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《猪瘟活疫苗的免疫时间、免疫剂量和猪场发生蓝耳病对猪瘟抗体水平的影响》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
学校代码：10564学号：VM20120007分类号：S855.3密级：硕士学位论文猪瘟活疫苗的免疫时间、免疫剂量和猪场发生蓝耳病对猪瘟抗体水平的影响陈峥第一指导教师：任涛教授第二指导教师：杨傲冰副研究员学院名称：兽医学院专业学位类别：兽医硕士领域：答辩委员会主席：田允波教授中国·广州2016年6月 华南农业大学学位论文原创性声明本人郑重声明：所呈交的学位论文是本人在导师的指导下独立进行研究所取得的研究成果。除了文中特别加以标注引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。作者签名：日期：学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：研究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华南农业大学。学校有权保存并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅或在校园网上发布并供校内师生和与学校有共享协议的单位浏览（除在保密期内的涉密论文外）；学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手段保存、汇编学位论文。本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。作者签名：日期：导师签名：日期：学位论文提交同意书本学位论文符合国家和华南农业大学关于研究生学位论文的相关规定，达到学位授予要求，同意提交。导师签名：日期：学科带头人签名：日期： 摘要猪瘟是一种烈性传染性疾病，也是危害我国养猪业的重要疫病。我国在上世纪50年代就研发了猪瘟兔化弱毒活疫苗（C株）来预防猪瘟的暴发，取得较好的效果。随着免疫密度加大，疫苗质量的提高，猪瘟也从大规模暴发转入到散发。目前在我国猪瘟的流行特点主要是为混合感染、母猪带毒隐性感染和仔猪水平传播。各个猪场对猪瘟的防疫都较重视，都采用了抗体监测的手段来了解猪瘟的免疫情况。为了探究猪瘟抗体水平的变化规律，本研究选取了商品化猪瘟抗体ELISA检测试剂盒检测猪瘟阻断ELISA抗体水平，研究了免疫时间、免疫剂量和猪瘟蓝耳病情况对猪瘟抗体水平的影响。实验结果如下：（1）选取了4个生产正常、无发生疫病情况的健康猪场，无论是20~60d免疫方法，还是35~70d免疫方法，在第一次免疫后即首免后30d左右的猪瘟抗体水平阻断ELISA阻断值都较低，阳性率在50%~80%之间；第二次免疫后，猪瘟抗体水平阻断ELISA阻断值都显著上升，阳性率都能达到100%，离散系数在0.3以下。从整体上看，20d~60d免疫方法猪场的首免时候猪瘟的母源抗体水平较高，首免后到二免前的阳性率为50%~70%不等，相比35~70d首免时候的母源抗体水平低，首免后到二免前阳性率达到了80%以上，说明35~70d免疫方法受到母源抗体的干扰较小，但是猪瘟免疫空白期长。（2）选取了惠州规模化猪场（存栏500母猪）分2组，每组约30只仔猪，按照猪场20~60d免疫程序分别免疫1头份和6头份猪瘟活疫苗（细胞源）RID>750，免疫1头份和免疫6头份的组别分别在20、60和90d检测猪瘟的阻断ELISA抗体阻断值，得到了免疫1头份组和6头份组在20、60和90d阻断值均为无差异（P>0.1），且1头份和6头份组的猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度在20、60和90d的变化曲线与本文中生产正常、无疫病发生的健康猪场的20~60d免疫免疫组的变化曲线相符合。（3）选取了25头无猪瘟抗体的健康猪只，10只为1组免疫1头份猪瘟活疫苗（传代细胞源）RID>15000，10只为1组免疫10头份猪瘟活疫苗（传代细胞源）RID>150000，分别在免疫前7d、免后7d、免后14d、免后21d、免后28d、免后35d和免后72d检测其猪瘟抗体阻断ELISA阻断值，比较2种免疫剂量的抗体差异；得到了免疫1头份（15000RID）组猪瘟抗体阻断ELISA阻断I 值在免后14d开始有阳性，阳性率为30%，阻断均值0.34；而超剂量免疫组10头份（150000RID）免后14d猪瘟抗体阳性率达到100%，阻断均值0.57，显著高于免疫1头份组。表明超剂量免疫（150000RID）能够快速生产猪瘟阻断ELISA抗体，但是抗体峰值与免疫1头份组（15000RID）无差别。（4）选取湖南蓝耳病发病场，检测该场在20、40、60和90d的猪瘟抗体阻断ELISA阻断值，发现该场猪瘟抗体阻断ELISA阻断值在90d的时候与同样20~60d免疫方法猪场存在明显差异（P<0.05），90d猪瘟抗体水平阳性率低，只有50%。表明在蓝耳病发病场猪瘟抗体水平与正常场存在差异，蓝耳病发生会导致中大猪猪瘟抗体水平下降，免疫失败。（5）本研究表明：在母源抗体比较高的猪场，建议采用35~70d免疫法来免疫猪瘟活疫苗；在母源抗体相对低的场建议采用20~60d免疫方法来免疫猪瘟活疫苗。猪瘟活疫苗的免疫剂量对猪瘟抗体水平的影响不大，但是在超大剂量（RID>150000）免疫时能够快速产生抗体。当猪场发生蓝耳病时候，猪群90d后的猪瘟抗体水平受到显著影响。关键词：猪瘟抗体；免疫时间；免疫剂量；蓝耳病II EffecttheImmuneDoseandTimeofSwineFeverLiveVaccineandPRRSinPigFarmofCSFVAntibodyChenZheng(CollegeofVeterinaryMedicine,SouthChinaAgriculturalUniversity,Guangzhou510642，China)Abstract:Classicalswinefeverisasevereinfectiousdisease,endangeringtheswineindustryinchina.Inthelastcentury,ourcountryinventionofthevaccine(HCLV)topreventswinefever,andachievedverygoodresults.Inthisstudy,weselectedcommercialswinefeverantibodyELISAdetectionreagentkittodetecttheclassicalswinefeverblockingELISAantibodylevelandstudytheinfluenceoftimeofimmunization,immunedoseandPRRSdiseasesituationinclassicalswinefeverantibodylevel.Theexperimentalresultsareasfollows:1.Selected4healthypigfarms,using20~60daysand35~70daysofclassicalswinefevervaccineimmunity.Inabout30daysafterthefirstimmunizationofswinefeverantibodyblockingblockingELISAvaluesarerelativelylow,thepositiverateofbetween50%to80%;afterthesecondimmunization,swinefeverantibodyblockingblockingELISAvaluesweresignificantlyincreased,positiveratecanreach100%,thedispersioncoefficientat0.3below.Asawhole,theimmunemethodof60dayoldfarmof20dayoldthefirsttimeCSFmaternalantibodylevelswerehigherinfree,thefirstfreetosecondfreebeforethepositiverateof50%to70%range,comparedto35daysofage70daysofagethefirstfreetimeofmaternalantibodylevelslow,firstfreetofreebeforethepositiveratereachedmorethan80%,indicatingthat35~70dayoldimmunemethodislessdisturbedbymaternalantibody,buthogcholeraimmunizationblankperiodlong.2.Selectalarge-scalepigfarms,thepigletsweredividedinto2groups,about30pigletsineachgroup,accordingtotheimmuneprocedurefor20~60daysofageinpigfarmswereimmune1and6swinefeverlivevaccine(RID>750)afterimmunizationrespectivelyattheageof20daysand60daysofageand90daysofIII