独特区(U5)，主要功能是病毒复制、转译、RNA加工以及将病毒整合于宿主基因组。ALV-J的LTR约325bp，其中U3约224bp,R为21bp，U5约80bp。1.1.5J亚群禽白血病病毒的复制周期由于J亚群禽白血病病毒是一种反转录病毒，所以在复制的过程中要经历反转录过程，还有吸附、穿入与脱壳、生物合成、组装和释放等步骤。病毒复制的第一步为ALV-J的SU蛋白与其受体的结合。结合后，TM蛋白的构象将会发生变化，这会导致病毒与细胞发生膜的融合，然后带有核衣壳的病毒进入细胞内，在酶的帮助下开始一系列步骤。在胞浆中，病毒一旦感染了宿主细胞，便会立刻发生反转录，ALV-J基因组RNA反转录为双链的前病毒DNA，前病毒DNA在进入到胞核以后在整合酶的作用下随机整合进宿主的基因组中。由前病毒DNA转录后得到的病毒RNA同时进行剪切，剪切过的RNA和未剪切过的RNA被运送到细胞质中，就此完成病毒蛋白的表达以及病毒粒子的组装过程，装配后的病毒粒子开始出芽产生成熟的子代病毒。ALV完整的复制过程，如图1-7所示。6 山东农业大学硕士学位论文图4ALV-J生命周期Fig.4ThelifecycleofALV-J1.1.6流行病学特点自1989年初次发现，已经给全世界的养鸡业造成了很大的损失。到目前为止，在世界上的很多国家以及地区都已陆续发现(Fadlyetal.,1999;Sungetal.,2002;Thapaetal.,2004;崔治中,2003;杜岩等,2000)，病毒主要引起的是骨髓样肿瘤和急性肿瘤，在4-5周龄的鸡群中也时有发生(Payneetal.,1993)。ALV-J的主要发病时间为25-55周龄的肉用型鸡只，病理学变化表现为发生髓样细胞瘤和其它的恶性肿瘤等，在病毒致死的高峰期，每月的致死率大概为6%(Payneetal.,1997)。发生在中国的ALV-J与世界其他发病地区相比主要也是引起白羽肉鸡的髓细胞组织增生(Cuietal.,2003;杜岩等,2000)。值得注意的是，在最近的几年里，ALV-J在商品代肉鸡、蛋鸡以及一些地方品系鸡群中发病的例子有所增多(成子强等,2005;徐镔蕊等,2002)。ALV-J主要以两种方式传播：垂直传播方式和水平传播方式。垂直传播方式主要指病毒通过鸡胚向子代传播的方式：病毒从祖代鸡场到父母代，再到商品代鸡群，逐渐传播同时呈现随代放大的去世后。一旦经垂直传播而携带有病毒的小鸡在出壳后直接与其他未感染的小鸡进行接触，很可能引起大范围的水平感染(Fadlyetal.,1999;Witteretal.,2000)。2000年，Witter等人的研究结果显示，商品代肉用型种鸡刚孵化出壳时有9%的病毒阳性率，但随着时间的增加，在4周龄，阳性检出率会达88%；同7 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生时，约有一大半的鸡会持续病毒血症，25%的鸡可以将病毒垂直传播给下一代。另外，由于鸡群直接接触而导致ALV-J传播也十分重要。还有一种传播方式是鸡群接触已污染的粪便、饲料和仪器设备，以及相关工作人员。1.1.7J亚群禽白血病病毒的致病性研究ALV-J对骨髓源性的细胞具有一定亲嗜性，正因如此在感染病毒后就会主要引起肉鸡的髓细胞肿瘤，这是与其他的亚群主要引起淋巴细胞肿瘤的不同之处(Baietal.,1995)。经ALV-J感染后，主要导致髓细胞发生急性转化，从而诱发骨髓样白血病。与其它外源性ALV的相同点是，ALV-J也不存在致肿瘤基因，插入性的突变激活了宿主细胞的原癌基因才是肿瘤发生的原因。诱导发生肿瘤的能力在不同的品系鸡群中存在很大的差异。1.1.8ALV-J的诊断实验室的检测的方法有：血清学的检测、病毒的分离与鉴定、病理学检查以及病毒核酸检测技术。血清学检测一般采用抗体检测试剂盒的方法。病毒的分离鉴定，一般操作为把研磨好的病料或血清直接接种在鸡胚成纤维细胞(CEF)上，然后盲传3代后，再采用IFA或ELISA抗原检测试剂盒等来进一步测定病料和血清中的ALV-J。同时，病毒核酸检测技术也逐渐成熟，主要方法包括斑点杂交法和PCR检测技术。用PCR检测一般是通过对env基因进行扩增然后把产物常规测序，然后将测定的序列与已知序列进行比较的方式来减少假阳性的错误判断。1.1.9ALV-J的预防到目前为止，用来预防ALV-J的感染暂时还没有有效的商品化疫苗。有报道称，通过表达ALV-J的重组囊膜糖蛋白可以作为一种预防水平传播的疫苗(Leeetal.,2000;Venugopaletal.,1997)。但是由于先天性感染的雏鸡是ALV-J传播的主要传染源，这类鸡会拥有比较强大的免疫耐受性，因此即便是在使用了上述疫苗的条件下，也不能够对鸡产生较高水平的免疫保护力。目前为止，暂未找到治疗已发生ALV-J鸡群的合理有效的措施。目前国内外通用的防控和除去ALV-J的方法是对种鸡群进行净化。主要有两种方式：一种是通过对母鸡进行检测，挑选没有被感染ALV-J的健康鸡。另一种是分别对种蛋、雏鸡和母鸡进行净化(Okazakietal.,1980)。虽然这两种方式会耗资甚巨但已有成效，我们也应该看到，这项净化工作不可能一蹴而就，而是一个需要持续进行的过8 山东农业大学硕士学位论文程。对于目前中国的商品代鸡群和地方品系鸡种来说，全面实施净化是非常困难的，也是不可能完全实现的。因此，积极寻找低成本高成效的净化方法是我们进行研究的主要方向和探索的主要目的。1.2禽网状内皮组织增生症（REV）的研究进展禽网状内皮组织增生症(Reticuloendotheliosis,RE)是指由网状内皮组织增生症病毒(Reticuloendotheliosisvirus,REV)引起的一种传染性肿瘤疾病，感染之后临床症状主要表现为病鸡的生长抑制、瘦弱以及贫血等。1958年，Robinson等人(Robinsonetal.,1974)在火鸡上分离到第一株REV分离株T株，病毒能够引起内脏上发生淋巴肿瘤。之后Theilen等人把该REV分离株T株分别接种于多种禽类体内后进行研究证实了该病毒可以产生急性肿瘤。1.2.1病原学1.2.1.1病毒分类及毒株分类REV属于反转录病毒科、γ反转录病毒属(Coffin,1982)，是一种具有单一血清型(Chenetal.,1987)的病毒。对于完整型的病毒毒株来说，他们拥有类似的结构和特性(Baueretal.,1980)，但是在致病性方面，各毒株却是不同的(Purchaseetal.,1973)。崔治中等的研究结果证实存在抗原性上的差异，他成功制备出了针对REV-T株的单克隆抗体(Cuietal.,1986)，并确定了病毒上三个不同的表位(A、B、C)。Chen等把26株不同的REV分离株根据他们与单克隆抗体反应的不同以及相应的中和试验结果分为了三个亚型(Chenetal.,1987)。这三种亚型分别含有不同的表位，I亚型有3个表位，II亚型只有1个B表位，而III亚型有2个表位A、B。1.2.1.2核酸及蛋白质组成REV是单股正链RNA，基因组的长度约为9kb。病毒的很多结构与禽白血病病毒，十分类似，其每一个病毒粒子中含有2条完全相同的RNA分子在5端以非共价键连接在一起。REV的编码基因主要有：衣壳蛋白基因(gag)、聚合酶基因(pol)和囊膜蛋白，基因(env)，他们在基因组上的排列顺序为5-gag-pol-env。除这三种编码基因外，在基，，因组的两端还分别包含非编码区，即一段具有重复性的序列及5端的独特序列或3独特序列。但是，有些急性致肿瘤的毒株的基因组只有7kb左右，在这样的毒株中部分gag基因、整个pol基因和部分env基因被肿瘤基因v-rel（大小约为0.8-1.5kb）取代，成为复制缺陷型的病毒毒株。9 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生编码基因主要编码以下三种酶类蛋白：蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）和整合酶（IN）。蛋白酶（PR）的主要功能是水解前体蛋白并使之变为成熟蛋白。蛋白酶PR是来源于Gag-Pro蛋白前体；反转录酶和整合酶的来源相同，是pol基因所编码的初始蛋白前体。上述前体蛋白在水解后，将形成两种酶，羧基端为整合酶（RT），氨基端为逆转录酶（IN）。逆转录酶（RT）具有多种酶的活性，由于逆转录酶（RT）的氨基酸序列高度保守，通常可以作为判断不同反转录病毒是否具有亲缘关系的主要依据。其主要功能有：反转录酶活性：反转录酶可特异地降解DNA-RNA嵌合体分子中的RNA链，反转录酶的聚合酶活性和RnaseH活性区域相互独立，功能区中具有多聚酶活性的长度占整个酶分子氨基端的约2/3；聚合酶活性：可以以DNA/RNA为模板合成相应DNA新链，但是却必须借助DNA或RNA引物才能进行合成。RT过程中发挥其聚合酶最适活性的适宜浓度为3mM，同时还要有辅助因子Mn2+的参与，而禽白血病毒聚合酶的最适浓度是10mM。整合酶：其作用主要是将前病毒cDNA基因组整合进宿主细胞的基因组中。1.2.1.3病毒复制完全复制型的REV复制周期包括吸附、穿入、反转录、整合、转录、翻译和装配释放：1)吸附：病毒通过其表面的囊膜蛋白与宿主细胞的细胞膜受体发生相互作用，并吸附在宿主细胞的细胞膜上。2)穿入：病毒囊膜蛋白与宿主细胞的细胞膜融合，病毒的核衣壳蛋白释放到宿主细胞的细胞质中。在穿入过程中，通过病毒基因组RNA的衣壳蛋白，核衣壳蛋白仍然围绕着核心复合体，未发生降解。这种复合体可以进入细胞质，它含有多种复合酶发挥反转录等功能。3)反转录：在病毒的核心复合体中，tRNA引物以病毒的基因组RNA为模板合成一条cDNA链，然后在RnaseH活性的作用下生成线性的前病毒cDNA。