《猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在学术论文-天天文库。
分类号：S855.3学校代码：10712UDC：636.09研究生学号：2013060158密级：公开级2018届攻读博士学位研究生学位（毕业）论文猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究学科专业：基础兽医学研究方向：动物病理研究生张樑指导教师：童德文教授完成时间：2018年4月中国陕西杨凌 Classificationcode:S855.3Universitycode:10712UDC:636.09Postgraduatenumber:2013060158Confidentialitylevel:PublicDissertationforDoctorDegreeNorthwestA＆FUniversityin2018MechanismsonporcinelutealcellsapoptosisandinhibitionofprogesteroneproductioninducedbyporcineparvovirusMajor:BasicVeterinaryMedicineResearchfield:AnimalPathologyNameofPostgraduate:ZhangLiangAdviser:Prof.TongDewenDateofsubmission:April,2018YanglingShaanxiChina 本研究由国家自然基金（No.31372401）陕西省重点科技创新团队（No.2013KCT-28）中央财政重大农业技术资金项目（No.3360217060）提供赞助ThisstudywassupportedbyNationalNaturalScienceFoundationofChina(No.31372401)KeyprojectofShaanxiprovincescienceandtechnologyinnovationteam（No.2013KCT-28）TheCentralGovernmentMajorAgriculturalTechnologyFundProject（No.3360217060） 研究生学位（毕业）论文的独创性声明本人声明：所呈交的博士学位（毕业）论文是我个人在导师指导下独立进行的研究工作及取得的研究结果；论文中的研究数据及结果的获得完全符合学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，如果违反此规定，一切后果与法律责任均由本人承担。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究结果，也不包含其他人和自己本人已获得西北农林科技大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同事对本研究所做的任何贡献均已在论文的致谢中作了明确的说明并表示了谢意。研究生签名：时间：年月日导师指导研究生学位（毕业）论文的承诺本人承诺：我的博士研究生所呈交的博士学位（毕业）论文是在我指导下独立开展研究工作及取得的研究结果，属于我现岗职务工作的结果，并严格按照学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》而获得的研究结果。如果违反学校《关于规范西北农林科技大学研究生学术道德的暂行规定》，我愿接受按学校有关规定的处罚处理并承担相应导师连带责任。导师签名：时间：年月日 关于研究生学位（毕业）论文使用授权的说明本学位（毕业）论文的知识产权归属西北农林科技大学。本人同意西北农林科技大学保存或向国家有关部门或机构送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅；同意西北农林科技大学将本学位（毕业）论文的全部或部分内容授权汇编录入《中国博士学位论文全文数据库》和《中国学位论文全文数据库》进行出版，并享受相关权益。本人保证，在毕业离开（或者工作调离）西北农林科技大学后，发表或者使用本学位（毕业）论文及其相关的工作成果时，将以西北农林科技大学为第一署名单位，否则，愿意按《中华人民共和国著作权法》等有关规定接受处理并承担法律责任。任何收存和保管本论文各种版本的其他单位和个人(包括研究生本人)未经本论文作者的导师同意，不得有对本论文进行复制、修改、发行、出租、改编等侵犯著作权的行为，否则，按违背《中华人民共和国著作权法》等有关规定处理并追究法律责任。（保密的学位论文在保密期限内，不得以任何方式发表、借阅、复印、缩印或扫描复制手段保存、汇编论文）研究生签名：时间：年月日导师签名：时间：年月日 猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究摘要猪细小病毒（porcineparvovirus，PPV）属于细小病毒科、细小病毒亚科、细小病毒属病毒，是引起母猪繁殖障碍的主要病原之一，临床表现为初孕母猪不孕、流产、产木乃伊胎和死胎等现象。PPV在全球大部分地区呈地方性流行，在未接种疫苗或疫苗接种不当的猪群中可造成毁灭性的流产风暴。大量研究报道，PPV感染可引起胎儿或仔猪的多种组织脏器发生损伤进而引起胎儿死亡或产弱仔等，并以此解释PPV诱导繁殖障碍的原因，但是，关于PPV感染对妊娠母体的影响却鲜有报道。卵巢黄体是建立和维持妊娠的重要组织，主要通过黄体细胞合成孕酮以维持正常的妊娠。已有研究报道，PPV感染可导致母体黄体组织受损，进而引起不孕和流产等病理现象的发生，但其具体作用分子机制尚不清楚。本研究首先建立永生化黄体细胞系，为后续研究提供可靠的细胞模型。然后用PPV分别感染原代和永生化猪黄体细胞，检测PPV感染诱导黄体细胞凋亡和凋亡信号转导通路，明确PPV感染抑制黄体细胞孕酮产生及相应机制。最后，PPV感染初孕母猪，从体内水平进一步验证PPV感染诱导黄体细胞凋亡的信号转导通路和抑制孕酮产生的机制。旨在从体外和体内水平探讨PPV感染诱导猪黄体细胞凋亡和对孕酮产生的影响，并解析其相关分子作用机制。研究取得以下结果。1取妊娠30~50d健康母猪的黄体组织，胶原酶消化法和密度梯度离心法对原代黄体细胞进行分离、纯化和培养。转染pCI-neo-hTERT质粒并用100μg/mLG418连续筛选获得单克隆细胞，对获得的单克隆细胞进行扩大培养和类固醇合成功能的检测，最终确定一株可连续传代50次且未发生衰老迹象并保存类固醇激素合成能力的细胞系，命名为hTERT-PLCs。RT-PCR和端粒酶检测结果显示，hTERT-PLCs中hTERT能够稳定表达且维持较高的端粒酶活性。核型分析结果显示，转染后30和50代的黄体细胞染色体均保持正常的二倍体结构形式。3β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色结果显示，与原代猪黄体细胞一致，hTERT-PLCs两种染色结果均呈阳性。透射电子显微镜观察结果显示，与原代猪黄体细胞超微结构一致，hTERT-PLCs的细胞间存在间隙连接，且其细胞质中都含有大量的线粒体和滑面内质网。RT-PCR检测结果显示，hTERT-PLCs稳定表达参与孕酮合成和降解过程中关键蛋白和酶的基因（STAR、HSD3B1、CYP11A1和AKR1C1），以及参与调控黄体细胞类固醇激素合成的一些特征性受体的基因（LHCGR、PGR、PRLR、ESR1和ESR2）。促黄体素（Luteinizinghormone，LH）和PGF2α（ProstaglandinF2α）类似物处理原代和永生化黄体细胞，结果显示LH处理后两种细胞中P450scc蛋白表达未发生显著变化（p>0.05），而StAR和3β-HSD蛋白的表达显著增加（p˂0.05）；同时，黄体细胞的孕酮产量均显著升高（p˂0.05）；PGF2α类似物处理原代和永生化黄体细胞后StAR和3β-HSD蛋白表达则显著下降（p˂0.05），但P450scc蛋白表达未发生显著变 化（p>0.05），原代和永生化黄体细胞的孕酮产量均显著下降（p˂0.05）。软琼脂和裸鼠致瘤试验结果显示，永生化黄体细胞在体内和体外均未发生恶性转化。2MTT结果显示，PPV感染可显著抑制原代和永生化猪黄体细胞的细胞活性（p˂0.05）。qPCR检测发现PPV可在原代和永生化黄体细胞中进行DNA复制，且随感染时间延长细胞中病毒拷贝数显著增多（p˂0.05）。Hoechst染色结果显示PPV感染可诱导黄体细胞出现核固缩和核碎裂。DNA片段化分析结果显示，PPV感染一定时间后可引起黄体细胞出现DNALadder现象。流式细胞术检测结果显示，AnnexinV阳性细胞比率随PPV感染时间延长显著上升（p˂0.05）。Caspase活性检测和流式细胞凋亡率检测结合caspase特异性抑制剂检测，结果显示，PPV感染使caspase-9和caspase-3的活性显著升高（p˂0.05）；而caspase-8活性未发生显著变化（p>0.05），且caspase-8特异性抑制剂预处理也未对caspase-3活性造成显著影响（p>0.05）。同时，Westernblotting检测结果显示，PPV感染过程中原代和永生化黄体细胞中Fas和FasL蛋白表达均未发生显著变化（p>0.05）；而Bax蛋白表达显著上升（p˂0.05），且细胞质中Bax蛋白量显著下降（p˂0.05），线粒体中Bax蛋白量则显著上升（p˂0.05），Bcl-2蛋白表达显著下降（p˂0.05），进而导致Bax/Bcl-2比率显著上升（p˂0.05）。线粒体中cytc蛋白水平显著下降（p˂0.05），细胞质中cytc显著升高（p˂0.05）。Westernblotting和RT-PCR法检测p53蛋白及基因表达的变化情况，结果显示，PPV感染可诱导原代和永生化黄体细中p53蛋白含量显著升高（p˂0.05）且p53mRNA表达水平也显著上升（p˂0.05）；同时，p53特异性抑制剂和p53siRNA可显著抑制PPV诱导的Bax蛋白的表达（p˂0.05）、caspase-3活性的升高（p˂0.05）和黄体细胞凋亡率的上升（p˂0.05）。Westernblotting检测结果显示，PPV感染可引起原代和永生化黄体细胞中p38MAPK磷酸化水平显著升高（p˂0.05）。p38特异性抑制剂预处理原代和永生化黄体细胞，Westernblotting结果显示p38特异性可显著抑制PPV诱导的p53蛋白含量的升高（p˂0.05）并使细胞核中p53蛋白水平显著下降（p˂0.05）；流式细胞术检测结果显示，p38特异性抑制剂预处理可显著抑制PPV诱导的黄体细胞凋亡率的升高（p˂0.05）。3PPV感染原代和永生化黄体细胞，放射免疫法检测上清中孕酮含量结果显示，PPV感染显著降低细胞上清中孕酮含量（p˂0.05）。Westernblotting和Real-timePCR法检测PPV感染后黄体细胞中调控孕酮合成的关键蛋白StAR和关键酶3β-HSD和P450scc的表达变化，结果显示，PPV感染可显著抑制StAR、3β-HSD及P450sccmRNA和蛋白的表达（p˂0.05）。此外，Bax特异性抑制剂预处理原代和永生化黄体后，采用放射免疫法检测上清中孕酮含量结果显示，Bax特异性抑制剂可显著抑制PPV诱导的孕酮水平的下降（p˂0.05）。同时，放射免疫检测结果显示p53特异性抑制和p38特异性抑制剂剂预处理均能显著抑制PPV诱导的孕酮产量的下降（p˂0.05）。4将36头健康初孕母猪，随机分为对照组和PPV感染组，18头/组。在配种前、配种后第22天（通过滴鼻感染PPV，记为0dp.i.），7dp.i.、14dp.i.、21dp.i.、28dp.i. 和35dp.i.采集血液，制备血清。一份用于检测血清中PPV抗体水平，发现PPV感染后，血清中PPV抗体水平变为阳性。另一份采用放射免疫法检测血清中孕酮含量，结果显示，PPV感染14dp.i.妊娠猪血清中孕酮含量发生显著下降（p˂0.05）。在感染21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.处死对照组和PPV感染组初孕母猪，采集卵巢组织进行原位杂交染色，结果显示在黄体组织中，PPV主要的黄体细胞内进行复制，且随感染时间的延长，黄体组织中病毒量逐渐增多。TUNEL和间接免疫荧光染色结果显示，随着PPV感染时间延长黄体组织中发生凋亡的细胞数量显著上升，且发生凋亡的细胞主要为黄体细胞。HE染色结果显示，与对照组相比，PPV感染组的黄体细胞出现明显的固缩和空泡化现象，并随感染时间的延长病变愈加明显。透射电子显微镜观察PPV感染35dp.i.黄体组织中黄体细胞超微结构变化发现，PPV感染可引起黄体细胞出现细胞核固缩、胞质体积减小、细胞器溶解和凋亡小体等凋亡现象。Westernblotting检测发现，PPV感染可使黄体组织中活化的caspase-9和caspase-3表达显著升高（p˂0.05）；并显著上调促凋亡蛋白Bax的表达（p˂0.05），抑制抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（p˂0.05）。