agedetectionofclassicalswinefeverantibody.Aftertestingfounddifferentimmunedosesattheageof20daysand60daysofageand90daysofageofclassicalswinefeverantibodyinnodifference(P>0.1)and1headand6copiesofthefirstgroupofCSFVantibodyvalue,positiverateanddispersioninattheageof20daysand60daysofageand90daysofagechangecurvewiththenormalpigfarmof20~60immunecurvefortheconsistent.3.Selectthefirst25NoCSFV’santibodyofhealthypigs,whichvaccine(RID>15000)10immune1copiesofthefirstclassicalswinefeveractivity,also10immune10copiesofthefirstclassicalswinefeverlivevaccine(RID>150000),andin7daysbeforeimmunizationand7daysafterimmunization,freeafter14days,21daysafterimmunization,freeafter28daysand35daysafterimmunizationand72daysafterimmunization,thedetectionoftheswinefeverantibodylevelandcompareimmunizedwithtwodosesofantibodydifferences.Theexperimentresultedinthediscoveryofimmune1head(15000RID)oftheCSFVantibodyin14daysbegantohavepositive,thepositiveratewas30%,blockingmean0.34;immunefirst10copies(150000RID)in14daysofclassicalswinefeverantibodypositiveratereached100%,blockingmean0.57,significantlyhigherthanthatofimmune1copiesofthefirstgroup.Showthatimmune10copiesofthefirst150000RIDtorapidproductionofclassicalswinefeverantibody,butpeakvalueofantibodyandimmunehead1copies(15000RID)therewasnosignificantdifferencebetweenthe.4.SelectthefieldofHunanPRRSdisease,thedetectionofthefieldattheageof20daysand40daysofage,attheageof60daysand90daysofageofclassicalswinefeverantibodyinblockingELISAblockvalue,discoveredthattheswinefeverantibodyblockingblockingELISAvaluesat90daysofagewiththesame20~60immunemethodfarmsexistsignificantdifference(P<0.05),thepositiverateof90dayoldclassicalswinefeverantibodylevellow,only50%.Thatblueeardiseaselevelofswinefeverantibodyandnormalfielddifferences,PRRSdiseaseoccurrencewillleadtobigpigplagueantibodylevelsdecreasedandfailureofimmunization.5.Conclusion:whenpigfarmsswinefevermaternalantibodyhighsuggestedby35~70daysoldimmunemethodtoclassicalswinefevervaccine;whenthelowIV maternalantibodysuggestedtoimmuneswinefevervaccine,livewith20~60daysoldimmunemethod.Classicalswinefeverlivevaccinedosesofhogcholeraantibodylevelhaslittleeffect,butinlargedose(RID>150000)ontheimmunetoquicklyproduceantibodies.WhenthepigPRRSdisease,swinefeverantibodylevelofpigsafter90dayssignificantlyaffected.KeyWords:SwineFeverAntibody;ImmuneTime;ImmuneDose;PRRSV 常用缩写词缩写英文释义中文释义dDay日龄RIDRabbitInfectionDose兔体感染量ELISAEnzyme-linkedimmunosorbentassay酶联免疫吸附测定CSFVClassicalswinefevervirus猪瘟病毒OIEOfficeofInternationalEpizootics世界动物卫生组织nmnanometre纳米ORFOpenReadingFrame开放式阅读框PCRPolymeraseChainReaction聚合酶链式反应RNARibonucleicAcids核糖核酸RT-PCRreversetranscription-PCR反转录聚合酶链式反应TCID50Tissuecultureinfectivedose半数组织培养感染剂量mAbmonoclonalantibody单克隆抗体BVDVBovineviraldiarrhea-mucosalvirus牛病毒性腹泻病毒AbAntibody抗体mLmilliliter毫升minminuter分钟VI 目录1前言.............................................................................................................................11.1猪瘟病毒概述..........................................................................................................11.2猪瘟的致病机理和我国猪瘟的发病特点.............................................................11.3猪瘟抗原检测方法的研究.....................................................................................21.3.1兔体交叉免疫法..................................................................................................21.3.2抗原捕获的酶联吸附试验（ELISA）..............................................................31.3.3PCR方法..............................................................................................................31.3.4细胞培养法..........................................................................................................31.3.5直接蚀斑法..........................................................................................................31.4抗体检测方法.........................................................................................................41.4.1免疫荧光抗体中和实验......................................................................................41.4.2ELISA方法..........................................................................................................41.4.3正向间接血凝实验..............................................................................................41.4.4蚀斑法..................................................................................................................51.5猪瘟疫苗的研究进展.............................................................................................51.5.1猪瘟弱毒苗研究..................................................................................................51.5.2病毒活载体疫苗..................................................................................................51.5.3亚单位疫苗..........................................................................................................51.5.4标记疫苗..............................................................................................