4)整合：前病毒cDNA进入到宿主细胞的细胞核内，在连接酶作用下形成两种不同的的前病毒cDNA形式：一种是比正常基因组略大的、携带有病毒基因组全套序列和双拷贝的长末端重复序列（LTR）的环状cDNA；另外一种是携带有有病毒基因全套10 山东农业大学硕士学位论文序列和一个LTR拷贝的短环状的cDNA。环状前病毒cDNA在整合酶作用下，随机整合到宿主细胞染色体上，并稳定存在宿主基因组之中。5)转录：前病毒cDNA利用宿主细胞的RNA聚合酶II转录产生病毒RNA。一部分病毒RNA会加工成为mRNA并回到细胞质中，指导病毒结构蛋白的翻译和合成。另一部分全长病毒RNA则储存、聚集，作为病毒的RNA装载进入子代病毒之中。6)翻译：新生成的病毒mRNA在细胞浆内指导各种蛋白质的合成。其中结构蛋白的前提蛋白多以套式结构生成，随后再通过蛋白酶降解产生成熟的蛋白质。7)装配和释放：病毒的结构蛋白和基因组达到一定浓度后，统一集中到宿主细胞的细胞膜表面。病毒的囊膜蛋白插到细胞膜中，并通过RNA和衣壳蛋白形成的病毒粒子包裹起来，并以出芽方式脱离宿主细胞。但是，病毒的衣壳蛋白还需要进一步的加工后，方可形成成熟病毒。1.2.1.4病毒稳定性从被感染鸡的肝脏，肾脏等组织或已感染细胞的培养液中均可得到游离的REV病毒，在-70℃的条件下可以长期保存且保持活性。4℃条件下病毒具有较强的稳定性，但将病毒置于37℃条件下，其感染性会随时间的延长而逐渐降低，在1小时左右的时间病毒的感染性基本完全丧失，且几乎无感染性(Campbelletal.,1971)。经过特殊处理之后的被感染细胞可以在-196℃条件下长久保存。1.2.2流行病学鸡、火鸡、鸭、鹅和日本鹌鹑等多种禽类都是REV的宿主，其中火鸡是最容易被感染的。正因如此鸡和火鸡经常作为实验对象应用。在感染REV以后小鸡能够引发严重的免疫抑制或免疫耐受。但是随着鸡的生长，免疫功能会逐渐完善，这就会使在病毒感染之后一般不会出现或者只是出现短暂性的病毒血症。REV既可以水平传播、垂直传播，同时也可以通过昆虫和污染的疫苗两种途径进行传播。1.2.2.1水平传播途径REV能够通过直接接触的方式而进行传播。当鸡只的抗体检测为阳性时，可以在泄殖腔棉拭子和其它的一些体液或垫料中检测到病毒。病毒的水平传播能力与宿主的类别和病毒本身有很大的关系，只有与火鸡直接接触后感染REV会出现临床症状，通过与其他宿主直接接触后感染一般不会出现临床症状。11 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生1.2.2.2垂直传播途径在鸡和火鸡中能够发生垂直传播的现象，但传播效率一般较低。但是由于垂直传播，REV不仅会在同一种群中随着传代而传播，而且也会随着种蛋或雏鸡的调运而向其他鸡群传播，垂直传播与水平传播的结合将会导致病毒的大范围传播。1.2.2.3昆虫传播途径由于昆虫的传播而引起发病的报道也时有出现，Motha等人(Mothaetal.,1984)从与感染REV的鸡接触过的蚊子中分离到了REV，并且证明了的当环缘库蚊叮咬了已感染鸡群后再与健康鸡群直接接触，能够产生较为明显的感染性。在2006年，孟姗姗等也成功地从蚊子体内分离到REV病毒。由蚊子叮咬所造成的传播正好能够给不同季节之间感染率的差异做出很好的解释(Davidsonetal.,1996)。1.2.2.4疫苗污染途径REV污染疫苗是因为游离的病毒能够污染制备病毒疫苗的种毒，现在最经常发生的是禽痘疫苗和MDV疫苗的污染，因为疫苗污染而造成的REV的传播给养鸡业带来了巨大的损失(Jacksonetal.,1977)。实验室的相关研究发现，当将REV感染的细胞作为载体，然后将MDV接种到该细胞上进行连续传代时，REV的LTR序列将能够整合到MDV基因组的某些位点上(Isfortetal.,1992;Jonesetal.,1993)。Davidson等人于2001年运用HotSpot-PCR的方法，将从病料中得到的MDV片段作为模板，扩增到了REV的LTR片段。张志(张志等,2004a)等于2004年在我国分离到了一株包含有REV片段的MDV的野毒株。另外，关于REV的部分片段整合进FPV的报道同样也有很多，美国的Singh等人(Singhetal.,2000)于2000年分离到一株FPV毒株，该毒株几乎整合了REV全部完整的前病毒基因组。在中国，也同样有一些研究报道是关于REV的基因片段整合进FPV的(丁家波等,2004;于立娟等,2006)。疫苗污染是我国鸡群中REV广泛传播的主要原因在我国鸡群中应用的一些弱毒疫苗，特别是在雏鸡出壳后不久或几日龄内应用的马立克氏疫苗或禽痘疫苗，被REV污染的问题或纠纷时而发生。这显然与REV感染的细胞通常不发生细胞病变且对REV的检测技术不成熟相关。而且，我国注册的疫苗企业有几十家，甚至可能还有一些未经注册的企业也在生产和销售某些相关的弱毒疫苗，兽医主管部门很难对市场上所用的疫苗都实施严格的检测。因此，在过去二十年中，常常发生鸡群由于应用了REV污染弱毒疫苗带来的经济纠纷。12 山东农业大学硕士学位论文1.2.3发病机理REV的发病机理现在还未有明确的定论，甚至病毒的发病机理在不同的毒株之间经常也是不一样的，例如完全复制型的病毒通常在鸡体内先引发非肿瘤性的病变，到后来才会出现淋巴瘤；而缺陷型T株的发病机理在于诱发急性肿瘤的产生。不同的REV毒株，在感染的过程中转化的细胞不同，如不成熟的淋巴细胞主要是表达B细胞的，其就是REV-T株转化的靶细胞，这能够给当除去鸡体的腔上囊之后，REV-CS引发的淋巴肿瘤现象显著降低的现象做出解释。IgM阳性的细胞是REV-T株和REV-CS株的混合毒株的作用靶细胞；而REV-T株与REV-A株混合感染引发的肿瘤，T淋巴样细胞和髓样细胞是该毒株作用的靶细胞。当然，其它细胞参与细胞转化的过程也是有一定可能性的。REV感染会对细胞和体液免疫造成严重的免疫抑制，这将会导致机体对于其他各类病原微生物和抗原的免疫应答反应显著下降，最终致使机体的免疫系统都受到十分严重的影响。尤其是当REV感染雏鸡、雏鸭后，将会造成严重的免疫抑制，同时也能够影响NK细胞的细胞活性。1.2.4临床及病理变化REV的主要临床症状有：鸡只精神明显沉郁、身体瘦弱、生长抑制（又称矮小综合征）还有淋巴组织以及其他组织的慢性肿瘤等。REV-T株会引起急性网状细胞增生，但很少会表现特征性的临床症状，潜伏期短，病鸡死亡通常发生在感染后的6-21d，但是当将毒株接种新孵化出的小鸡时，其致死率能够达到100%(Calnek,1999)。1.2.4.1病理变化在解剖病鸡时可以观察到：肝脏发生肿大，脾脏发生肿大，有的出现灰白色的肿瘤结节；在鸡体的其他内脏如胰脏、心脏、肠道、肾脏、性腺以及肌肉组织中有时也会出现肿瘤；腔上囊有时会发生萎缩。特征性的组织学病理变化是网状细胞和间质细胞的浸润及增生，纤维增生偶有发生；还可能出现血液中的淋巴细胞数目变多而异嗜性白细胞数量降低。1.2.4.2生长抑制综合征当被完整型的REV感染后发生的生长抑制又称矮小综合症。主要表现是患病鸡只异常瘦小，羽毛蓬松凌乱。剖检观察时胸腺、腔上囊等免疫器官发育不良，严重者出现萎缩现象，同时腺胃、肠道还会有炎症的表现，肝脾肿胀，有些表现为局灶性的坏死；病理组织学检查可见外周神经内部有淋巴样细胞和网状细胞浸润，表现为外周神经水肿现象。13 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生1.2.5诊断对于是否感染REV的诊断既包括眼观病变和微观病变，也包括对REV病毒的检测，病毒抗原、前病毒cDNA和具有感染性的病毒等均有诊断的价值。1.2.5.1病毒分离及鉴定由于感染REV而出现的病毒血症通常是暂时性的，只有在发生了免疫抑制或在胚胎时期就被感染的情况下才会出现较高的病毒效价。病毒能够同时存活于多种病变的组织当中，我们通常采用血液中的白细胞和淋巴细胞作为病毒分离的材料。进行病毒分离时，直接将研磨好的病料或血清接种到鸡胚成纤维细胞(CEF)上，然后在细胞上盲传3代，然后采用多种方法测定病料和血清中的病毒，方法主要有显微镜下肉眼观察细胞病变、间接免疫荧光试验以及核酸检测方法斑点杂交试验(Ludfordetal.,1972)。1.2.5.2血清学检测血清学方面的检测方法有：间接免疫荧光试验(IFA)、病毒中和试验、琼脂扩散实验、酶联免疫吸附试验(ELISA)。免疫荧光试验(IFA)是利用REV单克隆抗体，这将能够大大提高抗原检测的特异性。而应用ELISA检测病毒时，蛋清的检测敏感性是最佳的，所以通过ELISA方法检测蛋清中的病毒是控制和监测鸡群是否感染REV的重要方法。1.2.6预防和控制到目前为止，还未出现用于预防REV的有效的商品化疫苗。之前的研究表明，用重组病毒免疫鸡群，对矮小综合征可以产生部分的保护力，比如Calvert等(Calvertetal.,1993)报道的重组禽痘病毒中有表达的REV-env基因，以及Barth等发现的由转染过QT35的鹌鹑细胞所出现的REV空病毒粒子。也有借用生产实践中用于控制ALV的净化的方法用来对REV感染进行防控，也就是说在完全隔离的条件下饲养子代鸡群，同时将具有传播病毒可能性的母鸡淘汰，这将能够减少REV的垂直传播。然而，因为REV的感染有普遍性以及传播途径的多种多样的特点，因此这种方案也并不是有效的最佳方案。为了尽量预防REV的感染，通常可以从以下几个方面着手减少感染：一是要严格保证用于疫苗生产的鸡胚的来源，从源头上杜绝受REV污染的弱毒疫苗的出现。二是通过降低禽痘病毒的感染，这将能够减少因为含有REV全基因组的天然重组FPV野毒株感染而引发的REV感染现象。三是积极研发预防REV的相关疫苗产品，通过疫苗保证种鸡能够在开产之前产生REV抗体，在垂直感染和早期感染层面上预防REV。