同样，p53蛋白和磷酸化p38MAPK在黄体组织中蛋白水平均显著升高（p˂0.05）。提取黄体组织的总RNA和蛋白通过Real-timePCR和Westernblotting法检测孕酮合成过程中关键蛋白（StAR）和关键酶（3β-HSD和P450scc）mRNA和蛋白表达水平的变化情况，结果显示，随着PPV感染时间的延长，黄体组织中StAR、3β-HSD和P450sccmRNA和蛋白表达水平均显著下降（p˂0.05）。本研究获得了一株具有遗传稳定性、并保留了原代猪黄体细胞主要生物学特性和功能的永生化猪黄体细胞系。PPV感染原代和永生化猪黄体细胞，qPCR法检测发现，PPV可以在黄体细胞中复制，Hoechst33258染色、DNA片段化分析、流式细胞术检测发现，PPV感染诱导了黄体细胞发生凋亡。进一步探讨PPV感染诱导黄体细胞凋亡机制发现，PPV感染是通过激活p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞发生凋亡。PPV感染原代和永生化猪黄体细胞，检测孕酮合成过程中关键蛋白StAR及关键酶3β-HSD和P450scc的表达发现，PPV感染通过抑制关键蛋白StAR及关键酶3β-HSD和P450scc的表达抑制黄体细胞孕酮合成。分别使用PPV诱导黄体细胞凋亡关键蛋白Bax、p53和p38的特异性抑制剂预处理黄体细胞发现黄体细胞孕酮产量有所升高。PPV人工感染初孕母猪发现，黄体组织TUNEL染色阳性细胞主要为黄体细胞，并进一步证实了PPV在体内感染条件下，也是通过激活p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞凋亡。人工感染初孕母猪过程中，机体血清中孕酮水平显著下降，StAR、3β-HSD和P450scc的表达也发生显著下调，与体外细胞试验结果一致。研究结果证实了PPV感染可诱导黄体细胞凋亡和抑制黄体细胞孕酮产生，揭示了PPV诱导猪黄体细胞凋亡和抑制黄体细胞孕酮产生的机制，为进一步研究PPV的致病机理提供依据。关键词：猪细小病毒；猪黄体细胞；凋亡；孕酮 MechanismsonporcinelutealcellsapoptosisandinhibitionofprogesteroneproductioninducedbyporcineparvovirusABSTRACTPorcineparvovirus(PPV),amemberoftheProtoparvovirusgenusoftheParvovirinaesubfamilyoftheParvoviridaefamily,isamajorcausativeagentofreproductivefailurewhichischaracterizedasinfertility,earlyembryonicdeathandresorption,stillbirth,mummifiedfetuses,anddeadfetusesinswine.Porcineparvovirushasbeenendemicinmostpartsoftheworld,andcouldcausedevastatingabortioninpigswithoutvaccinationorwithinappropriatevaccination.AmountofstudieshavereportedthatPPVinfectioncausesthefetaldeathorweakpigletthroughinducingthevarietyoftissuedamage.However,theeffectsofPPVinfectiononpregnantsowarerarelyreported.Thecorpusluteumplaysapivotalroleinestablishmentandmaintenanceofpregnancyinswinedependingontheproducingprogesterone(P4)bythelutealcells.PreviousstudieshavedemonstratedthatPPVinfectioncausetheinfertilityandabortionviainducingmaternalcorpusluteumdamage.However,theunderlyingmolecularmechanismremainsunknown.Inthepresentstudy,theinvivoandinvitroporcinelutealcellswereutilizedastheresearchmodeltoexploretherolesofPPVonlutealcellsapoptosis,progesteronesynthesisandtheunderlyingmolecularmechanismafterthePPVinfectioninprimaryandimmortalizedporcinelutealcellline.Theresultswereasfollows:1.Ovarieswereobtainedfromhealthygiltsatday30today50ofgestationatlocalabattoir.TheprimarylutealcellsweredispersedandpurifiedbycollagenaseandadiscontinuousPercollgradient.TheprimaryporcinesteriodogeniclutealcellswereimmortalizedwithpCI-neo-hTERT,andthentreatedwith100μg/mlG418toobtainthemonoclonalcellsbyaseriesofdilution.Thesemonoclonalcellswerefurtherculturedanddefinedbyprogesteroneassay.Finally,oneclone,whichdidnotbecomesenescenceover50passageandexhibitspositivereactionindetectionofsteroidogenicproperty,wasselectedandnamedhTERT-PLCs.RT-PCRandtelomeraseactivityassayresultsshowedthehTERT-PLCscontinuouslyexpressedhTERTandmaintainedhightelomeraseactivityovertheexaminedtime.KaryotypingresultsshowedthatprimaryandhTERT-PLCsatpassage30and50exhibitedthenormaldiploidnumberofchromosomesatpassage30and50.Theresultsof3β-HSDstainingandOil-Red-OstainingalsodemonstratedthatbothhTERT-PLCsandprimaryPLCsweresteroidogeniclutealcells.Transmissionelectronmicroscopeobservationdemonstratedthattherearethegapjunctionsbetweenadjacentcells,abundanceof mitochondriaandsmoothendoplasmicreticuluminbothhTERT-PLCsandprimaryporcinelutealcells.RT-PCRdetectionshowedthathTERT-PLCsexpressedthekeygenes(CYP11A1,HSD3B1,STARandAKR1C1)andcharacteristicreceptors(ESR1,ESR2,PGR,PRLR,andLHCGR)involvedinregulatingprogesteronesynthesisanddegradation.TreatmentofLHonhTERT-PLCsorprimaryPLCsfor24h,theStARand3β-HSDexpressionandprogesteroneproduction(p˂0.05)wereincreasedinadosedependentmanner.Incontrast,thecellstreatedwiththePGF2αanalogresultsshowedStARand3β-HSDexpressionandprogesteroneproductionweresignificantlydecreased(p˂0.05).Tumorigenicityanalysisshowedtherewasnomalignanttransformationinvitroandinvivo.2.TheprimaryandimmortalizedlutealcellswereinfectedwithPPVandMTTresultsshowedPPV-infectioncouldreducethecellability(p˂0.05).Theq-PCRdetectionshowedPPVcouldreplicateinprimaryandimmortalizedlutealcellsandthecopynumberweresignificantlyincreased(p˂0.05)inatime-dependentmanner.Hoechst33258stainingshowedPPVinducednuclearcondensationandfragmentationinbothcells.DNAfragmentationassayshowedPPVinducedDNAladder.Theflowcytometerdetectionresultsdemonstratedthattheapoptoticratioofprimaryandimmortalizedlutealcellswerealsosignificantlyincreased(p˂0.05)inatime-dependentmanner.CaspaseactivityassayresultsshowedthatPPVinfectionincreasedthecaspase-9andcaspase-3activity(p˂0.05),butthecaspase-8activitydidnotchange(p>0.05).Meanwhile,thepretreatmentofcaspase-8specificinhibitordidnotaffectthecaspase-3activity(p>0.05).WesternblottingresultsshowedthatPPV-infectionhadnoeffectsonFasandFasLexpression(p>0.05),butupregulatedtheexpressionofBaxprotein(p˂0.05)anddownregulatedtheexpressionofBcl-2protein(p˂0.05),resultingtheincreaseofBax/Bcl-2ratio(p˂0.05).Moreover,theproteinlevelsofcytochromecweresignificantlydecreasedinmitochondriaandincreasedincytoplasm(p˂0.05).TheresultsofwesternblottingandRT-PCRdetectionshowedPPV-infectioncouldincreasep53mRNAandproteinexpressionlevelsinbothprimaryandimmortalizedsteroidogeniclutealcells(p˂0.05).Pretreatmentwithp53inhibitororsiRNAcouldsignificantlyinhibitPPV-inducedBaxproteinexpression(p˂0.05).Furthermore,PPVinfectionalsoinducedthephosphorylationofp38inbothprimaryandimmortalizedlutealcellsandp38specificinhibitorcouldsignificantlyinhibitPPV-inducedp38phosphorylation,decreasthetotalp53andnuclearp53proteinexpressionlevels(p˂0.05).Theflowcytometerdetectionresultsalsodemonstratedthatp38specificinhibitorpretreatmentsignificantlyinhibitedPPV-inducedlutealcellsapoptosis(p˂0.05).3.TheprimaryandimmortalizedlutealcellswereinfectedwithPPVandradioimmunoassayresultsshowedthatPPVdecreasedprogesteroneproductionincellculture