................61.5.5猪瘟活疫苗的生产制造研究..............................................................................61.6猪瘟综合防治措施的研究.....................................................................................61.6.1制定合理的免疫程序..........................................................................................71.6.2选用合适猪瘟疫苗..............................................................................................71.6.3定期进行猪瘟病毒抗原抗体的监测..................................................................71.6.4建立完善的生物安全防控系统..........................................................................81.6.5加强饲养管理，提高猪群抵抗力......................................................................81.7研究的目的和意义.................................................................................................82材料与方法................................................................................................................8VII 2.1材料.........................................................................................................................82.1.1疫苗毒株..............................................................................................................82.1.2主要试剂..............................................................................................................82.1.3主要仪器设备.......................................................................................................92.1.4生物统计软件及算法..........................................................................................92.2方法.........................................................................................................................92.2.1实验的技术路线..................................................................................................92.2.2猪瘟抗体水平的计算方法和意义.......................................................................92.2.3免疫时间对猪瘟抗体影响的实验方法............................................................102.2.4免疫剂量对猪瘟抗体影响的实验方法............................................................112.2.5猪场发生蓝耳病对猪瘟抗体水平影响的实验方法.........................................123结果与分析...............................................................................................................133.1免疫时间对猪瘟抗体的影响的试验结果与分析...............................................133.1.120~60d免疫组猪瘟抗体检测结果及分析......................................................133.1.235~70d免疫组抗体检测结果及分析..............................................................163.1.3免疫时间对猪瘟抗体影响的小结与讨论........................................................193.2免疫剂量对猪瘟抗体水平的影响实验结果与讨论............................................193.2.1免疫1头份与免疫6头份实验结果................................................................193.2.2免疫1头份和10头份猪瘟活疫苗对猪瘟抗体水平影响的结果与讨论......223.3猪场发生蓝耳病对猪瘟抗体水平的影响的实验结果.......................................263.3.1湖南A场的生产情况.......................................................................................263.3.2病原检测结果....................................................................................................273.3.3抗体检测结果.....................................................................................................273.3.4小结与分析........................................................................................................294讨论........................................................................................................................304.1关于免疫时间对猪瘟抗体水平的影响...............................................................304.2关于免疫剂量对猪瘟抗体的影响.......................................................................304.3关于猪场发生蓝耳病对猪瘟抗体水平的影响...................................................30全文总结......................................................................................................................31VIII 致谢......................................................................................................................32参考文献................................................................................................................34IX 1前言1.1猪瘟病毒概述猪瘟是由黄病毒科（Flaviviridate）瘟病毒属（Pestivirus）的猪瘟病毒（Classicalswinefevervirus,CSFV）引起猪的一种严重烈性传染病，主要造成猪体小血管的变性，从而引发组织器官的出血、坏死和梗死。1830年，猪瘟在美国中西部地区第一次发生并报道。该病毒在过去的100多年中传播到世界许多国家，对养猪业产生了较大的危害，世界动物卫生组织（OfficeInternationalDesEpizooties，OIE）将猪瘟列为必须上报的传染性疾病，我国也将猪瘟列为动物一类传染病。猪瘟也是目前影响我国猪场生产成绩的主要疫病之一，国家对猪瘟采取强制免疫的措施。许多发达国家都已经宣布消灭了猪瘟，我国也在上世纪60年代提出过消灭猪瘟计划，但几十年过去了，猪瘟仍然在我国的大部分地区流行。随着我国养猪业的规模化程度越来越高，猪瘟的发病特点也发生了较大的变化，多以非典型、慢性或者隐性的温和形式出现（姚文生等，2011）。目前我国规模化猪场普遍采用免疫兔化猪瘟活疫苗的方法来防制该病，整体猪瘟的免疫率较高。但是猪瘟疫苗的免疫仍然存在诸多问题，如免疫时间的选择，免疫剂量，免疫后抗体水平的监测等问题。