14 山东农业大学硕士学位论文1.3艾滋病研究进展艾滋病(acquiredimmunodeficiencysyndrome,AIDS)是由人类免疫缺陷病毒(humanimmunodeficiencyvirus,HIV)引起的一种传染病,特征为HIV特异性地攻击辅助T淋巴细胞,继而使人体得免疫系统遭到破坏,最后将会导致各种各样的机会性感染以及相关肿瘤的发生。1.3.1病原学1.3.1.1病毒分类及毒株分类HIV属于逆转录病毒科、慢病毒属、灵长类慢病毒组之中的一个病毒种。根据基因学上的差异，HIV分为两个型（中国疾病预防控制中心.艾滋病临床治疗与护理培训教材.北京：北京大学医学出版社.2003.1~12）：HIV-1和HIV-2，两种型的氨基酸序列的同源性大约在40%~60%之间。在世界上广泛流行的是HIV-1，这一型的病毒被分为了3组（RobertsonDLetal.,2000）：M、N和O亚型组。是当今最主要的流行在世界各个地方的优势毒株。M亚型有11个亚型，分别用英文字母A~K表示，在这之中，主要的流行株是B亚型和C亚型两种。在今年又发现了许多的亚型之间的重组型。O亚型和M亚型一般很少见。有用A~F表示的6种，它们主要在非洲西部地区流行着。HIV-2的毒力相对较弱，一般表现为感染导致的病程较长，且病症较轻。1.3.1.2病毒结构及核酸和蛋白质组成HIV是直径约100-120nm的球形颗粒病毒，由两部分组成：一个是核心另一个是包膜。其中，核心主要包括两条单股RNA链、核心结构蛋白和病毒复制所必须的酶类，同时含有逆转录酶(RT,PS11P66)，整合酶(INT,P32)和蛋白酶(PI,P10)。核心外面是病毒衣壳蛋白(P24,P17)。病毒的最外层是包膜，包膜中嵌有gp120(外膜糖蛋白)和gp41(跨膜糖蛋白)这两种糖蛋白。其结构示意图如下:15 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生图5HIV结构示意图Fig.5thestructureoftheHIV1.3.2病毒的复制在如下图所示的HIV-的1复制周期中，HIV经外膜糖蛋白gp120与宿主细胞膜受体(包括CD4和辅助受体)结合，之后穿透细胞膜进入道细胞浆中。病毒会在细胞浆中脱壳后，接着在病毒逆转录酶的作用下，形成cDNA，在DNA聚合酶的作用之下形成双链DNA，最后再整合到宿主细胞染色体DNA中，成为前病毒DNA。紧接着利用宿主细胞中的各种酶，通过转录、翻译成无功能的大的聚合蛋白。这些聚合蛋白将会在HIV蛋白酶等的作用下裂解成为功能蛋白，经过一系列装配后，在以出芽方式从胞浆膜释放的时候，获得病毒体的包膜，最后形成成熟的病毒颗粒。图6HIV的复制周期Fig.6ThereplicationcycleofHIV16 山东农业大学硕士学位论文1.3.3艾滋病的临床药物治疗1.3.3.1药物作用靶点及作用原理当前在临床应用的药物主要是以下三类，药物作用靶点示意图如下:1.核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)2.非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)3.蛋白酶抑制剂(PI)图7各类药物作用靶点示意图Fig.7Thetargetsofmanykindsofdrug这三类抗病毒抑制剂的作用靶点各不相同:核苷类逆转录酶抑制剂的作用原理是这类抑制剂在被靶细胞的细胞酶进行磷酸化了以后,以三磷酸的存在形式与天然存在的三磷酸形成竞争,用这种方式参与到病毒DNA链的合成过程。因为该抑制剂是已经经过化学修饰过的,所以它们的参与将会最终使病毒DNA链合成造成提前中止而中断（SaundersJetal.,1995）;非核苷类的逆转录酶抑制剂是结构上多种多样的一类化合物,通常它们的作用原理就是通过一系列非竞争性的方式结合又或者接近病毒逆转录酶的活性位点,从而以此种方式抑制了病毒逆转录酶的活性（YoungSD.etal.,1993）;蛋白酶抑制剂是属肽的类似物,它们的作用原理是通过与病毒蛋白酶的活性位点进行结合从而抑制了酶的活性,使酶不能够把病毒合成的多聚前体蛋白来水解为病毒的各种结构蛋白和酶的组成部分而发挥作用（MillerMetal.,1989）。17 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生1.3.3.2临床治疗药物和治疗方案迄今为止,被FDA批准的临床上使用的抗HIV/AIDS药物有15种：表1常用药物种类及名称Table1Thekindsandnameofcommonlyuseddrug常用药物种类一般用名中文名Zidovudine(AZT)齐多夫定Didnnosine(ddI)去羟肌苷核苷类逆转录酶抑制剂Zalcitabine(ddC)（NRTI）Stavudine(d4T)司他夫定Lamivudine(LAM)拉米夫定Abacavir(1592U89)非核苷类逆转录酶抑制剂Nevirapine（B1-RG-587)奈韦拉平(NNRTI)Delavirdine(U-90152)Efavirenz(DMP-266)Saquinavir(Ro-32-8959)Ritonavir(ABT-538)蛋白酶抑制剂Indinavir(MK-639)(PI)Nelfinavir(AG-1343)Amprenavir(141W91)Lopinavir(ABT-378)1985年,第一个具有抗逆转录病毒作用的药物——齐多夫定（MitsuyaHetal.,1985）用于临床至今,人类抗逆转录病毒治疗的研究已经有了很大的发展。截止到目前,己经研制出包括核苷类逆转录酶抑制剂(NRTI)、非核苷类逆转录酶抑制剂(NNRTI)、蛋白酶抑制剂(PI)、整合酶抑制剂、融合抑制剂、CCR5拮抗剂等6大类数十种药物（GuidelinesfortheUseofAntiretroviralAgentsinHIV-1-InfectedAdultsandAdolescents）。治疗方案也从开始的单药治疗,发展到多药联合的高效抗逆转录病毒治疗(HighlyActiveAntiretroviralTherapy,HAART),提高了患者的生存质量,AIDS的发病率和死亡率也随之大大降低（BartlettJGetal.,2006）。HAART成为目前用于控制HIV感染的唯一有效的治疗方法。18 山东农业大学硕士学位论文1.3.4HIV逆转录酶及其抑制剂1.3.4.1逆转录酶及临床应用在病毒的一系列复制周期中，逆转录酶(RT)是依靠它的RNA/DNA依赖的DNA聚合酶活性和核糖核酸酶氢(RNaseH)活性，然后将原病毒的RNA转录成为双链的DNA，再经过整合酶的作用，将病毒DNA整合进宿主细胞的染色体中。因为RT在HIV-1生命周期中发挥重要作用，其成为了抗HIV/AIDS药物研发中重要的研究靶点。在当前临床上用于治疗艾滋病药物中有很大的一部分都属于HIV逆转录酶抑制剂类，这类药物是临床抗病毒高效治疗（HAAT）的一个重要的组成部分，在高效地控制HIV感染的病程方面，以及延长患者的生命和改善生存质量的方面发挥了很重要作用。但是因为病毒基因组的结构有广泛、快速变异及高度遗传异质性的特征，因此HIV-1RT将不能够避免地产生很严重的耐药性，再加上药物长期应用会带来很多毒副作用，这就使得高效、低毒并且不容易产生耐药的新型HIV-1RT抑制剂的研发十分紧急。1.3.4.2核苷类逆转录酶抑制剂的作用机理NRTIs本身是没有抗HIV活性的，在进入被感染的细胞之后，就必须在宿主酶(包括核苷激酶，核苷酸激酶，5′-核苷酸酶，核苷磷酸转移酶和其它的活化酶)的作用下，经过几步的磷酸化反应变成活性分子三磷酸化核苷才有抗HIV-1活性。其与内源性的dNTP产生竞争性，都作用在RT的底物活性部位，因为NRTI的结构与dNTP底物具有相似性，RT把NRTI错误的作为底物并将其融入到正在发生延长的DNA链中。因为NRTI的结构中并没有可以与下一个dNTP进行3′-5′相连的3′-羟基，所以一旦NRTI融合到DNA链中，它就会阻断DNA链的继续延长，因此抑制HIV的复制。1.3.4.3临床应用的HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）目前临床应用的HIV-1核苷类逆转录酶抑制剂（NRTIs）共有7种：即AZT、ddI、ddC、d4T、3TC、FTC、abacavir(ABC)；核苷类逆转录酶抑制剂的复合制剂3种：Combivir(AZT+3TC)，Epzicom(3TC+ABC)及Trizivir(AZT+3TC+ABC)(结构式见图8（SamuelRetal.,2006）。NRTI均为DNA合成天然底物的衍生物，由下图可以看到AZT及d4T是脱氧胸苷（T）的类似物；ddC，FTC及3TC是脱氧胞苷（C）的类19 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生似物，ddI及tenofovir是脱氧腺苷（A）的类似物，ABC为脱氧鸟苷（G）的类似物，上述药物都需要在细胞内经过不同的激酶逐步的转化为具有活性的三磷酸衍生物，之后才能发挥抑制HIV-1RT的作用。它们均是HIV-1逆转录酶底物的竞争性抑制剂，能够抑制RT活性，进而阻碍前病毒DNA的合成；并且因为在结构上3’端缺乏羟基，所以当结合到前病毒DNA链的3’末端时，不能再继续进行5’-3’磷酸二酯键的结合，从而终止了病毒DNA链的延长，由此产生了抑制HIV复制的作用。正是因为其与HIV-1RT的亲和力比与细胞内正常DNA聚合酶的亲和力强很多，才会具有较好的治疗效果。