medium(p˂0.05).WesternblottingandRealtime-PCRresultsdemonstratedthatPPVcouldinhibittheexpressionofprogesteronesynthesisrelativeproteinandemzaysStAR,3β-HSDandP450sccexpression(p˂0.05).Inaddition,pretreatmentofBax,p53andp38specificinhibitorscouldinhibitPPV-induceddownregulationofprogesteroneproduction(p˂0.05).4.Thethirty-sixgiltswereequallydividedintocontrolandPPVinfectiongroups.The7PPV-infectedgroupswereexposedintranasallyto10ml(10TCID50/ml)ofPPVstocksatDay22ofgestationanddesignatedas0daypost-infection(0dp.i.).Bloodwascollectedfromearveinat7,14,21,28and35dp.i.andtheserumwasharvestedtomonitorthepregnancycondition.AfterPPVinfection,thePPVantibodylevelsbecamepositively.TheradioimmunoassayresultsshowedthatthecirculatingprogesteronelevelsofPPVinfectiongroupweresignificantlylowerthanthatofcontrolgroupat14dp.i.(p˂0.05).TheovarieswerecollectedfromthecontrolandPPVinfectiongroupsat21,28and35dp.i.ThehybridizationinsituresultsshowedthatPPVweremainlyreplicatedinlutealcellsandtheamountofviruswereincreasedinatime-dependentmannerinthecorpusluteum.TUNELandindirectlyIFresultstheapoptoticcellswereincreasedinatime-dependentmannerafterPPVinfectionandtheapoptoticcellsweremainlylutealcells.HistopathologyobservationshowedthatPPVinfectioncausedtheobvioushistopathologicchangesofcorpusluteum,includingedema,partoflutealcellsvacuolardegeneration,anditbecamemoreobviouslydependontheinfectiontime.TransmissionelectronmicroscopeobservationdemonstratedthatPPVinfectioninducedthelutealcellsshowedcondensednuclei,reducedcytoplasmicvolume,organellelysisandapoptoticbodiesat35dp.i..WesternblottingresultsshowedthatPPVinfectionincreasedtheactivatedcaspase-9andcaspase-3levelsandBaxexpressionlevels,butdecreasedBcl-2expressionlevels(p˂0.05).Meanwhile,p53andphosphorylatedp38proteinlevelswerealsoupregulatedincorpusluteum(p˂0.05).ThetotalRNAandproteinincorpusluteumwereextracted,Realtime-PCRandWesternblottingresultsshowedthatStAR,3β-HSDandP450sccmRNAandproteinlevelsweredownregulatedincorpusluteum(p˂0.05).Insummary,weestablishedanimmortalizedporcinelutealcelllinewhichhadthegeneticstabilityandkeptthemainbiologicalcharacteristicsandfunctionofprimaryporcineluteualcells.PPVcouldreplicateinluteumcellsafterthePPVinfectioninprimaryandimmortalizedporcinelutealcells.Hoechst33258staining,DNAfragmentanalysisandflowcytometerdetectionresultsshowedthatPPVinfectioninducedlutealcellsapoptosis.ThefurtherstudydemonstratedPPVinducedlutealcellsapoptosisviaactivatingp38,p53andmitochondrialpathway.Moreover,PPValsoinhibitedprogesteronesynthesisthroughdownregulatingtheexpressionlevelofStAR,3β-HSDandP450sccinprimaryand immortalizedsteroidogeniclutealcells.ThepretreatmentofBax,p53andp38specificinhibitorscouldreversePPV-induceddownregulationofprogesteroneproductioninprimaryandimmortalizedsteroidogeniclutealcells.InPPVinfectedgilts,TUNELstainingresultsshowedthatthepositivecellsweremainlutealcells.Meanwhile,PPV-inducedinvivolutealcellsapoptosisviaactivatingp38,p53andmitochondriapathway.Inaddition,theserumprogesteronelevels,StAR,3β-HSDandP450sccexpressionlevelsincorpusluteumweredecreased,whichwerecoincidewiththeinvitrostudy.OurresultsdemonstratedthatPPVinfectioncouldinducelutealcellsapoptosisandinhibitlutealcellsprogesteroneproductionandprovidedthenewviewandtheoreticalbasisonPPV-inducedporcinelutealcellsapoptosisandprogesteroneproduction.KEYWORDS:porcineparvovirus;porcinesteroidogeniclutealcells;apoptosis;progesterone 目录文献综述....................................................................................................................................1第一章病毒诱导宿主细胞凋亡研究进展..............................................................................11.1病毒感染诱导细胞凋亡..................................................................................................11.1.1病毒量与细胞凋亡................................................................................................11.1.2病毒抗体与细胞凋亡............................................................................................21.2病毒感染诱导细胞凋亡的信号转导通路......................................................................31.2.1病毒感染诱导死亡受体通路研究.........................................................................31.2.2病毒感染诱导线粒体通路研究............................................................................31.2.3病毒感染诱导p53信号转导通路研究................................................................41.2.4病毒感染诱导MAPKs信号转导通路研究........................................................61.3细小病毒诱导的细胞凋亡..............................................................................................81.4本研究的目的意义..........................................................................................................9试验研究..................................................................................................................................11第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定........................................................................112.1试验材料........................................................................................................................112.1.1卵巢组织..............................................................................................................112.1.2实验动物..............................................................................................................112.1.3质粒和细胞..........................................................................................................112.1.4主要试剂..............................................................................................