猪瘟病毒的结构为球形，大小约40~60nm，核衣壳呈正二十面体，由3种结构蛋白构成囊膜。猪瘟病毒为单股正链RNA，长度12.5kb，包含了11个开放阅读框（ORF），编码4种结构蛋白分别为C、Erns、E1、E2和7种非结构蛋白分别为NS2-3、NS4A、NS4B、NS5A、NS5B、Npro和P7（胡建和等，2003）。1.2猪瘟的致病机理和我国猪瘟的发病特点猪群主要是通过采食和接触感染猪瘟病毒，病毒最先入侵定居的器官是扁桃体，随着病毒在猪的淋巴器官、内皮细胞和骨髓的增值，导致器官的出血、白细胞和血小板数量的减少。在急性或者慢性的病例常常可见脾脏的梗死、肠黏膜的坏死性溃疡等病理变化（陆承平，2001）。猪感染猪瘟病毒的过程主要分为：急性、亚急性、慢性和迟发型，潜伏的周期为1~15d（郝建伟，2009）。急性猪瘟感染康复后产生的抗体能够持续终身，中和抗体出现在感染后的14~28d。亚急1 性、慢性或迟发型往往表现为潜伏期长、临床症状不明显和感染病毒后只产生低抗体甚至不产生抗体等免疫抑制症状。近几年来，由于我国的规模化猪场已经大规模的免疫了猪瘟活疫苗，使得猪瘟的流行特点已经发生了显著的变化，主要以非典型、亚急性、慢性或者隐形感染为主，主要表现为无临床表现的母猪带毒垂直传播及猪群中水平传播。母猪感染了温和型的猪瘟病毒，不表现临床症状，但是持续性的散毒，通过胎盘把病毒垂直传播给仔猪，使得仔猪在胚胎时期就感染猪瘟病毒造成天然免疫耐受，在出生前就感染猪瘟病毒，并且水平传播给没有带毒仔猪从而造成仔猪的发病死亡，这种母猪带毒综合症是目前猪场猪瘟控制不稳定主要原因（王琴，2006）。仔猪先天感染猪瘟病毒，出生时会出现抖抖病的症状，有些仔猪不表现症状但是不断向外排毒，造成其他猪的感染。先天带毒猪不会产生猪瘟抗体，免疫猪瘟活疫苗效果较差。近年猪瘟与其他疾病的混合感染大多为多发，单一的猪瘟感染只占10%，2种或2种以上混合感染占了较大部分。猪瘟多与蓝耳病、圆环病和伪狂犬混合感染，并且猪群感染CSFV后易继发细菌感染，如猪肺疫、猪链球菌或者沙门杆菌等。目前在我国流行的猪瘟病毒中，主要流行基因2型的2.1和2.2型（王琴，2010），但是我国标准兔化弱毒疫苗属于1.1亚型（吕宗吉等，2001）。虽然我国近年来分离的基因2型猪瘟野毒株，与疫苗毒株的基因序列差异越来越大，但猪瘟兔化弱毒疫苗C株对所有的野毒感染都有免疫保护作用（吕宗吉等，2000）。1.3猪瘟抗原检测方法的研究1.3.1兔体交叉免疫法兔子对猪瘟病毒较敏感，猪瘟活疫苗的病毒含量单位叫做兔体感染量（RID），即利用兔子对猪瘟病毒有特异性的发热反应来判定是否含有猪瘟病毒。由于兔子感染猪瘟病毒后具有特症性的发热曲线（定型热），将病毒接种到兔体，1周后测量兔子体温，如果兔子体温正常则说明兔子没有感染猪瘟病毒（吴文福等，2009）；如果兔子体温反应呈现定型热则说明兔子感染猪瘟病毒。猪瘟活疫苗的单位就是根据这个原理，如1000兔体感染量就是指每头份稀释1000倍后感染兔体仍然有定型热出现。2 1.3.2抗原捕获的酶联吸附试验（ELISA）ELISA通过针对猪瘟病毒抗原蛋白上多个或者单个抗原蛋白的抗体与猪瘟病毒发生特异性的反应后通过酶标记显色，这种方法可以作为早期的诊断。其特点是自动化程度高，方便快捷。目前这种方法商业程度高，检测的材料可以是血清、全血和组织病料。但是这个方法也具有明显的缺点，容易出现假阴性，敏感性较低。所以这种方法比较适合出现临床症状的猪群或者出现了猪瘟病理变化的组织样品（张朝红等，2007）。1.3.3PCR方法PCR方法是目前检测病原最直接的方法，猪瘟病毒PCR检测主要集中在5’端非编码区。从血液或者组织病料中抽提RNA，利用RT-PCR方法扩增出目标4TCID片段，其敏感性能够达到1050。在利用PCR检测的过程中，牛黏膜性腹泻病毒（Bovineviraldiarrhea-mucosalvirus）对其干扰较大，为了提高该方法的敏感性，Katz等人设计了巢式PCR、套式PCR等方法。赵耘等有设计了多重PCR方法特异性引物，用于区分疫苗毒和野毒（赵耘等，2006）。PCR方法特点是特异性高和灵敏度高，但是只能定性不能定量，更加不能区分活病毒还是死病毒，并且同样存在假阳性的可能性。1.3.4细胞培养法采取CSFV复制的靶器官，如扁桃体等，在无菌条件下研磨成匀浆状，过滤取上清夜接入到猪肾细胞（PK）或者猪睾丸细胞（ST）等细胞中培养，可采用盲传几代的方法提高检出率（尚宏华等，2014）。将培养后的细胞采用酶标记抗体或者荧光抗体法染色观察。优点特异性强，只能检测出活的病毒，但是敏感性不高，时间长，实验条件要求高。1.3.5直接蚀斑法将含有CSFV的血清或者病毒接种到PK15上然后使用琼脂覆盖。如果有CSFV时，用间接光源观察，单层细胞出现蚀斑，用中性红色染色剂染色后会更加明显出现白斑（杨晓林，1987）。这种方法的有点是可以检测到是否活病毒，可以定量分析，但是特异性和重复性较差。3 1.4抗体检测方法1.4.1免疫荧光抗体中和实验待PK-15细胞培养到70%~80%，待检血清经过30min、56°C灭活后与定量的病毒液混合后接种到PK-15细胞。48h后，用荧光抗体染色或者酶标记显色法进行观察，观察到荧光染色或者显色判定为阳性。这种方法特异性强，检测到都是中和抗体，相关性高，是猪瘟抗体的金标准（孙海燕等，2009）。1.4.2ELISA方法ELISA方法是目前检测猪瘟抗体最常用的方法之一，商业化程度高。根据特异性的情况，可分为竞争性ELISA、间接ELISA和阻断ELISA。商品化的ELISA检测试剂盒主要是以杆状病毒重组表达的gp5（E2）蛋白为抗原。竞争性ELISA为了增加其特异性利用猪的血清抗体和猪瘟特异性单克隆抗体对E2的竞争结合的原理（徐璐等，2012）。目前国内外商业化的试剂盒主要为单克隆抗体（mAbs）试剂盒，以CSFV的E2蛋白作为抗原。每2个Mabs可以识别1个E2蛋白的表位，而其中1个Mabs包被在96孔板上，另外1个Mabs结合过氧辣酸根酶（HRPO）。在血清中没猪瘟抗体的情况下，包被板中的Mabs将与加入的CSFVE2基因表达的抗原结合，在HRPO和显色剂的作用下显色；但当血清中含有猪瘟抗体的时候，CSFVE2蛋白先与猪瘟的抗体结合，Mabs不与CFSVE2基因表达的抗原结合，造成包被板不会显色（吴秀娟等，2015）。因此用这种方法检测出来的猪瘟抗体叫做猪瘟的阻断抗体，也叫猪瘟抗体阻断值。目前市场上使用的试剂盒主要有IDEXX公司的猪瘟抗体检测试剂盒、韩国JBT公司、韩国Anigan公司的猪瘟试剂盒（熊丁杰，2010）。本文使用的IDEXX公司和韩国JBT公司的试剂盒都是采用这种阻断ELISA方法原理。这种方法的优点在于简单方便，可以定性定量，特异性高。缺点是假阴性率较高。1.4.3正向间接血凝实验该方法主要是将猪瘟活疫苗病毒按照一定比例与绵羊的红细胞制备成一种特殊致敏抗原。含有猪瘟抗体的血清可与致敏的抗原结合，发生特异的反应出现抑制红细胞凝聚的现象。通过肉眼观察凝聚的孔数来判定猪瘟抗体的滴度。目前主要由兰州兽医所有商品化的试剂盒提供。该方法的优点在于，操作简单方便，4 快速出结果且成本便宜，可以广泛使用；缺点在于特异性差（沈绍新等，2009）。1.4.4蚀斑法该方法是利用猪瘟病毒能够中和猪瘟抗体的反应原理建立起来的一套方法。用定量的猪瘟病毒与待检血清混合，接到单层的PK-15细胞中。如果没有产生蚀斑表明有猪瘟抗体，如果存在蚀斑表明没有抗体。这种方法可以定性定量，但是要求条件相对较高。1.5猪瘟疫苗的研究进展1.5.1猪瘟弱毒苗研究利用兔子对猪瘟病毒异常的敏感这一特性，国内外通常采用兔化方法来致弱CSFV获得疫苗候选株。目前中国普遍使用的C株疫苗就是采用强毒株石门系兔化方法而成。此外，还有日本的弱毒GPE疫苗和法国Thireval疫苗都是优秀的猪瘟疫苗。中国的兔化弱毒疫苗是较安全的疫苗，免疫原性强，保护时间长，基本上对猪无致病性，免疫后可以抵挡强毒的攻击，且猪能够产生较好的细胞免疫和体液免疫（仇华吉等，2005）。但是作为弱毒疫苗存在对温度敏感，保存条件高，不易运输保存等缺点；另外，此种疫苗产生的抗体与野毒产生的抗体较相似，无法区分疫苗毒和野毒，对猪瘟的净化和猪只选育不利。1.5.2病毒活载体疫苗将猪瘟病毒的Erns、E2等基因片段插入或重组到活的载体病毒中，通过载体病毒来表达猪瘟的基因蛋白从而产生特异性抗体（Voigtetal,2007）。常用的载体病毒有伪狂犬病毒、痘病毒、杆状病毒和腺病毒。病毒活载体技术突破了传统的弱毒疫苗研究局限，打开了使病毒致弱更加便捷简单的道路（王春花等，2013）。1.5.3亚单位疫苗猪瘟亚单位疫苗就是将猪瘟病毒的一个或者多个片段重组到其他病毒或者细菌载体上表达出单个或者多个抗原片段。较常用的是猪瘟的E2基因片段，使其重组到其他病毒或细菌中，产生大量E2抗原蛋白，经过纯化后加入到佐剂后免疫到猪只，产生特异性的E2抗体从而阻断猪瘟病毒的入侵（Tarradasetal,2010）。但E2亚单位疫苗不能使猪只获得完全的保护，也不能抑制猪的排毒。5 1.5.4标记疫苗由于C株兔化弱毒疫苗免疫猪只后产生的抗体与野毒感染产生的抗体较相似，不能从血清学上加以区分，因此标记疫苗的目的在于用血清学的方法来区分疫苗抗体和野毒抗体。近年来开展的标记疫苗的研究都是对C株E2或E0蛋白抗原结构重建改造，改造后的病毒产生的E2抗体就可以使用简单的商品化的血清学检测方法加以区分（王春花等，2013）。1.5.5猪瘟活疫苗的生产制造研究最早的C株兔化弱毒疫苗是采用兔的组织来生产即猪瘟兔化弱毒组织疫苗（脾淋苗），该工艺最早在出现于20世纪50年代，到目前为止仍有生产和使用。随着生产技术的发展，特别是细胞培养技术的发展，猪瘟活疫苗生产又产生了新的工艺，就是通过敏感的原代牛睾丸细胞来生产猪瘟活疫苗（细胞源）（熊丁杰，2010）。上世纪80年代后采用原代牛睾丸细胞进行生产，但是由于牛群牛病毒性腹泻病毒（BVDV）感染率较高，因此猪瘟疫苗的生产常因为BVDV污染的问题导致生产不稳定；而且采用原代的牛睾丸细胞生产猪瘟病毒时，容易受到原材料的影响导致猪瘟疫苗的病毒滴度不高，批间差异较大，生产不稳定。在2008年，广东永顺生物制药公司与中国兽药监察所合作采用新的工艺：利用猪的睾丸传代细胞（ST）生产猪瘟活疫苗。该项技术解决了细胞的BVDV污染问题、病毒滴度批间差异问题，显著提高了猪瘟活疫苗的质量（宁宜宝，2008）。这种新的生产工艺技术生产出来的疫苗叫做猪瘟活疫苗（传代细胞源）。用猪的传代细胞生产的猪瘟活疫苗比之前的牛睾丸细胞生产的疫苗病毒滴度高20倍以上。