ONH2ONH2CH3CH3HNNHNNONONONONHOHOHOHOOOOOSN3AZTddCd4T3TCNH2ONHFNNNNHNONNNNNNH2HOHOHOOOOSddIabacavirFTC图8逆转录酶抑制剂的化学结构Fig.8ChenmicalstructureofNRTIs1.3.4.4齐多夫定（AZT）AZT以前是一种抗癌药，在上个世纪的60年代被证明了具有抗鼠逆转录酶的活性，能够在组织培养中抑制HIV复制，临床试验证明它能延缓艾滋病程，推迟机会性感染。1987年由英国葛兰素-威康(Glaxo—Wellcome)公司开发，美国FDA批准的第一个应用于市场上的治疗HIV感染的药物，同时是唯一被美国FDA批准的用来预防HIV-1在母婴间传播的药物（Hirsch,M.S.,1998）。因为AZT与脱氧胸腺嘧啶核苷酸（T）很相似,逆转录酶也错将其利用,但因其脱氧核糖的第3位缺少羟基,不能与另一核糖核苷酸上的第5’端的羟基与磷酸酯化相连,因此不能够形成3,5-磷酸二酯键，DNA链的编码被中断了,因此阻止了艾滋病毒的复制。20 山东农业大学硕士学位论文图9胸腺嘧啶脱氧核苷分子式图10叠氮胸苷（AZT）分子式Fig.9ThemolecularformulaofTFig.10ThemolecularformulaofAZT图11AZT作用机理Fig.11Themechanismofaction1.3.4.5拉米夫定（LAM）LAM是于1995年加拿大的BiochemPharma公司开发的在美国与英国的上市产品。其具有很强的抑制HIV-1逆转录酶的活性，如果单独用它治疗HIV-1感染者，可使病毒在1周内载量下降到10%～1%。对细胞有较小的毒性，口服能够迅速吸收，其与AZT、ddI、奈韦拉平、沙奎那韦、司他夫定、地拉韦定等药物具有协同抗HIV-1的作用。并且其多与AZT进行联合用药使用，具有较好的耐受性。该药物抗病毒的作用机理：药物进入细胞后，被磷酸化为有活性的三磷酸拉米夫定，由于LAM的分子结构与脱氧胞嘧啶核苷酸结构很相似，逆转录酶错将其利用，将其误认为是脱氧胞嘧啶核苷酸并将它嵌入正在延长的DNA链中，但因LAM脱氧核糖的第3位缺少羟基，不能与另一核糖核苷酸上第5位羟基与磷酸酯化相连，就无法形成3,5-21 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生磷酸二酯键，DNA链的编码由此被中断，因而抑制了病毒的复制(Akilimalietal.,2015;Geleziunasetal.,1993;Kewnetal.,1997)。拉米夫定以其良好的耐受性、安全性和服用方便等优点，己被广泛应用于临床。目前已成为了临床抗艾滋病的首选核苷类药物。1.4本研究的目的和意义禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒和人类的艾滋病病毒均属于反转录病毒，病毒作用机制有很大的相似性，鉴于目前并没有有效的疫苗能够用来防控这些反转录病毒，因此本研究预想利用治疗HIV的药物来实现对禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒的控制。近年来，不同鸡群感染ALV的报道在中国越来越多，特别是在一些地方品系鸡群中ALV感染的阳性率非常高，肿瘤类型也多种多样（朱美珍等，2009；边晓明等，2013）。鉴于目前尚未有商品化的疫苗能够用于控制ALV，一些种鸡场不得不针对ALV开始实施严格的净化措施。而在净化的过程中成本高，实施困难等因素严重制约了净化的过程，我们一直致力于研究出新的方法能够辅助或者加速净化，在本研究中，我们从体内和体外两个方向分别证明了药物对病毒的抑制作用，并在动物实验中利用药物使病毒血症在第六周已基本消失，这一结果将会为禽白血病病毒在今后的净化过程中提供新的思路。现如今，不管是中国还是其他国家，禽弱毒疫苗中REV的污染已有很多报道，很多REV感染的病例均被怀疑是使用了污染有REV的弱毒疫苗造成(AwadAM2010;FadlyAetal.,2006;LiJetal.,2015;WeiKetal.,2012;王景艳等，2010;BiswasSKetal.,2011;丁家波等，2014)。禽弱毒疫苗污染REV的最大可能源于使用了污染有REV的鸡胚或细胞，但是也可能其毒种本身就存在REV的污染。疫苗的毒种一旦污染REV等外源病毒去除是非常困难的，多年来主要通过加入针对污染病毒的抗体中和来逐步去除，但是这种中和作用有局限性并且可能会出现反弹。在证实了AZT和LAM对REV具有抑制作用后，我们希望通过这两种药物的干预来去除疫苗毒种中REV的污染，因为AZT和LAM的作用机制决定了其主要干扰REV的复制而对疫苗毒种本身并无明显影响，从而达到除去REV但保存毒种的目的。在本研究中，我们首先在细胞上证实了药物对病毒的抑制作用，在随后的药物干预实验中，通过药物的干预连传三代即可将REV完全抑制，并在动物实验中验证已经去除了病毒的污染。这将为疫苗毒种的净化以及在疫苗毒株筛选过程中纯化种毒提供了借鉴。22 山东农业大学硕士学位论文2材料与方法2.1试验材料2.1.1毒株和细胞NX0101株（GenBankaccessionNo.DQ115805）ALV-J是2001年由本实验室从宁夏回族自治区某父母代种鸡场分离到(Cuietal.,2003a)，rNX0101是构建的传染性克隆(Zhangetal.,2005)，本实验使用的NX0101株为rNX0101的拯救毒。HA9901株(GenBankaccessionNo.AY842951)REV是1999年本实验室从中国江苏省的肉用型父母代发生免疫抑制的病鸡中分离到(Wangetal.,2006)，经IFA鉴定没有ALV-J的污染。NX0101株ALV-J在每100ul的DF1细胞的上清液中会含有104.5个TCID4.550。HA9901株REV在每0.1ml的CEF细胞上清液中含有10个TCID50。DF1细胞，是一种对E亚群的内源性禽白血病病毒有抵抗力的C/E鸡胚成纤维细胞，由美国禽病肿瘤研究所惠赠，在本实验室传代保存。鸡胚成纤维细胞（CEF），是按照常规的方法由本实验室的专门人员进行相关的制备。2.1.2试验动物SPF鸡是由购自济南SPAFAS的种蛋，消毒后在山东农业大学SPF动物设施内自孵并饲养；海兰褐蛋鸡购自泰安市东岳种禽场。2.1.3主要试剂和试剂盒PCR引物是由北京华大有限公司合成；DMEM细胞培养基、胎牛血清均购自美国Invitrogen生命技术有限公司；一次性细胞培养瓶、一次性细胞培养板（包括6孔细胞板、12孔细胞板、24孔细胞板、96孔细胞板）购自美国Corningcostar公司；REV的单抗11B118为实验室保存；ALV特异性抗原p27检测试剂盒AvianLeukosisVirusAntigenTestkit、ALV-J抗体检测试剂盒AvianLeukosisVirusAntibodyTestKit以及ReticuloendotheliosisvirusAntibodyTestKit均购自于IDEXX公司；ND和AIV-H9疫苗购自齐鲁动物保健品有限公司。23 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生2.1.4实验主要使用的药物齐多夫定、拉米夫定药物原粉购自东京化成工业株式会社。2.2方法2.2.1不同药物浓度的配制方法AZT在细胞上使用时，用DMEM配制成实验中需要的各种浓度：称取0.15g药物原粉，加入50mlDMEM中混合均匀配成3000ug/ml浓度，经滤器过滤后，倍比稀释成各种所需浓度，作为生长液时加入10%的胎牛血清，作为维持液使用时加入2%的胎牛血清。AZT在动物实验中使用的药物浓度用灭菌生理盐水配制成所需浓度：称取2g药物原粉加入40ml生理盐水，配成50mg/ml浓度，倍比稀释成25mg/ml，根据实验设计的分组给每只鸡注射不同剂量的药物。LAM的配制同AZT配置方法。2.2.2连续传代法确定DF-1细胞复制无影响的药物浓度在两个6孔细胞培养板的每孔中加入1mlDF1细胞悬液，待细胞长成单层后分别使用添加120ug/ml，100ug/ml，60ug/ml，40ug/ml，20ug/ml，5ug/ml，3ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml，0ug/ml浓度AZT的DMEM细胞生长液对细胞进行传代培养，当在显微镜下观察到细胞全部长满后，加入胰酶消化，并将细胞吹打悬浮后对应加入新的6孔板的一个孔中，每三天传一代，连续传15代。通过在不同药物浓度培养液中连续传代的方法来评估药物对DF-1细胞复制的安全药物浓度。LAM药物的具体操作同AZT药物。2.2.3CCK-8测定药物对DF-1细胞活性的影响通过CCK-8试剂盒（VazymeBiotech，China）测定了不同药物浓度对DF-1细胞的活性影响。具体操作如下：（1）6个96孔细胞板每孔中加入100ul的DF1细胞悬液。24 山东农业大学硕士学位论文（2）培养至80%左右后更换维持液。细胞板的每个横排分别设置为5ug/ml，3ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml的含AZT药物浓度组和不含药物维持液组和无细胞对照组，每组设置12个孔做重复。（3）从换液后的第24小时开始计算，每次相隔24小时的时间从培养箱中取出一块细胞板，细胞板的每个孔中都加入10ui的CCK-8溶液后，再放入温箱孵育3小时。（4）将细胞板取出在450nm下分别测定各孔的吸光度，记录数值。连续观察160小时。