................112.1.5主要试剂的配置..................................................................................................122.1.6主要仪器..............................................................................................................122.2试验方法........................................................................................................................132.2.1原代猪黄体细胞的分离、纯化..........................................................................132.2.23β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色鉴定.........................................................132.2.3猪黄体细胞的永生化...........................................................................................142.2.4转染后的猪黄体细胞端粒酶基因表达及活性鉴定..........................................142.2.5核型分析..............................................................................................................162.2.6透射电子显微镜观察..........................................................................................162.2.73β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色鉴定转染后黄体细胞.............................172.2.8台盼蓝法鉴定细胞活性......................................................................................172.2.9RT-PCR法检测类固醇激素合成相关分子的表达............................................172.2.10放射免疫法检测LH和氯前列烯醇刺激后孕酮的产生................................192.2.11Westernblotting法检测LH和氯前列烯醇刺激后孕酮合成过程中关键蛋白和 酶的表达...........................................................................................................................202.2.12软琼脂试验及裸鼠致瘤试验............................................................................202.2.13统计学分析........................................................................................................202.3结果................................................................................................................................212.3.1永生化猪黄体细胞系的建立..............................................................................212.3.2永生化猪黄体细胞形态学特征的鉴定..............................................................232.3.3类固醇激素合成过程中相关分子的表达..........................................................232.3.4LH和氯前列烯醇对黄体细胞孕酮合成的影响................................................252.3.5体内和体外致瘤性分析......................................................................................262.4讨论................................................................................................................................272.5小结................................................................................................................................29第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究............................................303.1试验材料........................................................................................................................303.1.1病毒和细胞..........................................................................................................303.1.2主要试剂..............................................................................................................303.1.3主要仪器..............................................................................................................313.2试验方法........................................................................................................................313.2.1PPV的扩增及病毒滴度的测定..........................................................................313.2.2MTT法检测PPV对黄体细胞细胞活性的影响................................................323.2.3qPCR法检测PPV在黄体细胞中的增殖...........................................................323.2.4PPV感染对黄体细胞损伤的形态观察..............................................................343.2.5DNA片段化分析.................................................................................................343.2.6流式细胞术检测..................................................................................................343.2.7分光光度法检测caspase的活性.......................................................................353.2.8抑制剂预处理猪黄体细胞..................................................................................353.2.9Westernblotting法检测死亡受体和线粒体通路主要相关蛋白的表达...........353.2.10RT-PCR法检测p53转录水平的变化..............................................................363.2.11Westernblotting法检测p53蛋白表达和转位以及p38MAPK、JNK总蛋白和蛋白磷酸化水平变化情况...............................................................................................373.2.12p53siRNA转染猪黄体细胞.............................................................................373.2.13统计学分析........................................................................................................373.3结果................................................................................................................................373.3.1PPV感染对黄体细胞活性的影响......................................................................373.3.2PPV在黄体细胞中的增殖..................................................................................383.3.3PPV感染诱导原代和永生化黄体细胞凋亡......................................................38 