目前传代细胞源的猪瘟活疫苗国家标准为7500RID，比普通的牛睾丸细胞源猪瘟活疫苗的750RID高出10倍。1.6猪瘟综合防治措施的研究我国在20世纪50年代就研发了猪瘟兔化弱毒活疫苗C株，该猪瘟弱毒疫苗安全性和免疫效果好，被中国和其他国家大量的应用，取得了良好的防制效果。许多国家，特别是西方发达国家通过疫苗免疫和净化的方法消灭了猪瘟，但是由于我国的地广，猪群分散等特殊国情，猪瘟一直没有被消灭。CSFV在我国也不断演化，从以前流行的基因1型强毒株，到目前流行的基因2型为主的毒株。猪瘟的流行情况和发病特点也发生了较大的变化，如母猪的妊娠带毒综合症、多种6 疾病混合感染、仔猪免疫耐受、CSFV的垂直传播和持续的水平感染。另外，蓝耳病、圆环病毒病、伪狂犬病等病的暴发导致猪瘟免疫失败现象更加普遍。猪瘟的防制是一个系统工程，国家投入了大量的人力物力来研究猪瘟问题。近年来猪场发生猪瘟的问题已经比起以前已经大为减少，但是离消除猪瘟还有较长的一段路要走。猪瘟的防控是一项综合性措施，应该按照猪瘟流行及发病特点综合防治。1.6.1制定合理的免疫程序中国的猪瘟活疫苗是世界上公认安全有效的猪瘟疫苗，疫苗的效果不用质疑。合理的免疫程序可以缩短免疫空白期，达到最佳的免疫效果。制定合理免疫程序关键是了解本场仔猪的母源抗体情况，尽量避开母源抗体的干扰作用。商品猪应该在出栏前做2次以上的猪瘟免疫，每次的间隔约30d左右。种猪群根据本场的实际情况，采用普免或者是跟胎的方式进行免疫。1.6.2选用合适猪瘟疫苗中国猪瘟活疫苗都是中国兽药监察所提供的C株活疫苗，但是按照生产工艺来区分。国内的猪瘟活疫苗以下几类。（1）猪瘟活疫苗（脾淋组织），含有的脾脏等淋巴因子对猪瘟疫苗有免疫增强作用，但其由于生产工艺落后，具有易受外源病毒的污染、容易过敏反映，病毒含量低等缺点。（2）猪瘟活疫苗（细胞源）：用牛睾丸原代细胞生产，病毒滴度低，过敏反应少，容易有BVDV等外源病毒污染，批间差异大。（3）猪瘟活疫苗（传代细胞源）：采用猪睾丸传代细胞生产，具有过敏反应少，病毒滴度高等优点（刘刚等，2011）。猪场猪瘟疫苗的选用应当地CSFV的流行情况，选用合适的猪瘟疫苗。一般如果猪瘟生产情况稳定，无其他疫病影响下可以选用病毒含量低的细胞源猪瘟疫苗，如果猪场生产情况不稳定，存在免疫抑制性疾病的危害的情况，应选用高效的传代细胞源猪瘟疫苗或是脾淋苗。1.6.3定期进行猪瘟病毒抗原抗体的监测规模化猪场一定要定期监测猪瘟的免疫效果和猪瘟病原的变化。一般建议规模化猪场进每年2到3次的系统检测猪瘟抗体水平，及时的查漏补缺，调整免疫程序。建议种猪群猪瘟抗体阳性率要达到90%以上，商品猪在后期要达到85%以上。为了防止猪瘟出现异常，对引种回来或者自留种的后备猪猪瘟抗体要达到标准后才能配种，确保切断猪瘟病毒垂直传播。7 1.6.4建立完善的生物安全防控系统完善的生物安全，可有效的消灭传染源，切断传播途径，对于猪瘟的防制具有重要的意义。生物安全主要体现在以下几个方面：（1）高度重视引种环节，引种是CSFV传入的重要环节。了解引种猪场的猪瘟免疫情况和猪瘟病原情况，建议在引种前做好猪瘟抗体的筛查，对猪瘟抗体阴性猪不能引种。（2）重视生产环境的消毒和防控。定期消毒、进入生产区更衣消毒、定期灭鼠灭蚊，人员不要随便走动。（3）做到全进全出，切断猪瘟的水平传播。（4）对散养的户，在外地抓猪苗回来饲养，建议第一时间要免疫注射猪瘟疫苗。1.6.5加强饲养管理，提高猪群抵抗力严格按照科学的饲养管理方法来饲养，保持良好的猪舍环境卫生和合理温度湿度，使猪群保持良好的健康状态。在饲养过程中，尤其需要高度重视黄曲霉素超标的问题，其容易导致免疫低下，猪瘟抗体水平降低。1.7研究的目的和意义目前绝大部分猪场都有采用免疫猪瘟活疫苗的方式来防控猪瘟。但是如何评价猪场猪瘟的防控效果，较多猪场场长和技术人员不了解。在使用猪瘟活疫苗过程中，基层防疫人员和技术员，经常会遇到3个问题：（1）什么时候免疫；（2）需要多少剂量；（3）为什么免疫后还是没有抗体。有些猪场存在随意首免和随意加量的情况，对猪瘟疫苗的使用缺乏科学的依据。本文就基层防疫中最关心的3个问题出发，设计了猪瘟活疫苗的免疫时间、免疫剂量和猪场发生蓝耳病情况下对猪瘟抗体水平影响的实验。通过实验科学解答基层猪瘟防疫遇到的问题。2材料与方法2.1材料2.1.1疫苗毒株猪瘟活疫苗（传代细胞源），广东永顺生物制药股份有限公司提供，每头份兔体感染量为>15000RID，批号：2015004、2015008。猪瘟活疫苗（细胞源），广东永顺生物制药股份有限公司生产，每头份兔体感染量>750RID。2.1.2主要试剂猪瘟抗体检测试剂盒（CSFV-Ab）为IDEXX公司产品。8 猪瘟抗体检测试剂盒（CSFV-Ab）为韩国JBT公司产品。2.1.3主要仪器设备MK3型酶标仪（ThermoScientific公司）荧光定量PCR仪器（Abbottm2000rt）TGL-16C高速离心机（上海飞鸽公司）ELx50微孔板全自动洗板机（BioTek公司）MiniProtean3Dodeca电泳仪（Bio-rad公司）2.1.4生物统计软件及算法2.1.4.1统计学软件用SPSS软件和EXCEL软件进行统计。2.1.4.2阻断ELISA抗体阻断值算法猪瘟抗体检测试验（阻断ELISA）成立条件：阴性对照的平均OD450值应大于0.50，阳性对照的阻断率应大于50%，试验方成立有效。样品阻断率=（阴性对照平均OD450值－样品OD450）/阴性对照平均OD450×100%。被检样品的阻断率大于或等于40%，该样品为猪瘟抗体阳性；样品阻断率小于或等于30%，该样品为阴性（无猪瘟抗体存在）；样品阻断率在30%~40%，该样品为可疑。2.2方法2.2.1实验的技术路线本次实验首先按照实验目的选择不同情况的猪场和猪群免疫猪瘟活疫苗，之后在免疫前后采血检测猪瘟抗体阻断值，从而计算出猪群的猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度，再通过统计学的差异性（T检验）方法进行比较。2.2.2猪瘟抗体水平的计算方法和意义2.2.2.1猪群猪瘟抗体阻断值均值猪群猪瘟抗体阻断均值=各个样品阻断值的算术平均数。该指标主要反映猪群整体的猪瘟抗体阻断值的高低，抗体阻断值越高，表明猪群的抗体水平阻断值整体越高。2.2.2.2猪群猪瘟抗体阳性率猪群猪瘟抗体阳性率，阻断值大于等于0.4的样品数占整个样品数的百分比。该指标主要反映猪群整体中猪瘟抗体阳性占有比率，可以显示猪群整体的猪瘟免9 疫情况。阳性率越高，表明猪群整体猪瘟抗体水平好。2.2.2.3猪群猪瘟抗体阻断值离散度离散度=猪群各个样品的标准差除以各个样品的算术平均数。该指标主要反映猪群个体间猪瘟抗体差异情况。离散度越小，猪群个体猪瘟抗体阻断值差异越小。2.2.3免疫时间对猪瘟抗体影响的实验方法2.2.3.1试验场和试验猪的选择选取广州周边地区的使用广东永顺生物制药股份有限公司猪瘟活疫苗（传代细胞源）的规模化猪场，猪场生产情况稳定，无疫病的暴发。2.2.3.2实验分组选取采用20~60d免疫方法的规模化猪场2个分为A场和B场，35~70d规模化猪场2个分为C场和D场。其中A场和C场，种猪是采用跟胎的方式免疫，B场和D场的猪种为普免形式，1年免疫3次。这些猪场商品猪均为单次免疫剂量1头份。按照商品猪的生长周期分阶段采血1次，每个阶段采血约10份，送实验室分离血清用ELISA方法检测猪瘟抗体，并计算出各个阶段猪瘟抗体的阻断均值、阳性率和离散度。2.2.3.320~60d免疫组采血方案表120~60d免疫方法采血表采血20d左右40d左右60d左右90d左右120d阶段（首免前）（二免前）（二免前）（二免后30d）（二免后60d）惠州博10份10份10份10份10份罗A场清远B10份10份10份10份10份场2.2.3.435~70d免疫组采血方案表235~70d免疫方法采血表猪场名称35d左右70d左右100d左右120d（首免前）（二免前）（二免后30d）（二免后50d）采血阶段C10份10份10份10份D10份10份10份10份10 2.2.3.5采血与血清分离采用前腔静脉采血置于无菌管中，斜放静置析出血清，血清量>0.7mL。2.2.3.6抗体检测步骤按照IDEXX公司CSFV-Ab试剂盒说明书进行2.2.4免疫剂量对猪瘟抗体影响的实验方法2.2.4.1猪场免疫1头份和6头份对猪瘟抗体的影响2.2.4.1.1试验选场和分组共选择了1个规模化的猪场，猪场生产稳定无疫病发生。该场免疫广东永顺正文制药股份有限公司生产的猪瘟活疫苗（细胞源），每头份兔体感染量不少于750RID。本次试验，在该场选择20~30d各6窝，每3窝约30头为1组。每个场的各组分别免疫猪瘟疫苗1头份和6头份（如表）。表3分组表场名免疫1头份组号免疫6头份组号惠州猪场AB2.2.4.1.2试验步骤试验分为5个部分：（1）在20~25d之间采血1次；（2）在25d免疫猪瘟疫苗；（3）50~60d第2次采血；（4）在60d第2次免疫；（5）在90d时候第3次采血。每次采血15份，按组随机采血。2.2.4.1.3采血方式采用前腔静脉采血，每次血清量不少于0.7mL。将血清送实验室进行ELISA检测。2.2.4.1.4抗体检测方法本次试验使用韩国JBT试剂盒对血清进行猪瘟抗体检测，检测步骤严格按照说明书进行。2.2.4.1.5检测结果判定猪瘟抗体检测试验（阻断ELISA）成立条件：阴性对照的平均OD450值应大于0.50，阳性对照的阻断率应大于50%，试验方成立有效。样品阻断率=（阴性11 对照平均OD450值－样品OD450）/阴性对照平均OD450×100%。被检样品的阻断率大于或等于40%，该样品为猪瘟抗体阳性；样品阻断率小于或等于30%，该样品为阴性（无猪瘟抗体存在）；样品阻断率在30%~40%，该样品为可疑。2.2.4.1.6试验结果统计每组免疫剂量在各个阶段采血约15份，送实验室分离血清用ELISA方法检测猪瘟抗体，并计算出各个阶段猪瘟抗体的阻断均值、阳性率和离散度。2.2.4.2免疫1头份和10头份对猪瘟抗体的影响2.2.4.2.1实验步骤选取无猪瘟抗体的25头猪，将猪群分为3组：第1组10头，免疫剂量为1头份；第2组10头，免疫剂量为10头份；第3组为3头，作为空白对照，注射生理盐水。分别在免疫前7d、免后7d、免后14d、21d、28d、35d、72d，采血清分离血清用ELISA方法检测猪瘟抗体，并计算出每个采血时间点各组抗体均值、阳性率和离散度。2.2.4.2.2实验采血方法前腔静脉采血，采量3mL，分离大于0.7mL的血清。