（5）计算各个浓度在每24小时各重复孔的吸光度的平均值。LAM药物的具体操作同上2.2.4不同药物浓度对ALV-J在DF-1细胞复制的抑制作用在一个24孔细胞培养板中接种同等数量的DF-1细胞，待细胞长成为单层后1-20孔每孔接种rNX0101株500个TCID50，剩余21-24孔不添加药物作为空白细胞对照。2h后1-4孔换为维持液A，其中含有5ug/ml的AZT，5-8孔、9-12孔、13-16孔、17-20孔分别更换为含有3ug/ml，2ug/ml，1ug/ml、0.5ug/mlAZT的维持液。接种ALV-J培养7天后，收24个孔细胞上清液，以ALV-p27抗原ELISA检测试剂盒测定CEF细胞中的p27抗原并记录各个孔的S/P值，同时对不同组的细胞上清液按照Reed-Muench法方法测定其TCID50。使用禽白血病抗原检测试剂盒具体步骤如下：使用前将试剂恢复至18-26℃，并将其震荡混匀后进行使用。1）轻拍抗原包被板，保持孔内清洁，在记录表上记录好加样顺序。2）在前四孔中按照阴阴阳阳的顺序分别加入100ul不需要稀释的阴性对照液和阳性对照液。3）按照加样顺序，将每份100ul稀释好的待检样品液加入相应的孔中。4）将96孔板放入板袋中，在18-26℃孵育箱中避光孵育30min。5）每孔加入350ul的稀释好的洗涤液进行洗板，洗3～5次，并将孔内液体完全甩干。6）每孔加100ul的辣根过氧化物酶标抗体。7）在18-26℃孵育箱中避光孵育30min。8）重复第6步。25 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生9）每孔分别加入100ul的TMB底物液。10）在18-26℃孵育箱中避光孵育15min。11）每孔分别加入100ul的终止液，终止反应。12）酶标仪空气调零，建立与96孔板各孔一一对应的模版。13）测定并记录各孔于650nm波长的吸光值（A650）2.2.5Reed-Muench法方法测定TCID50将所要测定的毒种在1.5ml离心管中做10倍的倍比梯度稀释，稀释完成后分别为10-1，10-2，10-3，10-4，10-5，10-6,，10-7，10-8，在96孔的一次性细胞培养板中，从第一列开始每列加入一个稀释度的病毒液，第9列设置为阴性对照。接毒后的两个小时换成细胞维持液，维持7后取细胞培养上清用ALV特异性抗原p27检测试剂盒AvianLeukosisVirusAntigenTestkit测定p27，以测定结果为阳性作为引起细胞病变的象征，用Reed-Muench法中的计算公式计算各个毒种的TCID50。2.2.6NX0101株在药物选择压下的连续传代向6孔细胞培养板中加入约500000个CEF细胞/孔，待细胞培养至80%左右，每孔接100ulALV-J，2h后换液，分别设置A1，A2，A3为含AZT药物浓度3ug/ml的1%维持液的有药物平行传代组，B1，B2，B3为不含药物的平行传代对照组。持续培养5天后取上清液进行ALVp27抗原的检测，观察药物对病毒的抑制作用，剩余上清-80°保存，细胞用胰酶消化后在新的6孔板中继续传代（可添加新细胞），生长至80%左右后分别更换含有药物和不含药物的维持液，维持5天后，进行与第一代相同的操作，在细胞上连续传50代后，保存上清分别命名为A1-50，A2-50，A3-50，B1-50，B2-50，B3-50后验证其是否在AZT药物选择压下形成耐药性。2.2.7NX0101株在药物选择压下的耐药性形成的验证将上述6个毒株和原始接种的ALV-J毒株分别进行定量，依照Reed-Muench法计算其TCID50。向24孔的细胞培养板中，每个孔加入约20万CEF细胞，待细胞生长到80%左右的程度，按照所用含有不同浓度的药物维持液分别设置为板1（0ug/ml），板2（1ug/ml）板3（3ug/ml）板4（5ug/ml），每个板再根据定量结果每个毒株接种相同26 山东农业大学硕士学位论文病毒量，每4个孔为同一毒株平行对照，2h后每个板分别按照分组换含有相应药物浓度的维持液，分别在第3、5、6、7、8天取每孔上清保存并添加新的维持液，8天后取所有保存上清测p27，判断各传代系耐药性的形成。2.2.8不同药物浓度对海兰褐鸡生产性能的影响从经过ALV净化的种鸡场购买80只1日龄海兰褐商品代蛋鸡，1日龄颈静脉采血分离病毒，病毒分离结果为不存在ALV、REV和MDV的感染情况，将所有鸡只平均分为A、B、C、D的4个组。A组作为空白对照组，不注射药物；B组从1日龄起每只鸡每天肌肉多点注射5mgAZT，连续用药7天；C组从1日龄起每只鸡每天肌肉多点注射10mgAZT，连续用药7天；D组从1日龄起每只鸡每天肌肉多点注射20mgAZT，连续用药7天。7日龄时免疫H9亚型禽流感灭活疫苗和新城疫灭活疫苗。分别在第7天、14天、21天、28天、35天、42天、49天、56天时对各组称重，并同时采集血清以血凝抑制实验（HI）分别测定针对H9亚型禽流感灭活疫苗和新城疫灭活疫苗抗体，观察不同药物浓度对海兰褐鸡体重和免疫机能的影响。2.2.9血凝血抑测定抗体滴度（1）1%鸡红细胞的制备使用20ml的注射器吸取4ml的抗凝剂肝素钠，用来采成年SPF公鸡的静脉血液。充分混合均匀后分装于15ml的灭菌离心管中，1500rpm离心5min后，将离心管上层的肝素钠和血浆吸出；再次用PBS清洗红血球，轻轻吹打后充分混和均匀，1500rpm离心5min后；再次按上面的步骤反复洗涤3次，最后一次再以1500rpm转速离心10min。将上清完全吸净后，剩余部分即为红细胞。按照1%的稀释度先将量取好的PBS加入瓶中，再将红细胞沿着瓶子内壁慢慢加入。（2）四单位抗原的配制及验证向96孔的一次性稀释板的每个孔中都加入50μl的生理盐水，之后在每列的第1个孔中加入50μl的待测抗原，多次吹打后进行倍比稀释至第11孔，把第12个孔作为红细胞不凝集对照。然后每个孔中全部加入50μl之前配制的1%的鸡红细胞，在37℃温箱中静置15min后进行结果的判定，把能使100%红细胞凝集的抗原稀释倍数作为最后的稀释倍数的判定终点。例如抗原的血凝价为9孔（即1:512），则四单位抗原的配制27 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生为9孔倒退2孔即为7孔（1:128）。四单位抗原配制好后需要进行验证，96孔板中加入50μl的PBS，在第1孔中加入50μl的配好的四单位抗原，多次吹打混匀后进行倍比稀释到第4个孔，第5个孔作为无抗原的红细胞对照，最后向每孔中加入1%的鸡红细胞50μl，放置37℃温箱中15min后进行结果的判定，如果只有前两个孔出现血凝现象，则表示该四单位病毒可用，反之，需要重新配制。（3）血凝抑制实验向96孔板一次性稀释板的每孔中都加入50μl的PBS，之后在每列的第1孔中加入50μl的待检血清，多次吹打混匀后，取出50μl加到下一个孔中，然后顺次进行倍比稀释，到最后一个孔时把50μl扔掉，再次向每个孔中加入四单位抗原50μl，放置到37℃的温箱中15分钟后，每孔加入1%红细胞悬液50μl，再次置于37℃反应15分钟，取出后进行结果的判定。2.2.10不同药物浓度对ALV-J在海兰褐鸡体内复制的抑制作用从经过ALV净化的种鸡场购买80只1日龄海兰褐商品代蛋鸡，1日龄颈静脉采血分离病毒，病毒分离结果为不存在ALV、REV和MDV的感染情况，将所有鸡只平均分为A、B、C、D的4个组。A组作为空白对照组，不注射药物；B组从1日龄起每只鸡每天口服5mg，连续服药7天；C组从1日龄起每只鸡每天口服10mg，连续服药7天；D组仅攻毒ALV-J不使用药。在首次用药后2h对B、C、D三个组均以rNX0101感染，104TCID50/只。从第一周起每周采集抗凝血，检测各组病毒血症的阳性情况。将采集好的抗凝血于4°1500rpm离心后取血浆部分120ul接种生长至80%左右的CEF细胞6孔板中，吸附2小时候后换液，维持5天后取上清并进行细胞传代，第二代维持7天后取上清用于p27的测定。2.2.11不同药物浓度对REV在DF-1细胞上复制的抑制作用在一个12孔的一次性细胞培养板的每孔中加入等量的DF-1细胞，待细胞长成为单层后每孔接种HA9901株100个TCID50，2h后1-3#孔更换为含有5ug/mlAZT的维持液，4-6#孔更换为含有5ug/mlLAM的维持液，7-9#孔更换为同时含有3ug/mlLAM和3ug/mlAZT的维持液，10-12孔不添加任何药物留作病毒感染对照。分别于接种REV培养3天和6天时每细胞孔收集150ul细胞上清液以OMEGA公司RNA提取试剂28 山东农业大学硕士学位论文盒提取核酸，然后以荧光定量PCR对REV进行定量[Luanh.b.et.al已录用]，对同一药物浓度下病毒拷贝数求取平均数。每细胞孔接毒剂量分别应用500个TCID50和1000个TCID50按照上述步骤各操作1次，以观察上述同等药物浓度对REV不同感染剂量复制的抑制作用。2.2.12疫苗毒种中REV污染去除（洁净性）的检验在一支检验合格的规格为1000羽份的NDV弱毒疫苗中人为添加了2000TCID50的REV，用10ml的细胞维持液将其溶解，然后用低温离心机于14000r/min离心10min后进行过滤，收集滤过液。将DF-1细胞接种至12孔板中，待细胞长到80%左右的时候向所有细胞孔中每孔接种50μl含有人工污染REV的疫苗滤液（每孔约污染100个TCID50的REV），2h后在第一列3个孔中分别换为含有5ug/mlAZT的维持液，在第二列3个孔中分别换为含有5ug/mlLAM的维持液，在第三列3个孔中分别换为同时添加3ug/mlAZT和3ug/mlLAM的维持液，第四列3个孔中不添加任何药物留作病毒感染对照。