3.3.4PPV感染经线粒体通路诱导原代和永生化黄体细胞凋亡..............................403.3.5p53参与调控PPV诱导的黄体细胞凋亡..........................................................433.3.6PPV诱导黄体细胞中的p38MAPK发生磷酸化..............................................453.3.7磷酸化p38参与调控PPV感染引起的黄体细胞凋亡....................................473.4讨论................................................................................................................................473.5小结................................................................................................................................49第四章猪细小病毒抑制猪黄体细胞孕酮产生机制研究....................................................504.1试验材料........................................................................................................................504.1.1病毒和细胞..........................................................................................................504.1.2主要试剂..............................................................................................................504.2试验方法........................................................................................................................504.2.1放射免疫法检测孕酮的产生..............................................................................504.2.2Real-timePCR法检测黄体细胞中孕酮合成关键蛋白和酶的表达.................514.2.3Westernblotting法检测黄体细胞中孕酮合成关键蛋白和酶的表达...............524.2.4放射免疫法检测特异性抑制剂预处理后PPV感染对黄体细胞孕酮产生的影响.......................................................................................................................................524.2.5统计学分析..........................................................................................................534.3结果................................................................................................................................534.3.1PPV感染抑制原代和永生化黄体细胞孕酮产生..............................................534.3.2PPV感染对黄体细胞孕酮合成的影响..............................................................544.3.3调控PPV感染诱导黄体细胞凋亡过程的相关因子对黄体细胞孕酮产生的影响.......................................................................................................................................554.4讨论................................................................................................................................574.5小结................................................................................................................................58第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究....................595.1试验材料........................................................................................................................595.1.1病毒和细胞..........................................................................................................595.1.2实验动物..............................................................................................................595.1.3主要试剂..............................................................................................................595.1.4主要试剂的配置..................................................................................................605.1.5主要仪器..............................................................................................................605.2试验方法........................................................................................................................615.2.1人工感染PPV.....................................................................................................615.2.2血清中PPV抗体水平的检测............................................................................615.2.3血清中孕酮含量的检测......................................................................................61 5.2.4原位杂交法检测PPV在黄体组织中的分布及复制情况的确定....................625.2.5Westernblotting法检测黄体组织中PPV的表达..............................................635.2.6HE染色................................................................................................................635.2.7TUNEL染色.........................................................................................................635.2.8透射电子显微镜观察黄体组织细胞超微结构变化..........................................645.2.9Westernblotting法检测黄体组织中细胞凋亡信号转导通路主要相关蛋白的表达.......................................................................................................................................645.2.10Real-timePCR法检测黄体组织中孕酮合成过程中关键蛋白和酶基因的表达...........................................................................................................................................645.2.11Westernblotting法检测黄体组织中孕酮合成过程中关键蛋白及酶的表达.645.2.12统计学分析........................................................................................................645.3结果................................................................................................................................645.3.1人工感染PPV不同时间妊娠猪血清中PPV抗体水平的变化.......................645.3.2人工感染PPV不同时间妊娠猪血清中孕酮水平的变化................................655.3.3人工感染PPV不同时间对初孕猪卵巢大体剖检观察结果.............................665.3.4人工感染PPV后PPV在黄体组织中复制及病毒载量的观察.......................665.3.5人工感染PPV不同时间对初孕母猪黄体组织损伤和细胞凋亡的影响........675.3.6人工感染PPV对初孕母猪黄体组织细胞超微结构的影响............................685.3.7人工感染PPV通过线粒体通路介导黄体组织中细胞凋亡............................695.3.8人工感染PPV促进p53蛋白在黄体组织细胞中的积累................................705.3.9人工感染PPV诱导黄体组织细胞中p38蛋白发生磷酸化............................705.3.10人工感染PPV不同时间对初孕母猪黄体组织中孕酮合成相关蛋白和酶表达的影响...............................................................................................................................715.4讨论................................................................................................................................725.5小结................................................................................................................................73结论..................................................................................................................................74创新点..................................................................................................................................75参考文献..................................................................................................................................76英文缩略词及中英文对照......................................................................................................91致谢..................................................................................................................................93作者简介..................................................................................................................................94 第一章病毒诱导宿主细胞凋亡研究进展1文献综述第一章病毒诱导宿主细胞凋亡研究进展病毒感染哺乳动物后，机体可以通过凋亡这一病理途径以清除病毒感染的细胞，进而抑制病毒的复制和传播。