2.2.4.2.3猪瘟抗体检测按照IDEXX公司的CSFV-Ab说明书进行2.2.4.2.4实验结果判定检测结果判定：猪瘟抗体检测试验（阻断ELISA）成立条件为阴性对照的平均OD450值应大于0.50，阳性对照的阻断率应大于50%，试验方成立有效。样品阻断率=（阴性对照平均OD450值-样品OD450）/阴性对照平均OD450×100%。被检样品的阻断率大于或等于40%，该样品为猪瘟抗体阳性；样品阻断率小于或等于30%，该样品为阴性（无猪瘟抗体存在）；样品阻断率在30%~40%，该样品为可疑。2.2.5猪场发生蓝耳病对猪瘟抗体水平影响的实验方法2.2.5.1实验步骤及分组选择1个生产不稳定猪场，统计各个阶段的生产情况，并通过病原学检测其为蓝耳病不稳定的猪场，检测其商品猪各个阶段的猪瘟抗体的猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度，做成猪瘟抗体水平曲线与生产稳定的猪场猪瘟抗体曲线进12 行比较，得出之间的差异。2.2.5.2病原检测方法采用RT-PCR方法。2.2.5.3抗体检测方法用IDEXX公司生产的CSFV-Ab猪瘟抗体检测ELISA试剂盒和蓝耳病抗体ELISA试剂盒检测相应抗体。2.2.5.4结果判定2.2.5.4.1猪瘟抗体检测试验（阻断ELISA）成立条件阴性对照的平均OD450值应大于0.50，阳性对照的阻断率应大于50%，试验方成立有效。样品阻断率=（阴性对照平均OD450值-样品OD450）/阴性对照平均OD450×100%。被检样品的阻断率大于或等于40%，该样品为猪瘟抗体阳性；样品阻断率小于或等于30%，该样品为阴性（无猪瘟抗体存在）；样品阻断率在30%~40%，该样品为可疑。2.2.5.4.2蓝耳病病原阳性判定用RT-PCR的方法，提取血清中的RNA，扩增蓝耳病中的N和NSP2片段。N片段电泳呈阳性即为蓝耳病阳性，如果NSP2片段电泳后与经典毒株对照在同一位置判定为经典株阳性；如果NSP2片段电泳后与高致病性毒株对照在同一位置判定为变异株阳性。3结果与分析3.1免疫时间对猪瘟抗体的影响的试验结果与分析3.1.120~60d免疫组猪瘟抗体检测结果及分析3.1.1.120~60d免疫组惠州博罗A场检测结果如图1和表4可见：A场的在20d的时候母源抗体水平比较高，阳性率为80%，在免疫猪瘟疫苗20d后即40d时候抗体合格率反而下降到30%，均值也下降到0.26；在二免前即60d时候，抗体合格率上升到50%，均值上升为0.38；二免后1个月即90d的时候，抗体上升的幅度比较大均值为0.57，合格率为80%；二免后2个月，整体抗体阳性率为100%，均值为0.77。从整体看：猪瘟抗体阳性率在该场是为先下降后上升的情况，而抗体均值也是先下降后上升，离散度则相反先上升，后不断下降。13 表4A场20~60d免疫各个阶段猪瘟抗体阻断值、均值、阳性率和离散度样品20d40d60d90d120d10.730.160.520.630.7720.030.20.220.530.8430.430.230.210.570.8640.70.210.120.750.8550.860.310.320.840.5360.570.420.490.540.8370.870.520.430.350.8180.60.030.590.750.7290.290.380.390.320.69100.620.150.450.450.82阻断均值0.570.260.380.570.77阳性率80%30%50%80%100%离散度0.330.490.300.220.103.1.1.2A场各个阶段猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度图表1.210.80.60.40.2020d40d60d90d120d阻断均值阳性率离散度图1A场各个阶段猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度图3.1.1.320~60d免疫组B猪场检测结果3.1.1.3.120~60d免疫组B猪场整体猪瘟抗体水平检测结果如图2和表5可见：B场在20d时候，母源抗体相对低均值在0.35，阳性率为50%；免疫猪瘟疫苗20d后，均值（0.37）和阳性率（40%）开始轻微上升，离散度也稍微下降，在二免前即60d时阳均值0.46和阳性率70%，上升幅度大，14 离散度也下降大下降到0.19；在二免后30d，均值（0.69）和阳性率（100%）大幅度上升，离散度显著下降到0.12；在二免后60d，也就是120d时候，均值（0.75）和阳性率（100%）与90d相差不多，离散度也维持在0.1左右。表520~60d免疫组B猪场检测猪瘟抗体水平样品20d40d60d90d120d10.320.270.430.730.8320.030.390.530.740.8430.430.230.360.590.7840.350.560.420.650.8550.650.310.320.710.6460.430.420.730.840.7670.450.520.440.470.8180.570.150.510.690.6390.110.360.290.570.59100.190.470.580.860.72阻断均值0.350.370.460.690.75阳性率50%40%70%100%100%离散度0.390.330.190.120.103.1.1.3.2B场各个阶段猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度图1.210.80.60.40.2020d40d60d90d120d阻断均值阳性率离散度图2B场各个阶段猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度15 3.1.1.420~60d免疫组小结在采用20~60d免疫的2个猪场的商品猪猪瘟抗体水平上来看，2个场的猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度变化趋势曲线较相似，都是从高到低再逐渐上升的变化趋势。A猪场种猪是采用跟胎的方式免疫。种猪在产前40d时候免疫1次猪瘟活疫苗，所以母源抗体相当较高，在20d左右免疫猪瘟活疫苗的时候母源抗体干扰相对明显（孟晓琴等，2013），在40d时候，较明显看到母源抗体干扰的现象，之后猪瘟抗体水平不断的上升，达到顶峰。B猪场种猪是采用普免的方式免疫，种猪1年免疫3次，所以在20d的时候母源抗体相对较差，在20d左右免疫猪瘟活疫苗的时候，母源抗体干扰相对不明显；在40d的时候，猪瘟抗体水平达到比较理想，经过二次免疫之后猪瘟抗体水平不断上升达到顶峰。对于20~60d免疫的猪场，种猪群应采用普免的方法，预防在20d的时候母源抗体太高导致猪瘟的免疫失败。在30~60d这个阶段，猪群猪瘟抗体水平没有达到80%以上也是合理的，因为存在母源抗体的干扰作用，而并不是疫苗效价的问题（Soosetal,2001）。3.1.235~70d免疫组抗体检测结果及分析3.1.2.135~70d免疫组C场检测结果3.1.2.1.135~70d免疫组C场猪瘟抗体检测结果如图3和表6所示：C场在35d即首免前，母源抗体已经较低，只有0.21阳性率只有20%，免疫1次猪瘟活疫苗后即70d时，猪瘟阻断均值（0.49）和阳性率（80%）都显著上升，离散度显著下降；二免后30d，即100d时，猪瘟抗体阻断均值达到顶峰（0.78），阳性率为100%，离散度下降到0.1；二免后50d，即120d时，猪瘟抗体均值（0.77）、阳性率（100%）和离散度0.08与100d相差无几。16 表6C场整体阻断值检测结果样本35d70d100d120d10.310.340.740.6720.430.490.690.8130.230.480.850.7440.120.570.910.7350.410.450.850.6960.180.60.670.8170.040.650.780.7880.080.410.820.8690.010.340.730.76100.250.580.750.84阻断均值0.210.490.780.77阳性率20%80%100%100%离散度0.710.220.100.083.1.2.1.2C场各阶段的阻断均值、阳性率和离散度图1.20.80.710.60.80.50.60.40.30.40.20.20.10035d70d100d120d阻断均值阳性率离散度图3C场各阶段的阻断均值、阳性率和离散度图3.1.2.235~70d免疫组D场检测结果3.1.2.2.135~70d免疫组D场猪瘟抗体阻断值检测结果如图4和表7所示：D场在35d时母源抗体相当低，基本上已经没有母源抗体，猪群猪瘟抗体的离散度大，达到了0.59；在首免1个月后，即70d时候，17 猪瘟抗体水平显著上升，阻断均值达到了0.56，阳性率上升到80%，离散度显著下降到0.24水平；二免后1个月，即100d时猪瘟抗体水平显著上升，阻断均值达到0.69，阳性率90%，离散度下降到0.2；120d时猪瘟抗体阻断均值、阳性率达到了顶峰，离散度达到最低。表7D场各个阶段猪瘟抗体阻断值样本35d70d100d120d10.230.530.830.7620.210.470.740.7830.120.580.670.8540.180.670.680.950.020.720.730.8460.180.320.740.8370.040.590.820.7380.30.640.760.6990.250.380.370.71100.40.660.530.56阻断均值0.190.560.690.77阳性率10%80%90%100%离散度0.590.240.200.133.1.2.2.2D场各个阶段猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度曲线变化图示1.210.80.60.40.2035d70d100d120d阻断均值阳性率离散度图4D场各个阶段猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度曲线变化图18 3.1.2.335d~70d免疫组小结C场和D场两个猪场的猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度变化曲线都较相似。在35d时，无论是种猪群跟胎免疫的C场还是采用一年3次普免方式的D场，母源抗体水平已经是相当低。