每天观察细胞状态，当出现NDV特有的细胞病变（CPE）时收获上清液提取核酸，上述方法以荧光定量PCR对REV进行定量。各孔中上清对应加入到新的12孔板相应的细胞孔中，按照上述操作重复加入药物进行干预，每代次当出现NDV特有的细胞病变时收取上清进行针对REV的检测。2.2.13药物干预后毒种接种SPF鸡的检验将药物干预后的NDV疫苗毒种以10倍剂量接种20只6周龄SPF鸡，同时留10只SPF鸡饲养于另一隔离器内作为对照。分别在疫苗免疫后的4w，5w，6w，7w，8w时采集非抗凝血后12000转离心后取血清保存，然后用IDEXX公司的ReticuloendotheliosisvirusAntibodyTestKit测定针对REV的抗体，以确定经药物干预后毒种的纯净性。2.2.14ELLISA测定血清中REV抗体样品的处理方式：首先用试剂盒中的样品稀释液把待检血清样品进行500倍的稀释。稀释方法为先1：20倍稀释，用多道移液器吸取190ul稀释液加入到96孔稀释板中，用单孔移液器吸取10ul样品于上述96孔稀释板中，用微孔震荡器震荡约1min；29 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生然后1:25倍稀释，用多道移液器吸取240ul稀释液加入到另一96孔稀释板中，用单孔移液器吸取10ul上述已震荡好的样品于该96孔稀释板中（注意两块板的各孔要一一对应），用多道移液器吹打6~7次以混匀。将试剂恢复至室温，将其振摇混匀后再进行使用。1）在板上和数据记录表上分别标记好待检样品的位置。2）将100ul的阴性对照液加入A1孔和B1孔中3）将100ul的阳性对照液加入C1孔和D1孔中4）剩下的每孔中都加入100ul稀释好的待检样品。5）室温下孵育30min6）用8道排枪向每个孔中加入350ul的洗涤液后用洗板机洗板，洗3～5次。7）用8道排枪向每个孔中加入100ul的二抗。8）室温下孵育30min9）重复第6步。10）用8道排枪向每个孔中加入100ul的TMB底物液。11）室温下孵育15min12）用8道排枪向每个孔中加入100ul的终止液。13）酶标仪空气调零，建立与96孔板各孔一一对应的模版。14）在650nm波长下测定吸光值（A650）。15）记录结果2.2.15间接免疫荧光实验：将净化后NDV疫苗毒种中加入NDV特异性单因子血清于37°中和半小时后经过滤操作后接种到细胞（CEF）上，接着在细胞上盲传3代，第三代时在细胞板的孔中放置飞片，在显微镜下观察到细胞基本长满后将飞片小心取出，先用PBS轻轻冲洗细胞，再用丙酮：乙醇固定液进行固定5min，固定完成后再使用PBS轻微冲洗3次，至表面完全晾干后向飞片上加REV的特异性单克隆抗体11B118，然后放置在37℃的恒温45min，取出后再使用PBS洗3次。然后再加FITC标记过的羊抗鼠二抗，再放置在37℃的恒温45min，最后用PBS洗3次，完成后加入50％的甘油，在荧光显微镜下观30 山东农业大学硕士学位论文察实验结果。当在显微镜下观察到细胞浆呈现特异性亮绿色荧光者而胞核没有被染色者判为阳性，反之则判为阴性。实验过程中同时设立阴性阳性对照。31 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生3结果3.1AZT对ALV-J在体内和体外的抑制作用3.1.1不同AZT添加浓度对DF-1细胞复制的影响当细胞培养液中的药物浓度高于5ug/ml时，DF-1细胞均无法正常传代；当在培养液中加入浓度5ug/ml及以下的AZT时，DF-1细胞可连续传代15代以上（表5）。因此我们认为5ug/ml及以下的药物浓度将对细胞的复制没有很大的影响，在后续实验中可以将其作为安全浓度进行后续实验设计。表5不同浓度AZT对DF-1细胞传代的影响Table5TheinfluenctiontocellspassagebydifferentconcentrationofAZT药物12010060402053210.5浓度ug/mlug/mlug/mlug/mlug/mlug/mlug/mlug/mlug/mlug/ml传代111111515151515代数3.1.2不同AZT添加浓度对DF-1细胞活性的影响根据3.1.1中结果，在测定药物对细胞活性的影响时，在培养液中分别添加5ug/ml，3ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/ml的AZT，采用CCK-8试剂盒来测定药物浓度对细胞活性，在450nm下分别测定细胞的吸光度，连续观察160h，以吸光度值为纵坐标，时间为横轴，绘制折线图（见图12），结果显示实验中所用的药物浓度尽管对细胞活性有一定的轻微影响，但是差异不明显，我们可以认为上述药物浓度均为安全浓度。32 山东农业大学硕士学位论文图12不同AZT添加浓度对DF-1细胞活性的影响Fig.12Theinfluenctiontocells’activitybydifferentconcentrationofAZT3.1.3不同AZT添加浓度对ALV-J在DF-1细胞复制的抑制作用接种rNX0101的DF-1细胞在分别含有5ug/ml，3ug/ml，2ug/ml，1ug/ml，0.5ug/mlAZT的维持液中培养7天后，收获细胞上清液，以ALV-p27抗原ELISA检测试剂盒测定CEF细胞中的p27抗原并记录各个孔的S/P值，以ELISA检测的S/P值为纵轴，AZT添加浓度为横轴绘制柱形图（图13），可明显观察到AZT药物具有明显的抗病毒作用。同时对各组病毒含量（TCID50）进行了测定（表6）。结果显示随着药物浓度的增加，rNX0101的复制受到的抑制作用随之增强，每100ul上清中的病毒量存在较大差距，从而验证了药物对ALV-J的抑制作用。33 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生图13.不同药物添加浓度对ALV-J复制的抑制作用Fig.13InhibitingeffectiontoALV-Jreplicationbydifferentconcentrationofdrug表6不同药物添加浓度对ALV-J复制的抑制作用Table6InhibitingeffectiontoALV-Jreplicationbydifferentconcentrationofdrug药物浓度S/PTCID505ug/ml0.235102.25（177.83）3ug/ml0.240102.35（223.87）2ug/ml0.271102.42（263.03）1ug/ml0.312102.58（380.19）0.5ug/ml0.460102.86（724.44）0ug/ml0.921103.2（1584.89）3.1.4不同浓度AZT对海兰褐鸡生产性能的影响给每只海兰褐鸡按照分组每天分别服用5mg，10mg和20ugAZT并连续使用7天，观察发现使用5mg和10mg药物组虽然造成了鸡比空白对照组的体重轻微下降，但差异不明显（p＞0.05）（图14），但是20mg组有明显死亡发生，这可能与对幼年小鸡注射过量液体有关，对于该组我们在后续的实验中将不予讨论。由此我们可以认为10mg的药物对实验动物的生产性能产生的影响并不大。34 山东农业大学硕士学位论文图14.每周体重平均值Fig.14Averageweightofeveryweek3.1.5不同药物浓度对NDV和AIV-H9免疫后抗体反应的影响在免疫H9亚型禽流感灭活疫苗和新城疫灭活疫苗后4w，6w，8w后测定针对H9亚型禽流感灭活疫苗和新城疫灭活疫苗抗体显示服用药物对两种疫苗抗体滴度与空白对照组差异不显著，并且在某些药物浓度下会有高于空白对照组的情况出现（表7、表8）。表7.不同药量对免疫新城疫后HI抗体滴度的影响(Log2)Table7InfluenceofdifferentqualitydruginfectiononHIantibodytiterstoNDVpost-vaccination(Log2)组别4w6w8w0mg/只/天5.33±1.03a5.17±0.75a5.00±0.63a5mg/只/天AZT4.67±1.03a5.17±0.75a5.33±0.82a10mg/只/天AZT4.50±0.70a4.50±0.70a5.00±0a每列中相同字母表示差异不显著（p＜0.01）表8.不同药量对免疫禽流感H9疫苗后HI抗体滴度的影响Table8InfluenceofdifferentqualitydruginfectiononHIantibodytiterstoAIV-H9post-vaccination(Log2)组别4w6w8w0mg/只/天5.67±1.63a6.17±0.75a5.67±0.52a5mg/只/天AZT5.67±1.21a5.17±0.75a5.67±1.63a10mg/只/天AZT7.00±1.41a4.50±0.70a4.50±0.70a每列中相同字母表示差异不显著（p＜0.01）35 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生3.1.6不同剂量AZT对ALV-J在海兰褐鸡内复制的抑制作用从表中我们可以看到未使用AZT的ALV-J感染组从第一周至第九周表现为持续病毒血症阳性，并维持在一个较高的水平。而使用10mgAZT的ALV-J感染组到42d为止均未出现病毒血症。使用5mgAZT的ALV-J感染组尽管前6周没有完全消除ALV-J的感染，但病毒血症阳性率也明显低于不使用AZT的ALV-J感染组，但病毒血症在第七周时完全消失（表9）。表9.