这一病理途径的基本过程主要表现为，病毒感染动物后首先诱导机体出现免疫反应(Diebold2010;Jonesetal.2006;Pichlmairetal.2007)或激活机体的其他防御体系如RNA干扰等，以识别病毒粒子和病毒感染细胞，进而引起病毒的靶细胞发生凋亡，这样可以抑制病毒在细胞或组织中的复制和扩散(Cullen2006;Diebold2010;Galiana-Arnouxetal.2006;Pichlmairetal.2007)。病毒还可通过诱导炎性细胞凋亡并释放大量的炎性分子（如肿瘤坏死因子等）间接诱导宿主细胞凋亡(Matthewsetal.2000;Schoneboometal.2000;Weissenbocketal.2000)；或者不依赖于免疫细胞，直接诱导细胞发生凋亡进而促进自身的扩散和组织病变(Gaoetal.2017;Henkeetal.2000;Lewisetal.1996b;Soomroetal.2017)。本文从病毒与细胞凋亡的关系、病毒感染引起细胞凋亡的信号转导通路等方面综述了病毒诱导宿主细胞凋亡的研究进展。1.1病毒感染诱导细胞凋亡细胞凋亡是一种独特的细胞死亡形式，是机体维持内环境稳态、保证胎儿正常发育的一种生理反应，受到细胞中一系列分子事件的严格调控。主要病理表现为细胞核固缩、胞质体积缩小、细胞膜出现褶皱或起泡。凋亡细胞在生物化学方面的典型变化表现为DNA片段化、磷脂双分子层内膜外翻，使得位于膜内侧的磷酯酰丝氨酸暴露，并诱导天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶（aspartate-specificcysteineproteases，caspase）家族中一系列的特定蛋白酶发生活化。研究表明，不同病毒感染细胞后可诱导细胞发生凋亡(Ameisenetal.2003;Lietal.2016a;Marsicoetal.2018)。在病毒感染宿主细胞的过程中，细胞凋亡的发生既可以看作是宿主机体天然抗病毒的防御机制；亦可以看作是病毒用来促进自身从宿主细胞中释放和传播以增强病毒自身致病性的诱导机制。当机体受到外界不良因素的影响时，凋亡也可作为一种病理反应诱导细胞发生非正常死亡并造成组织损伤。在病毒诱导细胞凋亡过程中，病毒的复制是诱导宿主细胞凋亡的根本原因，而细胞或组织中病毒量和病毒抗体水平是病毒在细胞中复制的表现形式，细胞或组织中病毒量和病毒抗体水平可能与细胞凋亡程度呈正比(Clarkeetal.2009)。1.1.1病毒量与细胞凋亡研究表明，caspase-3活性增强、DNALadder和TUNEL染色阳性等现象均为细胞凋亡的典型特征性表现(Hengartner2000)。前期研究结果显示，小鼠感染西尼罗病毒（westnilevirus，WNV）后，中枢神经系统中的病毒量的最高峰与caspase-3的活化有关(Samuel 2猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究etal.2007)。同时，呼肠孤病毒诱导细胞凋亡过程中，当细胞中病毒量达到一定阈值时，细胞DNA发生降解，出现DNALadder现象，且随着细胞中病毒量的增加DNA片段化愈加明显(Oberhausetal.1997)。同样，感染辛德毕斯病毒可引起细胞TUNEL阳性染色率增多(Labradaetal.2002)。此外，柯萨奇病毒B3（coxsackievirusB3，CVB3）(Jooetal.2003;Sarasteetal.2003)、呼肠孤病毒(DeBiasietal.2004;O'Donnelletal.2005)、脑心肌炎病毒(Linetal.2017;Riedletal.2001)、巨细胞病毒（cytomegalovirus，CMV）(Lenzoetal.2002;Ritteretal.2010)感染小鼠心脏组织，以及单纯疱疹性病毒1（Herpessimplexvirus1，HSV1）感染小鼠肝脏组织时均发现，随着病毒的复制，组织中病毒量显著增多，同时组织中凋亡细胞也显著增多(Irieetal.1998)。以上研究结果表明，细胞中的病毒量与细胞凋亡呈正比。1.1.2病毒抗体与细胞凋亡细胞凋亡的发生与病毒抗体的产生具有一定的时间性，表现为细胞凋亡与病毒抗体同时产生、细胞凋亡晚于病毒抗体的产生、或细胞凋亡在病毒抗体产生前已发生(Ghouzzietal.2016;Oberhausetal.1997;Xiaoetal.2001)。在转基因小鼠的肝脏中表达乙型肝炎病毒（hepatitisBvirus，HBV）和丙型肝炎病毒（hepatitisCvirus，HCV）蛋白的过程中，病毒抗体一经表达即可观察到细胞凋亡的发生(Nakamotoetal.2002;Tumurbaataretal.2007)。而在寨卡病毒感染小鼠大脑、人大脑类器官和小鼠神经祖细胞中发现，未出现病毒抗体前即可检测到细胞凋亡的发生(Ghouzzietal.2016;Lietal.2016a;Qianetal.2016)。细胞凋亡的发生与病毒抗体的产生还具有一定的空间性，主要表现为细胞凋亡与病毒抗体是否出现在同一区域。呼肠孤病毒(Oberhausetal.1997;Richardson-Burnsetal.2004)和WNV(Xiaoetal.2001)感染中枢神经系统时，凋亡与病毒抗体出现在相同区域。呼肠孤病毒(DeBiasietal.2001;DeBiasietal.2004;Hoytetal.2005)和CVB3感染心脏过程中也观察到两者出现在相同区域。在脑脊髓炎病毒（theiler'smouseencephalomyelitisvirus，TMeV）(Tsunodaetal.1997)、辛德毕斯病毒（sindbisvirus，SINV）(Lewisetal.1996a)、呼肠孤病毒(Beckhametal.2007;Goodyetal.2008)感染中枢神经系统动物模型中可在单个凋亡细胞中观察到其与病毒抗体共定位；同样，在感染CVB3动物模型的心脏组织(Jooetal.2003)，HCV和HBV蛋白在小鼠肝脏组织中(Nakamotoetal.2004)也都观察到了细胞凋亡与病毒抗体之间的空间性。然而，在某些病毒诱导疾病的动物模型中，未感染病毒的细胞同样被观察到发生了细胞凋亡。但是，细胞凋亡主要发生在病毒感染细胞的周边，如在TMeV和呼肠孤病毒引起急性脑炎和WNV引起急性松弛性小儿麻痹性麻痹(Morreyetal.2008;Oberhausetal.1997;Tsunodaetal.1997)。此外，当凋亡发生在无病毒抗体的区域时，该区域可见星形胶质细胞增生和炎症反应(Schoneboometal.2000)以及小神经胶质细胞增生(Weissenbocketal.2000)的现象。研究表明，这种现象的发生 第一章病毒诱导宿主细胞凋亡研究进展3可能是由于病毒上调了促炎基因（如iNOS和TNF），进而使不存在病毒抗体的区域发生细胞凋亡(Schoneboometal.2000)。与此结果相似，美利谷脑炎病毒（MurrayValleyencephalitisvirus，MVEV）感染神经元时，可引起炎性细胞浸润（包括巨噬细胞、淋巴细胞和中性粒细胞），这些炎性细胞死亡时可释放炎症介导分子iNOS(Andrewsetal.1999;Matthewsetal.2000)，进而最终引起宿主细胞死亡。1.2病毒感染诱导细胞凋亡的信号转导通路细胞凋亡引起的细胞形态学的改变是由于caspase家族中一系列蛋白酶的活化引发的。Caspase-3是caspase家族中主要的凋亡执行蛋白酶，可以被死亡受体通路中活化的caspase-8激活；同时，也可被线粒体通路通中活化的caspase-9激活。在Ⅰ型细胞中，活化的caspase-8可直接诱导细胞凋亡，而在Ⅱ型细胞中，诱导细胞凋亡的过程中需要线粒体通路的参与，在此过程中线粒体通路可被直接激活或被死亡通路中活化的caspase-8通过切割Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白Bid激活(Logueetal.2008)。此外，p53和MAPKs等信号转导通路也参与调控细胞凋亡(Vargheseetal.2016;Yanetal.2016)。1.2.1病毒感染诱导死亡受体通路研究死亡受体通路介导的细胞凋亡受胞外信号的影响。当同源配体（包括FasL、TNF和TRAIL）与其特异性的细胞表面受体（分别为Fas、TNF受体和TRAIL受体）结合时，可启动死亡受体通路。活化的死亡受体在其胞质结构域形成死亡结构域，该区域可作为衔接分子募集大量的蛋白分子如caspase-8前体，形成凋亡诱导信号复合体，其中caspase-8通过自身活化作用被激活。活化的caspase-8可以激活caspas-3，从而诱导细胞凋亡(Fischeretal.2003;Taitetal.2010;Wilsonetal.2009)。多种病毒感染机体过程中，一方面可通过机体的免疫系统激活死亡受体通路诱导细胞凋亡以达到清除病毒的目的。如病毒急性感染过程中，病毒特异性T细胞（包括细胞毒性T淋巴细胞，cytotoxicTlymphocytes，CTLs）增多，可通过提高死亡配体的表达（如释放大量毒性细胞因子TNF或表达大量FasL和TRAIL）(Achardetal.2017)或通过释放颗粒酶B直接激活caspase-8和caspase-3的方式引起感染病毒的细胞发生凋亡进而达到清除病毒的效果(Oleszaketal.2003)。在某些情况下，病毒还可以直接激活宿主细胞中的死亡受体通路进而诱导宿主细胞凋亡。如HBV引起急性肝衰竭过程中，肝脏中TRAIL表达的升高是由病毒对宿主细胞直接作用引起的(Mundtetal.2003)。1.2.2病毒感染诱导线粒体通路研究线粒体通路介导的细胞凋亡可被各种胞内刺激激活，当受到凋亡信号刺激时，Bcl-2家族蛋白中的促凋亡蛋白Bax和Bak向线粒体发生转位，进而破坏线粒体外膜的完整性使线粒体外膜通透性增强，并导致线粒体中促凋亡因子（如细胞色素c，cytochromec， 4猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究cytc和SMAC/DIABLO）释放。其中cytc与衔接分子APAF1形成凋亡体，该凋亡体可募集caspase-9前体，通过自催化作用激活caspase-9进而活化caspase-3，最终诱导细胞凋亡(Taitetal.2010)。病毒诱导细胞凋亡过程中，某些病毒或病毒蛋白可直接或间接增强宿主细胞线粒体膜通透性进而诱导细胞凋亡(Gaoetal.2017;Soomroetal.2017)。如戊肝病毒可通过上调促凋亡蛋白Bax，下调抗凋亡蛋白Bcl-2蛋白的表达增强线粒体膜通透性进而激活细胞凋亡(Yangetal.2018)。某些病毒蛋白也可直接作用于线粒体膜，使线粒体膜通透性增强，进而激活线粒体通路诱导细胞凋亡。主要表现为：（1）直接与腺嘌呤核苷酸转位酶和电压依赖阴离子通道相互作用(Barnwaletal.2016;Jacototetal.2001;Jacototetal.2000;Muthumanietal.2002)；（2）引起线粒体肿胀，进而使线粒体内膜透化以及渗透转换复合物孔打开(Jacototetal.2001;Qietal.2016)；（3）增强促凋亡蛋白Bax或Bak表达或抑制抗凋亡蛋白Bcl-2表达(Borgne-Sanchezetal.2007;Nomura-Takigawaetal.2006)；（4）定位于线粒体使线粒体在细胞核周围发生聚集并改变线粒体形态(Madanetal.2008)；+2+（5）使K和Ca迅速转位，导致线粒体膜电位下降和线粒体裂解(D'Agostinoetal.2005)等。同时，这类蛋白还可以通过：（1）磷酸化p53和/或p53依赖性反式激活Puma和Bax(Perfettinietal.2004)；（2）与微管蛋白结合，使微管动力发生改变，促进微管相关蛋白2降解，进而激活线粒体通路诱导的细胞凋亡(Apreaetal.2006)；（3）使溶酶体膜通透性增强，导致组织蛋白酶D从溶酶体释放进入细胞质中，进而活化Bax，引起线粒体膜通透性增强(Laforgeetal.2007)；（4）磷酸化JNK激活Bax(Autretetal.2007)；（5）经活化的caspase-8切割Bid(Nieetal.2002)等间接的方式使线粒体膜通透性增强，进而诱导细胞凋亡。