此时免疫猪瘟活疫苗没有母源抗体的干扰，所以抗体水平上升的较的快。经过第二次免疫后，猪群猪瘟抗体水平都达到了高峰。D场在100d时候仍然有10%不合格，可能与该场在70d第二次免疫的时候漏打有关系。3.1.3免疫时间对猪瘟抗体影响的小结与讨论20d首免的时候，母源抗体普遍比较高，在40d到60d的时候猪瘟抗体的均值和合格率都比较低，第二次免疫之后达到了100%阳性率。对于20~60d的免疫程序来讲，首免后30d的抗体水平是处于相对低的阶段。对于35~70d免疫程序的猪场，因为母源抗体在断奶后会出现塌方式的下降，在35d首免受到母源抗体的抗体干扰较小，在首免后猪瘟抗体水平上升幅度大，阳性率也高。无论是20~60d法，还是35~70d法的猪场，猪群中还是存在较大一部分猪瘟抗体呈阴性的猪，这可能与检测试剂盒的敏感性有关。猪瘟活疫苗在免疫后在机体内首先是激活细胞免疫，首次免疫的抗体主要是以IgA为主，而大部分猪瘟抗体ELISA检测试剂盒是以检测IgG的抗体蛋白，这样导致在第一次免疫后有一部分猪的猪瘟抗体检测不到。3.2免疫剂量对猪瘟抗体水平的影响实验结果与讨论3.2.1免疫1头份与免疫6头份实验结果3.2.1.1惠州猪场免疫1头份猪瘟活疫苗的猪瘟抗体检测情况如表8所示：免疫1头份猪瘟活疫苗在免疫前20d时候，母源抗体比较高阻断均值为0.59，阳性率为86%，第1次免疫后30多日即60d，阻断均值轻微上升到0.63，阳性率上升到86%，离散度显著下降到0.37；二免后30d，即90d时，阻断均值达到0.85，阳性率为100%。19 表8免疫1头份猪瘟疫苗的猪瘟抗体阻断值样品20d60d90d10.940.960.820.840.960.8130.960.310.7140.890.990.6850.860.510.8760.880.890.7370.260.60.9280.810.680.9890.180.680.99100.060.280.94110.790.520.93120.160.490.9130.510.580.86140.330.60.87150.350.390.79阻断均值0.590.630.85阳性率60%86%100%离散度0.560.370.113.2.1.2免疫6头份猪瘟疫苗组的猪瘟抗体阻断值结果如表9所示：免疫6头份组在首免前母源抗体较高，阻断均值达到0.57，阳性率为93%，离散度也高为0.45。首次免疫猪瘟疫苗后30多日后，即60d时，猪瘟抗体整体阻断均值达到0.58，阳性率为93%，离散度显著下降到0.18；二免后30d猪瘟抗体阻断均值显著上升到0.86，阳性率为100%，离散度只有0.19。20 表9免疫6头份猪瘟抗体阻断值样品20d60d90d10.510.510.9820.420.420.9930.650.680.9440.330.560.9350.430.590.960.130.390.8670.690.560.9680.520.790.8290.860.520.33100.830.710.86110.850.520.91120.880.590.75130.870.660.94140.170.580.89150.390.560.88阻断均值0.570.580.86阳性率73%93%100%离散度0.450.180.193.2.1.3免疫1头份和免疫6头份组别的T检验结果如表10所示：免疫1头份和免疫6头份组，在20、60和90d，数据进行比较，均无差别（P值<0.05），差异不显著。表101头份和6头份组别各个阶段T检验20d60d90dT检验P值0.8830.2390.856<0.05否否否3.2.1.3免疫1头份与免疫6头份实验小结与讨论首先此次实验的检测是采用韩国JBT的试剂盒检测，检测的结果从阻断值和阳性率均高于之前IDEXX的试剂盒，这可能与2种试剂盒之间的敏感性不一致所导致。其次免疫1头份和免疫6头份组别的阻断均值、阳性率和离散度的变21 化规律都一致，符合本文提到的20~60d免疫法的曲线变化。再者无论是免疫1头份还是免疫6头份，第1次免疫之后抗体阻断值升幅都不大，但是离散度下降明显。无论免疫1头份还是免疫6头份，在猪群中抗体水平的差别不大，免疫效果一样。3.2.2免疫1头份和10头份猪瘟活疫苗对猪瘟抗体水平影响的结果与讨论3.2.2.1免疫前后不同时间的抗体检测结果22 表11免疫前后不同时间点猪瘟抗体检测结果免疫前7免疫后7免疫后免疫后免疫后免疫后35免疫后分组猪号dd14d21d28dd72d20.05(－)0.18(－)0.49(＋)0.44(＋)0.58(＋)0.57(＋)0.71(＋)30.00(－)0.00(－)0.35(±)0.39(±)0.48(＋)0.51(＋)0.81(＋)70.00(－)0.00(－)0.50(＋)0.34(±)0.52(＋)0.59（＋）0.80（＋）120.00(－)0.00(－)0.26(－)0.21(－)0.50(＋)0.57（＋）0.83（＋）5140.00(－)0.00(－)0.53(＋)0.47(＋)0.61(＋)0.59(＋)0.78(＋)1头份/只5170.00(－)0.00(－)0.36(±)0.31(±)0.48(＋)0.51(＋)0.82(＋)5200.15(－)0.00(－)0.15(－)0.59(＋)0.65(＋)0.57(＋)0.73(＋)3720.030.00（-）0.35(±)0.44(＋）0.59（＋)0.67(＋)0.79(＋)4530.040.05（-）0.30(±)0.49(＋）0.56(＋)0.61(＋)0.71(＋)5670.000.00（-）0.26(－)0.34(±）0.50(＋)0.69(＋)0.80(＋)10.00(－)0.26(－)0.77(＋)0.78(＋)0.76(＋)0.72(＋)0.84(＋)40.00(－)0.13(－)0.73(＋)0.69(＋)0.73(＋)0.66(＋)0.78(＋)50.00(－)0.10(－)0.71(＋)0.78(＋)0.84(＋)0.90(＋)0.86(＋)60.00(－)0.12(－)0.53(＋)0.49(＋)0.68(＋)0.67(＋)0.80(＋)100.20(－)0.13(－)0.55(＋)0.43(＋)0.61(＋)0.58(＋)0.74(＋)10头/只5160.00(－)0.00(－)0.40(＋)0.51(＋)0.71(＋)0.72(＋)0.85(＋)5210.00(－)0.36(±)0.60(＋)0.64(＋)0.74(＋)0.76(＋)0.86(＋)3570.000.16（-）0.63(＋)0.70(＋)0.73(＋)0.75(＋)0.87(＋)3450.000.18（-）0.55(＋)0.68(＋)0.81(＋)0.80(＋)0.85(＋)4750.000.00（-）0.45(＋)0.64(＋)0.75(＋)0.73(＋)0.84(＋)10.000.000.000.000.000.000.00对照组20.040.020.000.000.020.000.0030.020.000.010.000.000.000.0023 3.2.2.2免疫1头份组的猪瘟抗体水平阻断均值、阳性率和离散度如表12所示：免疫1头份组在免疫前7d的猪瘟抗体基本为0，免疫后7d，抗体阳性率为0%，免疫后14d的阳性率为30%，阻断均值达到0.36；免疫后21d阳性率为60%、阻断均值为0.4，免疫后28d阳性率为100%、阻断均值为0.55，免疫后35d阳性率为100%、均值达到0.59，免疫后72d阳性率100%、阻断均值为0.78。表12免疫1头份组的猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度免疫后14免疫后21免疫后28免疫后35免疫后72免疫前7d免疫后7dddddd阻断均值0.0270.0230.3550.4020.5470.5880.778阳性率(%)003060100100100离散度1.762.490.340.270.110.100.063.2.2.3免疫10头份组猪瘟抗体水平阻断均值、阳性率和离散度如表13所示：免疫10头份组，免疫前7d天猪瘟抗体基本为0，免疫后7d，猪瘟抗体阻断均值为0.13、阳性率0%，免疫后14d阳性率为100%，阻断均值为0.47，免疫后21d阻断均值为0.62、阳性率100%，免疫后28d阻断均值达到0.73，免疫后35d，阻断均值为0.73，免疫后72d均值为0.83。表13免疫10头份组的猪瘟抗体阻断均值、阳性率和离散度免疫前7d免疫后7d免疫后14免疫后21免疫后28免疫后35免疫后72ddddd阻断均值0.020.130.570.620.730.730.83阳性率(%)00100100100100100离散度2.860.760.180.180.090.120.053.2.2.4免疫1头份和免疫10头份两组各个阶段猪瘟抗体均值比较图如图5所示：免疫10头份组在免疫后7d，猪瘟抗体阻断均值明显比1头份高；在免疫14d后，10头组明显高于1头份组；免疫21d后10头份组明显高24 于1头份组；在免后35d也是高于1头份；在免疫72d后，两者数值持平。图5免疫1头份和免疫1头份各个阶段猪瘟抗体均值比较3.2.2.5免疫1头份和免疫10头份组猪瘟抗体水平阳性率的比较1.210.80.60.40.20免疫前7d免疫后7d免疫后14d免疫后21d免疫后28d免疫后35d免疫后72d免疫1头份免疫10头份图61头份组和10头份组免疫后猪瘟阳性率比较如图6所示：免疫10头份组在免后14d，已经达到了100%阳性率，而免疫1头份组免后28d才达到100%。25 3.2.2.6免疫1头和免疫10头对猪瘟抗体水平影响的小结与分析免疫1头份组、免疫10头份组和对照组，在免疫前7d检测猪瘟抗体水平均为阴性，表明这些实验猪已经没有母源抗体，实验不存在猪瘟母源抗体干扰。同时免疫1头份组在免疫后7d，检测猪瘟抗体均无为阴性，而且抗体水平较低。而免疫10头组，检测猪瘟抗体均为阴性，但猪瘟抗体已经有明显的上升迹象，个别猪已经达到可疑的猪瘟抗体水平。此次实验的猪瘟活疫苗均为广东永顺生产的传代细胞源疫苗，每头份病毒含量达到了大于15000RID，1头份的免疫剂量为15000RID，10头份免疫剂量为150000RID。此次实验表明免疫1头份组的猪瘟抗体阳性率达到100%，要等到免疫后28d；而免疫10头份组的猪瘟抗体水平阳性率达到100%只要14d，明显10头份免疫剂量要产生抗体应答快于1头份，而抗体水平上升速度也快近1倍。此次实验反映当猪场已经发生猪瘟疫情的情况下，用超大剂量（大于150000RID）作为紧急接种保护未感染猪瘟野毒的猪只，是比较有效的。