病毒血症阳性率Table9Theposistiverateofviermia攻毒后不同时间病毒血症阳性率（%）剂量714284263空白组0.000.000.000.000.000mg2541.6733.3333.3333.335mg26.3635.4518.1818.180.0010mg0.000.000.000.0014.293.2在药物选择压下ALV-J耐药毒株的形成3.2.1第50代不同传代系耐药性形成的验证分别以含有1mg/ml、3mg/ml、5mg/ml药物浓度的维持液的细胞板中6个传代系A1-50，A2-50，A3-50，B1-50，B2-50，B3-50在5天中4个平行重复孔测得的p27数值的平均值与不含药物的维持液的细胞板对应的每个传代系在5天中的p27数值的平均值的差值为纵坐标，以天数作为横坐标做出下列折线图，图中我们可以看出，在每个药物浓度下，在传代过程中没有药物作用的B传代系的差值均大于在传代过程中有药物作用的A传代系，药物浓度越大，B传代系的差值越大。这说明在传代中有药物作用的A传代系在细胞上连传50代后已经产生了耐药毒株。36 山东农业大学硕士学位论文图15.验证耐药性的产生Fig.15VerificationtheoccurofdrugresistanceA组为药物传代组B组为不添加药物传代组37 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生3.3利用逆转录酶抑制剂类药物去除疫苗中的REV污染3.3.1不同浓度AZT和LAM对REV在细胞复制的抑制作用接种HA9901的DF-1细胞在分别含有AZT或LAM以及两者联合应用后测定其中REV病毒含量，结果显示不管是AZT还是LAM对REV均有明显的抑制作用，如接种100TCID50时未使用药物的REV拷贝数在第六天时是使用AZT干预组的53.49倍，但仅为使用LAM干预组的1.48倍，可以看出AZT对REV的抑制作用明显强于LAM（表10）。两种药物联合应用效果要比LAM单独应用要好一些，但是低浓度的AZT和LAM联合用药对REV的抑制作用比单独使用AZT要弱一些，可以看出AZT对REV的抑制作用与其使用浓度密切相关，随着AZT药物浓度的降低对REV抑制作用也明显降低，即使有LAM的联合使用与高浓度的AZT相比也没有优势。表10不同药物对REV的抑制作用Table10InhibitingeffectiontoREVbydifferentdrugs接毒后时不同剂量培养一定时间后150ul上清中REV的拷贝数分组与处理间1000TCID50500TCID50100TCID50接毒但不添加药物1.15x1059.0x1044.89x104使用AZT(5ug/ml)2.93x1031.47x1034.03x1023d使用LAM(5ug/ml)6.54x1043.42x1044.13x102AZT+LAM(各3.50x1032.84x1034.13x1023ug/ml)接毒但不添加药物1.84x1059.83x1046.26x104使用AZT(5ug/ml)3.44x1032.66x1031.44x1036d使用LAM(5ug/ml)1.24x1057.49x1045.48x104AZT+LAM(各7.46x1043.25x1046.89x1033ug/ml)3.3.2AZT和LAM单独或联合应用去除疫苗毒种中REV污染在接种人为污染REV的NDV弱毒疫苗后六天，没有使用任何药物干预的NDV弱毒疫苗在DF-1细胞上诱导产生了明显的细胞病变，显然并未明显影响到其中污染的REV继续复制，但可以看出在接种100TCID50时由于NDV的复制REV的含量比未混入NDV时降低了（表11）。如表11所示，在第六天时未添加任何药物的NDV疫苗中REV含量远远高于单独添加AZT和LAM及其两者混合用药组，分别为三个药物干预组的154.6338 山东农业大学硕士学位论文倍、74.94倍和131.54倍，即通过药物干预作用人为混入NDV疫苗毒种中的REV被极强的抑制了。将各组对应接种下一个细胞培养板后按照同样操作继续分别在添加不同药物培养液中将毒种连续传代4次后进行检测，荧光定量检测结果显示REV判定为阴性。表11不同药物对疫苗中REV污染的抑制作用Table11InhibitingeffectiontoREVinthevaccinebydifferentdrugs不同剂量培养一定时间后150ul上清中REV的拷贝数分组与处理3d6d不添加任何药物1.13х1043.17х104使用AZT组(5ug/ml)1.23х1022.05х102使用LAM组(5ug/ml)2.47х1024.23х102联合用药AZT+LAM(各3ug/ml)1.81х1022.41х1023.3.3IFA检测净化后疫苗毒种中REV将净化后NDV疫苗毒种以NDV特异性单因子血清中和后接种鸡胚成纤维细胞，在细胞上盲传3代后以REV特异性单克隆抗体11B118进行IFA结果为阴性（图16），由此说明经净化的疫苗毒种中的REV已经完全得到抑制。AB图16应用IFA检测药物干预后NDV疫苗毒种中REVFig.16UsingIFAtotesttheREVinNDVpost-vaccinationaftertheeffectionofdrugsA.REV感染细胞作为阳性对照；B.药物干预后NDV疫苗毒种接种细胞3.3.4SPF鸡接种法检测净化后疫苗毒种中REV污染将净化后NDV疫苗毒种接种SPF鸡后分别在4w，5w，6w，7w，8w时以ELISA测定针对REV的抗体均为阴性，结果表明，REV在SPF鸡体内并不能进行复制，我们可以断定经该方法干预后的被REV污染的NDV疫苗毒种已去除REV污染。39 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生4讨论ALV、REV与人获得性免疫缺陷病毒（HIV）同属于反转录病毒科，它们的基因组结构非常相似，都含有gag、pol以及env基因，病毒的复制过程也有很多共性。在禽白血病病毒中pol基因编码位于核芯中的反转录酶（RT）和整合酶（IN，P32），RT具有依赖RNA和依赖DNA的聚合酶活性，IN是病毒核酸整合进宿主细胞所必须的，能将病毒核酸整合进宿主细胞染色体基因组中。在禽网状内皮组织增生症病毒中pol基因编码的蛋白包括蛋白酶（PR）、逆转录酶（RT）和整合酶（IN），其在病毒的增殖和致病性方面发挥着至关重要的作用。正是由于这三种病毒基因组方面的相似性，为我们的研究提供了科学的依据。鉴于目前并没有有效的疫苗能够用来防控这些反转录病毒，因此我们利用治疗HIV的药物来实现对病毒的控制。在治疗艾滋病的众多药物中有一类是核苷类逆转录酶抑制剂药物，主要作用于病毒的逆转录过程，该类是利用药物的分子结构和核苷酸类似，在病毒复制过程中，逆转录酶错将其利用，但因相关药物的第3位缺少羟基，不能与另一核糖核苷酸上第5位羟基与磷酸酯化相连，不能形成3,5-磷酸二酯键，DNA链的编码被中断，因而抑制了病毒的复制。如目前广泛使用的AZT(LinTSetal.,1987;JablonLetal.,1987;HopkinsSetai.,1987)，LAM。1AZT药物在体内和体外对ALV-J的抑制作用泰国一项大规模的研究结果显示，在妊娠晚期和分娩期给予葛兰素威尔康公司生产的AZT使HIV的母婴传染率降低一半(马振英，2009)。这种策略是否可以用于同样主要依靠垂直传播的ALV的控制呢？本研究从体内和体外两个方面观察了AZT对ALV-J复制的抑制作用。近年来，不同鸡群感染ALV的报道在中国越来越多，特别是在一些地方品系鸡群中ALV感染的阳性率非常高，肿瘤类型也多种多样（朱美珍等，2009；边晓明等，2013）。鉴于目前尚未有商品化的疫苗能够用于控制ALV，一些种鸡场不得不针对ALV开始实施严格的净化措施。目前，国际上用于原种鸡群的最优净化方案是对核心鸡群全部采血接种DF-1细胞进行外源性ALV的分离鉴定并全部淘汰阳性，这已经成为种鸡群净化的国际金标准。但是在执行这一标准时遇到了很多困难，因为在中国很多鸡群中ALV阳性率过高导致净化中淘汰过多严重影响了进化的进程（崔治中，2010）。40 山东农业大学硕士学位论文在进行这一研究前确保所使用的药物浓度不会对宿主细胞或动物机体造成过度损伤是十分必要的，如果细胞状态较差会导致ALV-J在细胞上不能复制，而这种抑制并不是药物本身对ALV-J的抑制作用。目前常用的方法是用CCK测定使用药物后的细胞活性，利用这一方法测定结果显示在添加5ug/ml浓度以下情况下，DF-1细胞的活性几乎不受影响。此外，本研究还通过DF-1细胞在添加不同浓度AZT的细胞培养液中连续传代来不同浓度对DF-1细胞复制的影响，结果显示在添加5ug/ml的培养液中DF-1细胞可以连续传代40代以上。在鸡体中我们观察了不同药物浓度对鸡体重以及免疫机能的影响，结果显示在每天使用5mg情况下鸡的体重与免疫机能几乎不受影响。在此基础上我们分别通过在DF-1细胞接种ALV-J和给海兰褐鸡感染ALV-J后使用不同浓度AZT的方式评估了AZT在体内和体外对ALV-J复制的抑制作用，结果显示不管是体内还是体外AZT均能够显著抑制ALV-J的复制。考虑到AZT在控制HIV过程中产生的大量耐药毒株的报道（JingZhangaetal.,2010;BiancaBruzzoneetai.,2014），本研究建议AZT的使用不能维持过长的时间特别是不能一直持续用药，为此本研究仅用药7天即停止喂药，即便如此，AZT对ALV-J的抑制作用仍然是非常明显的，很多ALV-J感染鸡在后期的连续观察中病毒血症为阴性。特别是当每只鸡服用10mgAZT情况下，所有鸡在63d内病毒血症全部为阴性。需要强调的是，药物的使用不能够替代针对ALV的净化，因为它无法确保使感染鸡的病毒血症100%消除。