然而，还有一些病毒蛋白具有一定的抑制线粒体通路激活的功能，如病毒Bcl-2蛋白（viralBcl-2proteins，vBcl-2s）(Burreretal.2016;Galloetal.2017)、病毒线粒体局限性凋亡抑制剂（viralmitochondria-localizedinhibitorofapoptosis，vMIA）(Arnoultetal.2004;Goldmacher2002;Poncetetal.2006;Sharon-Frilingetal.2006)和病毒线粒体抗凋亡蛋白（viralmitochondrialantiapoptoticprotein，vMAP）(Fengetal.2007)。1.2.3病毒感染诱导p53信号转导通路研究DNA损伤、缺氧和致癌基因活化的情况下，能够通过肿瘤抑制因子p53引起细胞周期阻滞和诱导细胞凋亡。p53最显著的生物学功能是作为一个转录调节因子，通过上调Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bax、Bak、noxa基因的表达，激活线粒体通路诱导细胞凋亡(Huangetal.2013a;Odaetal.2000)；同时，p53还可反式激活Fas和TNF受体或配体家族成员，进而参与调控死亡受体通路介导的细胞凋亡(Huangetal.2013a;Sheikhetal.1999)。此外，p53还可调控其他信号转导通路中的一些基因（如IGF-BP3、PTGF-β）或通过促进细胞中ROS水平，诱导细胞凋亡的发生(Attardietal.2000;Polyaketal. 第一章病毒诱导宿主细胞凋亡研究进展51997)。而且p53作为转录激活因子的同时，还可以通过抑制某些基因的转录过程进而发挥作用。如p53能够抑制Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Bcl-2基因的表达(Fridmanetal.2003;Mollereauetal.2014)进而促进细胞凋亡。p53除了具有转录依赖性诱导细胞凋亡的活性外，还能够通过转录非依赖性活性诱导细胞凋亡。p53的转录非依赖性活性依赖于翻译后作用，如增强p53蛋白稳定性和蛋白修饰。多种诱导细胞凋亡的信号刺激细胞或机体后可引起p53向线粒体快速转位并定位于线粒体外膜，使线粒体膜通透性增强、cytc释放和caspase-3活化进而诱导细胞凋亡(Miharaetal.2003)。同时，位于线粒体的p53还可增强Bcl-2家族中促凋亡蛋白Bak活性或中和抗凋亡蛋白活性以调控线粒体膜通透性来诱导细胞凋亡(Leuetal.2004;Yanetal.2016)。相对于转位至线粒体的p53通过增强Bak活性来调控线粒体膜通透性来说，位于细胞质中的p53可以直接诱导Bax发生构象改变、同源寡聚化和插入线粒体外膜使线粒体膜通透性增强、cytc释放和caspase-3激活(Schuleretal.2005)。而上述两种方式的激活需要位于细胞核的p53的支持或细胞中p53总蛋白量达到一定水平后(Speideletal.2006)。p53作为转录因子，在病毒感染过程中通过调控一系列不同的靶基因表达，从而形成宿主防御系统的核心基因调控网络，进而控制病毒感染的过程。如p53介导IFN信号增强，进而促进抗病毒免疫应答形成一个正反馈环路，表现为p53介导宿主细胞凋亡以抑制病毒的进一步扩散(Takaokaetal.2003)或p53直接反式激活先天免疫相关基因(Hackeetal.2010)，并激活机体的免疫反应进而诱导病毒宿主细胞凋亡以清除入侵病毒(Rivasetal.2010)。还有些病毒可通过激活IFN介导的先天抗病毒免疫反应，然后由活化的IFN信号通路促进p53mRNA水平和蛋白水平的表达，激活p53信号转导通路诱导宿主细胞凋亡(Takaokaetal.2003)。同时，多种病毒可直接激活p53信号转导通路诱导细胞凋亡，如某些逆转录病毒经病毒逆转录酶的作用，以RNA基因组为模板转录为DNA，随后DNA进入宿主细胞的细胞核并与宿主细胞的染色体基因组结合，引起DDR(Nakai-Murakamietal.2007)，进而激活p53转录依赖和非依赖性通路诱导细胞凋亡(Pise-Masisonetal.1998)。寨卡病毒诱导机体出现头小畸形综合征过程中可通过诱导p53总蛋白量增加、细胞核p53蛋白积累和促进p53磷酸化使神经细胞发生凋亡(Ghouzzietal.2016)。猪传染性胃肠炎病毒感染细胞过程中，病毒通过促进p5315、20和46位点的丝氨酸发生磷酸化，导致p53蛋白在细胞中发生积累，激活p53信号转导通路，活化的p53通过上调FasL表达、抑制Bcl-2表达以及促进Bax和cytc转位激活死亡受体通路和线粒体通路诱导细胞凋亡(Huangetal.2013a)。流感病毒在多种细胞模型中也可通过上调p53蛋白表达诱导宿主细胞凋亡(Wangetal.2010)。此外，在某些病毒感染的初期阶段p53也可作为凋亡抑制因子，抑制病毒介导的细胞凋亡以保证病毒的复制(Huoetal.2013)。如，人乳头状瘤病毒感染过程中其E6蛋白能够募集细胞中E3泛素连接酶E6AP，并与p53形成三聚体复合物(Huibregtseetal.1991)，经泛素-蛋白酶体通路降解p53进而抑制p53介导的细胞凋亡等抗病毒反应以促进病毒复制。腺病毒、卡波齐肉瘤病毒和埃 6猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究博拉病毒等病毒也可通过多种途径降解活泛素化、磷酸化等形式活化的p53以促进病毒DAN复制(Satoetal.2009a;Satoetal.2009b)。埃博拉病毒感染早期，p53可与病毒因子相互作用，进而促进病毒的复制(Satoetal.2010)。人巨细胞病毒感染过程中若缺乏p53的表达可延迟病毒蛋白的产生和转运(Casavantetal.2006)。1.2.4病毒感染诱导MAPKs信号转导通路研究促分裂原活化蛋白激酶（mitogen-activatedproteinkinase，MAPK）模型包括3种级联活化的蛋白激酶（MAPK、MAPK激酶（MAPKK、MKK或MEK）和MAPKK激酶（MAPKKK或MEKK）），在调控真核细胞的细胞增殖、细胞分化和细胞死亡过程中起着重要作用(Keshetetal.2010)。MAPKKK可直接磷酸化和激活MAPKK，接着活化的MAPKK使MAPK发生磷酸化进而被激活。活化的MAPK可使位于胞质或细胞核中的多种底物发生磷酸化，进而使蛋白功能或基因表达发生变化并诱导相应的生物学反应。哺乳动物中，MAPKs可分为3个主要的家族成员，包括ERKs、JNKs和p38/SAPKs。其中，ERKs包括经典的ERK1/2和ERK5，ERK1/2受生长因子和有丝分裂原刺激诱导细胞增殖和分化(McKayetal.2007)。JNKs包括JNK1、JNK2和JNK3，它们可被离子辐射、热应激、氧化应激和DNA损伤等环境因素、炎症细胞因子以及生长因子激活，在调控细胞凋亡、炎症反应、细胞因子产生和新陈代谢中起着重要作用(Huangetal.2009)。p38包括p38α、p38β、p38γ和p38δ，与JNKs相似，p38可被多种环境因素和炎性细胞因子激活，且活化的p38可诱导炎症发生、细胞凋亡、细胞分化和细胞周期阻滞(Cuadradoetal.2010)。1.2.4.1ERK病毒侵染细胞或机体后，可通过激活ERK调控细胞凋亡进而达到抗病毒效应。如猪流感病毒H1NIpdm感染巨噬细胞后通过激活ERK进而促进巨噬细胞释放促炎因子和IFN，接着通过NF-κB或其他一些信号转导通路激活死亡受体通路和/或线粒体通路，最终诱导细胞凋亡从而完成细胞或机体的抗病毒效应(Gaoetal.2012)。HCV感染肝癌Huh7.5.1细胞过程中，ERK也参与了IFN介导的抑制HCV复制和蛋白表达的过程(Zhaoetal.2015)。病毒感染还可以通过激活ERK直接调控宿主细胞的凋亡，如大鲈鱼病毒（largemouthBassvirus，LMBV）感染可通过激活ERK蛋白增强丘脑上皮细胞的线粒体膜通透性，使细胞产生大量的活性氧（reactiveoxygenspecies，ROS），最后通过激活caspase-8、caspase-9和caspase-3诱导细胞凋亡(Huangetal.2014)。此外，活化的ERK可使机体产生免疫耐受(Lietal.2016b)或使病毒感染的细胞进入潜伏期以利于病毒感染细胞的存活(Kewetal.2017)；或者活化的ERK可直接促进病毒的复制(Albarnazetal.2014;Daietal.2016;Huangetal.2014;Rodriguezetal.2014)和病毒基因的表达(Kimetal.2015;Peietal.2012;Zhaoetal.2015)。ERK还与病毒的致瘤性有关。研究表明，埃博拉病毒（Epstein-Barrvirus，EBV）编码的潜伏膜蛋白1（latentmembraneprotein，LMP1） 第一章病毒诱导宿主细胞凋亡研究进展7和LMP2A可激活ERK，且活化的ERK能与LMP1或LMP2A及其他一些蛋白或信号通路相互作用增强鼻炎癌细胞的入侵能力(Lanetal.2012;Linetal.2012)。禽白血病病毒-J（avianleukosisviruses，ALV）感染细胞后，可激活ERK信号通路使细胞发生恶性转化(Daietal.2016)。1.2.4.2p38MAPK活化的p38MAPK可通过诱导下游激酶发生磷酸化影响基因表达、稳定mRNA以调控蛋白翻译、调节细胞周期、增殖和发育以及控制细胞存活和凋亡(Meddersetal.2011)。研究发现，新城疫病毒（Newcastlediseasevirus，NCV）可激活透明细胞肾癌细胞中的p38MAPK信号通路，活化的p38MAPK激活NF-κB/Iκ-Bα然后经由PARP介导细胞凋亡(Ch'ngetal.2015)。HIVgp120诱发巨噬细胞和小胶质细胞的神经毒性表型以及巨噬细胞毒素引发的神经元细胞凋亡过程中均依赖于p38MAPK信号转导(Meddersetal.2011;Meddersetal.2010)。HIV-1诱发机体出现获得性免疫缺陷综合症和HIV相关神经+认知障碍均是由活化的p38MAPK诱导CD4T细胞凋亡引起的(Kipnisetal.2008;Perfettinietal.2005)。此外，活化的p38还可以促进炎性因子的产生和病毒复制(Chenetal.2017;Johnsonetal.2014;Lietal.2016c;Mikkelsenetal.2009;Shinetal.2015)，是病毒感染诱导组织病变的重要机制。1.2.4.3JNK在多种病毒诱导机体病变过程中可检测到活化的JNK，如呼肠孤病毒感染小鼠中枢神经系统过程中即激活了JNK，且呼肠孤病毒感染的神经细胞与病毒诱导损伤和凋亡的区域位于相同位置，推测细胞凋亡与JNK的激活有关(Beckhametal.2007)。近些年，在多种病毒诱导细胞凋亡过程中检测到活化的JNK，表明JNK在病毒诱导凋亡过程中起着重要作用。如呼肠孤病毒诱导神经系统疾病过程中、HSV-1和HSV-2诱导中枢神经系统疾病中以及赤羽病毒（akabanevirus，AKAV）诱导流产、死胎和先天性疾病中JNK作为促凋亡因子参与其中(Mitomoetal.2016;Morietal.2003;Perkinsetal.2003)；JNK作为促凋亡因子参与病毒诱导细胞凋亡过程中，可通过对Bcl-2家族成员进行翻译后修饰或激活转录因子和促进凋亡相关因子的转录诱导细胞凋亡。如JNK在猪繁殖和呼吸综合征病毒（porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV）感染宿主细胞过程中发生磷酸化，并通过抑制Bcl-2家族中抗凋亡蛋白Mcl-1和Bcl-xl的表达介导细胞凋亡，但PRRSV感染诱导的JNK激活对病毒复制并未起到调控作用(Yinetal.2012)；但活化的JNK可通过激活未折叠蛋白反应（unfoldedproteinresponse，UPR）调控PRRSV的复制(Huoetal.2013)。同时，JNK还可通过上调死亡受体的同源配体的表达诱导细胞凋亡。HBV诱导肝细胞和肾小管细胞凋亡过程中可通过MLKs-MKK7-JNKs信号通路上调FasL的表达，从而水平激活死亡受体通路诱导细胞凋亡(Heetal.2016)。然而，猪流行性腹泻病毒（porcineepidemicdiarrheavirus，PEDV）感染宿主细胞过程中，活化的JNK仅参与调控PEDV在细胞中病毒RNA的合成、病毒蛋白的表达和子代病毒的释放， 8猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究但并不参与调控PEDV诱导的细胞凋亡(Leeetal.2016)。1.3细小病毒诱导的细胞凋亡细小病毒是一种无囊膜单链DNA病毒，基因组全称为5000bp左右。