而且超大剂量10头份（大于150000RID）比1头份（大于15000RID）只能更快产生体液免疫，但2个剂量的抗体高峰值相同。3.3猪场发生蓝耳病对猪瘟抗体水平的影响的实验结果3.3.1湖南A场的生产情况表14湖南A场生产情况统计母猪情况产房保育育肥从断奶后10日开呼吸道情况较多始，20%~30%仔每周有3~4窝流仔猪健康，成活率约30%，猪只死猪出现消瘦、毛产达到97%亡少，成活率为松，耳尖发蓝迹95%象。成活率70%26 3.3.2病原检测结果表15湖南A场血清病原检测结果检测项目20d（混合）40d（混合）60d（混合）90d（混合）蓝耳病抗原阴性变异株阳性阴性阴性猪瘟抗原阴性阴性阴性阴性圆环抗原阴性阴性阴性阴性伪狂犬抗原阴性阴性阴性阴性如表15所示：该场病原检测在40d的血清混合中检测出蓝耳病变异株阳性，因为该场一直都是使用经典株蓝耳病疫苗，表明该场在40d时候存在蓝耳病病毒血症，与该场在该阶段出现蓝耳病临床症状相吻合。所以判定该场为一个蓝耳病发病场，发病时间在40d，即断奶后10多天。3.3.3抗体检测结果3.3.3.1猪瘟抗体检测结果表16猪瘟抗体检测结果样品20d40d60d90d10.640.730.370.4920.560.530.470.2130.350.270.260.4740.450.860.390.250.370.660.690.2760.560.310.560.270.280.340.440.7180.470.090.280.48阻断均值0.460.470.430.38阳性率62.50%50%50%50%离散度0.270.560.330.4927 3.3.3.2湖南A场猪瘟抗体水平曲线图0.70.60.50.40.30.20.1020d40d60d90d阻断均值阳性率离散度图7湖南A场各阶段猪瘟抗体均值、阳性率和离散度图如图7和表16所示：该场猪瘟抗体均值在20d、40d阶段与正常的20~60d免疫法的曲线比较符合，但是在60d和90d明显低于正常的20~60d免疫法的曲线。阳性率一直在50%左右，离散度在90d的时候出现反弹上升过程，且上升幅度大。在90d的时候猪瘟抗体阻断均值、合格率和离散度明显低于正常20~60d免疫法曲线。3.3.3.3湖南A场与正常的20~60d免疫法猪场A场各个阶段差异性比较（T检验）表17湖南A场与正常的20~60d免疫法猪场A场各个阶段差异性比较20d40d60d90dT检验（P值）0.2890.0450.4180.036如表17所示：湖南A场与本文提到20~60d免疫法的A场各个阶段猪瘟抗体阻断值差异性比较（T检验），20d时P值为0.289、40d时P值为0.045（<0.05）、60d时P值为0.418和90d时P值为0.036（<0.05），表明湖南蓝耳病不稳定场A场与正常的20~60d免疫法A场在40d和90d（p值<0.05）数据差异明显。28 3.3.3.4湖南A场与正常的20~60d免疫法的猪场B各个阶段差异性比较（T检验）表18湖南A场与正常的20~60d免疫法的猪场B各个阶段差异性比较20d40d60d90dT检验(P值)0.1990.2810.6660.001如表18所示：湖南A场与本文提到同样是20~60d免疫法的B场各个阶段猪瘟抗体阻断值差异性比较（T检验），20d的P值为0.199、40d的P值为0.281、60d的P值为0.666和90d的P值为0.001（<0.05），表明湖南蓝耳病不稳定场A场与正常的20~60d免疫法B场在90d（p值<0.01）数据差异相当显著。3.3.4小结与分析该场采用的是20~60d免疫猪瘟方法，且种猪采用普免的方式进行免疫，在20d时，猪场的猪瘟抗体水平较高阳性率也高。该场的蓝耳病一直是采用经典的进口疫苗在14d免疫，但是在40d血清中检测到蓝耳病变异株阳性，说明40d血清蓝耳病病原为野毒而非疫苗毒。该场的蓝耳病临床症状与蓝耳病病毒血症时间相吻合。表明该场为在保育阶段的死淘率高是由蓝耳病引起。该猪场商品猪各个阶段猪瘟抗体阻断均值变化不大，但是到90d均值只有0.38，低于0.4的阳性水平，离散度也大达到0.49，阳性率在90d只有50%。说明90d的猪瘟抗体水平较差。该场商品猪的20d、40d、60d和90d的猪瘟抗体阻断值与本文提到同样是20~60d方法免疫且生产正常的商品猪A场和B场的20、40、60和90d的猪瘟抗体阻断值数据进行差异性T检验比较，发现该场在20、60d与A、B场的差异性不大（p>0.05），该场的40d阶段与20~60d免疫法的A场40d阶段有差异（P<0.05），该场的90d阶段与20~60d免疫法的A场和B场的90d阶段均有显著差异（P<0.05），表明该场的90d阶段猪瘟抗体水平明显低于正常水平与正常水平差异大。该场40d、90d的猪瘟抗体阻断值与正常20~60d免疫法在该阶段的差异性，与该场蓝耳病的不稳定有关联。该场在40d阶段存在蓝耳病病毒血症，表明该场在40d阶段存在蓝耳病病毒感染。90d的猪瘟抗体水平阻断值不高与在40d感染蓝耳病病毒后机体的免疫抑制有关（万遂如，2009）。29 4讨论4.1关于免疫时间对猪瘟抗体水平的影响猪群在首免后的20~60d这个阶段检测猪瘟抗体水平，意义不大。这个阶段猪场的猪瘟抗体阻断阳性率30%~80%。猪群第1次免疫猪瘟活疫苗后主要是产生细胞免疫。第2次免疫猪瘟疫苗后，猪瘟抗体阳性率上升明显。因此建议猪场都采用2次免疫的方法免疫，中间间隔1个月左右。2次免疫可以减少漏打和猪群母源抗体干扰导致猪瘟免疫失败的情况。4.2关于免疫剂量对猪瘟抗体的影响猪瘟活苗的免疫是经过科学的设计，按照国家标准一般都是可以达到免疫的效果。免疫过多的头份数对猪瘟抗体的高低和阳性率没有过多的影响。但是在猪场发生猪瘟疫病的时候或需要采用紧急免疫方法来防控猪瘟时，免疫超大剂量的猪瘟疫苗可以达到比一般免疫剂量更快速产生猪瘟抗体。因此紧急接种需要超大剂量免疫（RID>150000）。4.3关于猪场发生蓝耳病对猪瘟抗体水平的影响当猪场发生蓝耳病时，商品猪或是种猪的猪瘟抗体会受到影响，可能是蓝耳病导致的免疫抑制症状有关。蓝耳病导致的免疫抑制不单单只影响猪瘟抗体，也可能会影响其他疫苗的抗体水平（如伪狂犬、口蹄疫）只是猪瘟抗体较多的猪场对其监测，能够检测出来而已。反过来，当猪瘟抗体在商品猪的后期明显低于正常水平时，猪场除了考虑猪瘟疫苗免疫不到位的情况，还要考虑是否有免疫抑制的现象。能够导致免疫抑制症状的可能是蓝耳病、饲料的霉菌毒素、伪狂犬病等疾病。这个需要通过其他临床症状佐证和实验室来确诊。猪场每年定期检测猪瘟抗体有好处，可以把猪瘟抗体这个指标当成猪群免疫状况的指示剂。30 全文总结猪场只要经过2次的猪瘟疫苗免疫之后，都等达到理想的抗体水平。但在母源抗体比较高的猪场，建议采用35~70d免疫法来免疫猪瘟活疫苗。对于母源抗体相对低的场建议采用20~60d免疫方法来免疫猪瘟活疫苗。猪瘟活疫苗的免疫剂量对猪瘟抗体水平的影响不大，但如果是采用超大剂量（RID>150000）免疫时能够快速产生抗体。当猪场发生蓝耳病时候，能够显著影响猪群90d后的猪瘟抗体水平。31 致谢时光飞驰，从报名入读专业硕士到现在即将毕业，重回校园学习专业知识，让我懂得了更多，学到了更多。值此论文结束之时，向各位老师和同学表达感激之意。首先向我的导师华南农业大学兽医学院任涛教授表达感激之情。感谢任老师对本人的关心与厚爱。对母校华南农业大学兽医学院专业硕士授课老师表示感谢。自从参加工作以来，在专业技能上遇到了很多难题，通过此次专业硕士的学习，让我解决了很多专业上的疑惑。感谢兽医学院提供较好的交流平台，让我有机会与同行做专业交流，使得我的专业技术能力得到较好的提升。感谢广东永顺生物制药股份有限公司的同事对我的指导。从06年本科毕业加入永顺这个大家庭，我从最基层的生产一线工人做起，让我学到了很多书本上学不到知识。长期从事猪瘟疫苗的生产、使用和研发，让我对兽医疫苗这个行业产生了热爱之情。本文有很多专业知识都是来自生产应用一线。其次，感谢广东永顺公司的客服实验室，提供了较好的实验平台让我操作锻炼。学习了很多专业基础知识，本文的实验都是在客服实验室完成。感谢实验室的张丽蓉、江鹏华、钟值文及何柳芬等同事的帮助。最后，还要感谢广东省农科院兽医研究所的老专家杜伟贤研究员、华南农业大学兽医学院刘镇明教授和永顺公司杨傲冰总监对我成长的帮助。感谢家人的支持。32 33 参考文献仇华吉,童光志,沈荣显.猪瘟兔化弱毒疫苗——半个世纪的回顾[J].中国农业科学,2005(08):1675-1685.郝建伟.规模化猪场猪瘟、猪伪狂犬病综合防控及净化[D].中国人民解放军军事医学科学院,2009.胡建和,陈永耀,王自良,等.新型猪瘟疫苗的研究和应用前景[J].中国兽医科技,2003(03):36-39.刘刚,姜海涛.猪瘟活疫苗的特点及使用[J].当代畜禽养殖业,2011(01):26-27.陆承平.《兽医微生物学》第三版[J].中国动物检疫,2001(07):30.吕宗吉,李红卫,涂长春,等.我国部分地区猪瘟病毒流行株的基因差异[J].中国兽医学报,2000(04):313-316.吕宗吉,涂长春,余兴龙,等.我国猪瘟的流行病学现状分析[J].中国预防兽医学报,2001(04):61-64.孟晓琴,曹世祯,卓春花,等.母源抗体对猪瘟疫苗免疫效果的影响[J].中国兽医杂志,2013(01):40-41.尚宏华,郭建平,谢秋梅.猪瘟活疫苗外源病毒BVDV细胞培养与PCR检测的比较[J].江西畜牧兽医杂志,2014(06):8-10.沈绍新,戴爱玲,李晓华,等.IHA与ELISA检测猪瘟病毒抗体的比较[J].动物医学进展,2009(09):20-23.孙海燕,王在时,戴志红,等.猪瘟抗体检测技术的研究现状及发展趋势[J].中国兽药杂志,2009(05):40-43.王春花,孙元,仇华吉.新型猪瘟疫苗研究进展[J].生物工程学报,2013(07):880-890.王琴.猪瘟病毒流行病学、病原致病特性及猪瘟综合防制研究[J].中国农业科技导报,2006(05):13-18.王琴.我国猪瘟的分子流行病学监测及防控[J].猪业科学,2010(01):82-84.吴文福,岑小清,任向阳.猪瘟兔化弱毒疫苗的研究概况[J].广东畜牧兽医科技,2009(06):6-8.吴秀娟,李凯航,杨显超,等.猪瘟病毒5种ELISA抗体检测试剂盒的比较[J].中国动物检疫,2015(05):78-81.34 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