因此它的作用主要是针对一些感染率极高的品系，如中国一些非常宝贵的地方品系鸡群，在进行净化的同时以药物降低病毒血症阳性率来加速净化的进程，因此仅可以作为净化措施的补充。这一措施还有一个潜在的优势是，通过药物的使用降低了ALV的病毒血症水平，这有助于鸡体产生针对ALV的抗体加速清除ALV。2AZT和LAM药物单独或联合使用去除疫苗中REV污染本研究首先在DF-1细胞上证实了AZT和LAM两种逆转录酶抑制剂类药物对于REV也有明显的抑制作用，这为体外干扰REV复制提供了另一种思路。现如今，不管是中国还是其他国家，禽弱毒疫苗中REV的污染已有很多报道，很多REV感染的病例均被怀疑是使用了污染有REV的弱毒疫苗造成(AwadAM2010;FadlyAetal.,2006;LiJetal.,2015;WeiKetal.,2012;王景艳等，2010;BiswasSKetal.,2011;丁家波等，2014)。禽弱毒疫苗污染REV的最大可能源于使用了污染有REV的鸡胚或细胞，但是也可能其毒种本身就存在REV的污染。疫苗的毒种一旦污染REV等外源病毒去41 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生除是非常困难的，多年来主要通过加入针对污染病毒的抗体中和来逐步去除，但是这种中和作用有局限性并且可能会出现反弹。在证实了AZT和LAM对REV具有抑制作用后，我们希望通过这两种药物的干预来去除疫苗毒种中REV的污染，因为AZT和LAM的作用机制决定了其主要干扰REV的复制而对疫苗毒种本身并无明显影响，从而达到除去REV但保存毒种的目的。为了达到上述目标，确保所使用的药物浓度不会对宿主细胞造成过度损伤是十分必要的，如果细胞状态很差或者不能复制不仅会导致REV在细胞上不能复制，更容易导致疫苗毒种也无法复制，而这不是我们希望看到的。我们分别通过DF-1细胞在添加不同浓度AZT的细胞培养液中连续传代法和CCK-8测定来探索不同浓度AZT对DF-1细胞复制和活性的影响，证实在添加浓度5ug/ml以下情况下，DF-1细胞的活性和复制几乎不受影响。此前，我们曾推测在NDV疫苗中污染REV会因为NDV快速诱导细胞病变而严重干扰REV复制从而使REV逐渐自动去除，但在预备实验的摸索中发现并非如此，即使将NDV疫苗毒种连续传代3代以上，并且NDV出现细胞病变时间也越来越快的情况下始终都可以检测到REV。因此，对REV的干扰作用还需考虑要使药物的作用时间尽可能延长，即避免NDV疫苗感染细胞后过早出现细胞病变。本研究在经过预备实验的摸索后发现不管是REV还是NDV在DF-1细胞复制时均比CEF要慢，因此我们改用DF-1细胞作为药物干预的载体，这样一方面REV复制能力自动降低，另一方面可以延长NDV疫苗毒种感染后出现细胞病变的时间，从实验结果中就可以看出当REV与NDV疫苗混合后不同药物对其复制干预效果更加明显，在多种有利因素下REV的复制逐渐处于劣势，但NDV疫苗毒种含量始终处于上升状态，尽管这种上升趋势可能比在鸡胚成纤维细胞或鸡胚上要低一些，但是我们首先关注的是毒种的纯洁性，在确保这一前提下大规模扩增NDV毒种的技术是非常成熟的。总体上，本研究证实了AZT和LAM等核苷类逆转录酶抑制剂药物单独和联合应用对REV复制的抑制作用，并据此在模拟实验中利用药物成功去除了疫苗毒种中污染的REV，这为疫苗毒种的净化以及在疫苗毒株筛选过程中纯化种毒提供了借鉴。42 山东农业大学硕士学位论文5结论5.1在体外实验中，5ug/ml的药物浓度能够在对细胞活性不产生影响的情况下对禽白血病病毒和禽网状内皮组织增生症病毒产生明显的抑制作用。5.2在体外条件下以3ug/ml的AZT进行连续传代培养50代，经验证在药物选择压下产生了禽白血病病毒的耐药毒株。5.3在体内实验中，当使用10mg/只/天的药物剂量时，能够在6周内完全抑制病毒血症的发生，并且对鸡群的生长性能和免疫反应无明显的抑制作用。5.4当使用5ug/ml的AZT和LAM以及3ug/ml的两种药物联合用药都能够去除新城疫疫苗中的REV病毒,经动物实验和IFA验证经净化的毒种已去除REV污染。43 逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生参考文献边晓明,李德庆,赵鹏,崔治中.三群商品代蛋鸡J亚群白血病跟踪观察.中国农业科学,2013,46(2):409-416陈浩,王一新,赵鹏,李建亮,李德庆,崔治中.禽白血病/肉瘤病毒肿瘤基因及其与致肿瘤机制的关系.畜牧兽医学报,2012,(43):336-342成子强,张利,刘思当,张玲娟,崔治中.中国麻鸡中发现禽J亚群白血病.微生物学报,2005,(45):584-587崔治中.免疫抑制性病毒多重感染在鸡群疫病发生和流行中的作用.畜牧兽医学报,2003,(34):417-421崔治中,孟珊珊,姜世金,魏建萍.我国白羽肉用型鸡群中CAV,REV和REOV感染状况的血清学调查.畜牧兽医学报,2006,(37):152-157崔治中.鸡白血病及其鉴别诊断和预防控制[J].中国家禽.2010,32(8):1-12.丁家波,崔治中,于立娟,孙淑红,姜世金.含有禽网状内皮组织增生病病毒基因组片段的天然重组禽痘病毒的研究.微生物学报,2004,(44):588-592杜岩,崔治中,秦爱建,SilvaR.F.,LeeL.F..鸡的J亚群白血病病毒的分离及部分序列比较.病毒学报,2000,(16):341-346姜世金,孟珊珊,崔治中,田夫林,王增福.我国自然发病鸡群中MDV,REV和CAV共感染的检测.中国病毒学,2005,(20):164-167金文杰,崔治中.传染性法氏囊病病料中MDV,CAV,REV的共感染检测.中国兽医学报,2001,(21):6-9陆承平.兽医微生物学.中国农业出版社,2007马振英短期用齐多夫定治疗和阻断HIV的母婴传染.国外医学药学分册.1998,25(5):305秦爱建,1999.禽白血病病毒J亚群囊膜糖蛋白基因的生物学和生物化学特性.扬州大学博士论文王景艳,李中明,赵鹏,等.禽痘病毒活疫苗中网状内皮组织增生病病毒的分离鉴定及其序列比较[J].中国动物传染病学报,2010,18(1):35-39.王鑫,李德庆,边小明,何羽婷,赵鹏,崔治中.海兰褐产蛋鸡ALV-J亚型相关纤维肉瘤的鉴别诊断及人工造病试验.中国兽医科学,2012,(42):582-58644 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逆转录酶抑制剂类药物对鸡逆转录病毒的抑制作用及药物选择压下禽白血病病毒耐药毒株的产生致谢首先感谢我的恩师崔治中教授！恩师学识渊博，思想睿智，工作稳健，生活乐观。不仅在科研学习中给与我指引，在做人上更是我人生的导师。恩师的谆谆教导永远铭记在心。师母苗秀娥女士秀外慧中，温婉娴雅，在生活方面给予了我无微不至的关怀，恩师与师母相濡以沫，鹣鲽情深，给予学生无限力量。衷心感谢动物科技学院各位领导和老师多年来给我的帮助和关怀!在此期间，我获益于赵孝民教授、柴同杰教授、崔言顺教授、常维山教授、朱瑞良教授、刁有祥教授、姜世金教授、孙淑红教授的意见和建议，并得到了他们多方面的支持和指导，老师的教诲，学生永远铭记，在此表示衷心的感谢!衷心感谢赵鹏副教授、常爽老师在我求学期间给我提供的各方面的帮助，你们既是我的恩师也是我的榜样，在今后的学习生活中，我会向你们看齐，无愧于你们对我的教导！感谢我的师兄王一新博士，李阳博士对我提供的鼓励和无私帮助！感谢我的同学李思菲、孟凡峰、崔贺、孙鹏，感谢我的师弟（妹）栾怀彪、许书珍、房立春、陈俊霞、刘英楠、任志浩、李晓晗、赵颖洁、吕艳艳、付佳媛、韩妮、张言坤以及实验室孙文丽、卢金、吕汉英等工作人员对于本实验的大力帮助和协作。值此论文完成之际，谨向所有给予我指导、关心、帮助的老师、领导、同学和朋友表示深深的谢意！同时向参加本论文评阅和答辩工作的各位老师和前辈深表谢意！衷心感谢我的父母多年来在我的学业上给予的默默关心、理解和鼎力支持。50 山东农业大学硕士学位论文硕士期间发表的论文苏红芹#，李思菲#，任志浩，栾怀彪，孟凡峰，李阳，崔治中，常爽*，赵鹏*利用核苷类逆转录酶抑制剂去除疫苗毒种中禽网状内皮组织增生症病毒的污染中国兽医学报（已录用）SuHongqin#1,LiSifei#1,LiYang1,WangYixin1,LuanHuaibiao1,XuShuzhen1,ChangShuang1,CuiZhizhong*1,ZhaoPeng*1InhibitionofAvianleukosisvirussubgroupJbyAzidothymidineinvitroandinvivo.VirologicaSinica（外审中）李思菲#，苏红芹#，王一新，吕艳艳，赵颖洁，崔治中，常爽，赵鹏.拉米夫定对禽白血病病毒的体内外抑制效应及其应用.中国预防兽医学报（已录用）WangY#,XuS#,LiS,SuH,ChangS,LiY,SunX,ZhaoP*,CuiZ*.LamivudineInhibitstheReplicationofALV-JAssociatedAcutelyTransformingVirusanditsHelperVirusandTumorGrowthInvitroandInvivo.FrontiersinMicrobiology.2015,15,6:1306.刘英楠，孟凡峰，李阳，孙鹏，栾怀彪，苏红芹，崔贺，常爽，赵鹏，崔治中*，3株马立克氏病病毒的分离鉴定及其主要致病基因分析中国兽医学报（已录用）51
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