细小病毒科可分为细小病毒亚科（Parvovirinae）和浓核症病毒亚科（Densovirinae），其中细小病毒亚科可分为阿留申貂病毒属（Amdovirus）、博卡病毒属（Bocavirus）、依赖病毒（Dependovirus）、红细胞病毒属（Erythrovirus）和细小病毒属（Parvovirus）(Cotmoreetal.2014)；代表病毒分别为阿留申水貂病病毒（AleutianminkDiseaseVirus，AMDV）、牛细小病毒（BovineParvovirus，BPV）、腺相关病毒（Adeno-associatedvirusserotype，AAV）、人细小病毒B19（B19humanparvovirus，B19V）和PPV。其中只有依赖病毒属病毒的复制需要辅助病毒协助才可有效感染细胞(Alazard-Danyetal.2009;Cotmoreetal.2014;Geoffroyetal.2005;Stutikaetal.2015)外，其他病毒均为自主复制型病毒；而浓核症病毒亚科仅感染节肢动物(Cotmoreetal.2014)。细小病毒可在环境中能稳定存在，经粪-口、尿液和呼吸传播可经污染物随时感染宿主。研究发现，许多自主复制型细小病毒，包括犬细小病毒（canineparvovirus，CPV）、猫泛白细胞减少症病毒（felinepanleukopeniavirus，FPV）、人细小病毒B19（B19humanparvovirus，B19V）和PPV可通过诱导细胞凋亡引起机体病变。先天免疫系统是机体抵抗病毒感染的第一道防线，部分细小病毒可通过激活宿主的先天免疫反应，间接的诱导细胞凋亡以达到清除病毒的目的。研究发现，犬细小病毒2a（Canineparvovirustype2a，CPV-2a）感染MDCK细胞可诱导一系列的膜相关基因的表达，主要包括编码MHC蛋白和MHC相关复合体的基因。这些基因参与病毒-宿主相互作用的多种相关信号转导通路，如参与抗原加工和呈递通路、免疫应答反应、病毒诱导宿主疾病相关信号通路，以及RLR信号转导通路等。这也就表明CPV-2a可作为一种天然免疫激活剂，激活宿主对病毒的识别及抗病毒免疫应答(Fanetal.2016)，进而激活机体的抗病毒机制，并能够通过诱导宿主细胞凋亡清除感染CPV-2的细胞。大鼠细小病毒（ratparvovirusH-1，H-1PV）感染宿主细胞后可被TLR3和TLR9识别，进而激活NF-κB信号转导通路，大量表达的NF-κB可诱导TNF-α大量表达，进而通过激活死亡受体通路诱导细胞凋亡以清除感染细胞(Siebenetal.2013)。B19V急性感染期和恢复期，可导致机体TNF-α的分泌水平升高(Kerretal.2001)；B19V感染细胞后，B19V非结构蛋白NS1可增强新感染细胞中促炎细胞因子TNF-α和IL-6等的产生(Duechtingetal.2008;Fuetal.2002;Hsuetal.2006)或通过与细胞DNA共价结合诱导细胞凋亡(Pooleetal.2011)。+同时，B19V还能够激活具有细胞溶解潜能的CD4T细胞，使其释放大量的颗粒酶B和穿孔蛋白，进而切割细胞中的caspase蛋白激活caspase级联反应，诱导细胞凋亡(Kumaretal.2015)。PPV感染PK-15细胞中可通过调控细胞中miRNA的表达，调控宿主细胞的免疫应答(Lietal.2015)，或被TLR9受体识别后激活NF-κB信号转导通路进而诱导 第一章病毒诱导宿主细胞凋亡研究进展9IL-6大量表达以激活宿主细胞的抗病毒免疫应答能力(Caoetal.2017;Zhouetal.2017)，最终通过诱导细胞凋亡等方式清除病毒感染细胞。同时，研究发现，细小病毒还可通过直接激活凋亡相关因子诱导细胞凋亡。如B19V感染造血干细胞后B19V的非结构蛋白NS1可激活caspase-8经死亡受体通路诱导其造血干细胞发生凋亡(Moritaetal.2002;Soletal.1999;Yaegashietal.1999)，进而引发机体贫血等症状的出现。此外，通过转染B19的非结构蛋白NS1，可诱导不支持B19复制的细胞系发生凋亡(Pooleetal.2011;Pooleetal.2006;Thammasrietal.2013)，如在猴上皮细胞中B19的NS1蛋白可通过激活p53-线粒体通路诱导细胞凋亡(Hsuetal.2004)。CPV感染犬肾细胞可使p53mRNA水平和蛋白表达升高，激活p53转录依赖型和非依赖型通路，进而经死亡受体通路和线粒体通路诱导犬肾细胞凋亡(Doleyetal.2014)；同时有研究表明，CPV的非结构蛋白NS1可通过诱导细胞中ROS升高激活线粒体通路介导的细胞凋亡(Guptaetal.2016;Saxenaetal.2013)。PPV感染可引起PK-15细胞凋亡过程中可通过诱导p53发生磷酸化，然后经由磷酸化的p53上调促凋亡蛋白Bax的表达，并下调抗凋亡蛋白Bcl-2，进而调控线粒体膜通透性，促进细胞色素c释放进入细胞质中，进而活化caspase-9激活线粒体通路诱导PK-15细胞凋亡(Zhangetal.2015)；在ST细胞中，PPV感染可通过诱导细胞中ROS升高进而激活线粒体通路诱导ST细胞凋亡(Zhaoetal.2016)。研究还发现PPV的非结构蛋白SAT可诱导细胞发生不可逆的内质网应激反应，并直接诱导宿主细胞发生凋亡以利于PPV的释放(Meszarosetal.2017)。此外，研究发现猫泛白细胞减少症病毒（felinepanleukopeniavirus，FPV）(Bauderetal.2000)、大鼠细小病毒（ratparvovirusH-1，H-1PV）(Hristovetal.2010;Ohshimaetal.1998;Ranetal.1999)等细小病毒感染细胞后也可通过直接激活不同的信号通路诱导宿主细胞凋亡。1.4本研究的目的意义自1966年首次发现PPV以来，研究学者发现PPV引起的母猪繁殖障碍性疾病已对世界各国的养猪业造成了严重的危害。黄体组织在维持妊娠和胎儿发育过程中起着至关重要的作用，有报道称PPV感染可引起妊娠猪黄体组织损伤，降低机体孕酮水平。但PPV诱导黄体组织损伤和孕酮含量降低的作用机制尚不明确。因此，本研究首先采集妊娠猪黄体组织通过胶原酶消化法和密度梯度离心法获得原代猪黄体细胞，经转染外源性hTERT基因建立一株维持原代猪黄体细胞形态学特性、生物学特性和功能特征的永生化猪黄体细胞系，为后续研究提供可靠的细胞模型。然后，用PPV感染原代和永生化猪黄体细胞，通过qPCR法、Hoechst33258染色、DNA片段化分析、流式细胞术明确PPV感染对黄体细胞凋亡的影响，并通过Westernblotting等方法确定死亡受体通路、线粒体通路、p53信号转导通路和MAPKs信号转导通路在PPV诱导猪黄体细胞凋亡过程中的作用。并通过免疫放射法、Real-timeRT-PCR、Westernblotting等方法检测PPV感染过程中对黄体细胞孕酮产生的影响及相应的作用机制，以期为研究PPV致病机理奠定理 10猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究论基础。最后，PPV人工感染初孕母猪，通过免疫放射法、原位杂交、TUNEL染色结合间接免疫荧光法、透射电子显微镜和Westernblotting等方法，从体内水平进一步验证PPV感染对黄体细胞凋亡和黄体细胞孕酮产生的影响及相应机制。本研究结果将从体内和体外水平揭示PPV感染诱导黄体细胞凋亡和孕酮水平下降的分子作用机制，为防控PPV诱导繁殖障碍性疾病的发生奠定理论基础，同时也可以为研究其他病毒引起的动物繁殖障碍性疾病的分子机制提供思路。 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定11试验研究第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定黄体（Corpusluteum）是动物排卵后形成的一个暂时性的内分泌器官。黄体通过合成孕酮（progesterone，P4），在调控发情周期和维持妊娠的过程中发挥着关键作用(Niswenderetal.2000;Stoccoetal.2007)。黄体组织由大黄体细胞（largelutealcells）、小黄体细胞（smalllutealcells）、成纤维细胞、内膜细胞、周细胞和免疫细胞组成(Maronietal.2012;O'Sheaetal.1989;Stoccoetal.2007;Walusimbietal.2013)，其中大、小黄体细胞是合成孕酮的关键细胞，对发挥黄体的功能起着重要作用(Nelsonetal.1992)。研究表明，一些外部因素（如活性氧、脂多糖以及病毒等）可通过影响黄体功能，使动物出现流产、死胎等繁殖障碍性疾病(Luttgenauetal.2016a;Luttgenauetal.2016b;Milleretal.1986;Nodaetal.2012)。建立永生化的猪黄体细胞系，从细胞和分子水平探讨这些繁殖障碍性疾病的发生发展过程，阐明其发病机制成为当务之急。有研究报道，通过转染外源性人端粒酶反转录酶（humantelomerasereversetranscriptase，hTERT）可以建立的多种细胞系，且并未观察到形态学、染色体和功能异常(Barbieretal.2005;Condonetal.2002;Dongetal.2013;Krikunetal.2004;Lietal.2012)。因此本试验拟建立永生化的猪黄体细胞，以期为研究因猪繁殖障碍性疾病的发病机理提供可靠的体外细胞模型。2.1试验材料2.1.1卵巢组织卵巢组织来源于妊娠30~50d的健康母猪，通过测定妊娠母猪的臀长度确定妊娠时间(Mesaetal.2012;Zhangetal.2016)。2.1.2实验动物8周龄雌性胸腺缺陷型BALB/c裸鼠4只，购自于第四军医大学实验动物中心。2.1.3质粒和细胞pCI-neo-hTERT质粒由西北农林科技大学动物医学院靳亚平教授赠予。HeLa细胞由本实验室保存。2.1.4主要试剂胶原酶Ⅰ型SigmaPercoll分离液SigmaX-tremeGENEHPDNATransfectionReagentRoche 12猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究去内毒素质粒中提试剂盒OmegaG418SigmaPLUSTeloTAGGGTelomerasePCRELISAkitRoche反转录试剂盒InvitrogenTRIzolInvitrogenTaqpolymeraseTAKARA促黄体素宁波第二激素厂氯前列烯醇宁波第二激素厂BCA蛋白浓度检测试剂盒VazymerabbitmonoclonalantibodyStARCellSignalingTechnologyrabbitmonoclonalantibodyP450sccCellSignalingTechnologygoatpolyclonalantibody3β-HSDSantaCruz125碘（I）孕酮放射免疫检测试剂盒天津九鼎生物技术有限公司2.1.5主要试剂的配置（1）1000×3β-羟基类固醇脱氢酶（3β-hydroxysteroiddehydrogenase，3β-HSD）活性染色液：牛血清白蛋白0.1g辅酶Ⅰ0.1g硝基蓝四氮唑0.023g去氢表雄酮0.023g溶于100mLPBS中，0.22μm滤器过滤分装后，-20ºC避光保存。（2）油红O（Oil-Red-O）染色液：Oil-Red-O母液的配置：Oil-Red-O0.5g异丙醇100mL在密闭的玻璃瓶中搅拌过夜，0.45μm滤器过滤后室温避光保存；Oil-Red-O工作液的配置（需新鲜配置）：待使用时，以Oil-Red-O母液ːddH2O=3ː2的比例混合，经0.45μm滤器过滤后制成Oil-Red-O工作液。2.1.6主要仪器倒置相差显微镜OlympusNanoDrop2000紫外分光光度仪ThermoASIChromosomeAnalysisSystemIsrael微板分光光度计（Infinite200PRONano-Quant）Thermo 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定13透射电子显微镜（PhilipsCM12）Philips正置显微镜Leica2.2试验方法2.2.1原代猪黄体细胞的分离、纯化取妊娠30~50d的健康母猪卵巢，放在含有100U/mL双抗的PBS缓冲液中，30min内带回实验室；将所取卵巢用含有100U/mL双抗的无菌PBS缓冲液清洗3~5次，放入无菌平皿中，一手用无齿镊子夹住卵巢，一手用鼠齿钳剥去外层白膜，将分离得到的肉3色黄体组织放入另一无菌平皿中；用手术剪把组织剪成小块（体积小于1mm），将剪碎的组织转入无菌15mL离心管中；加入3mL0.2%Ⅰ型胶原酶溶液，在37ºC恒温水水浴槽中消化40min，每15min震荡1次；用200目不锈钢细胞筛网过滤，以除去未消化完成的组织块，收集滤液，1500r/min离心8min，弃去上清液，再用冷的PBS缓冲液洗涤4次，弃去上清液；用5mLM199重悬细胞。用浓度为60%的Percoll分离液400×g离心30min，去除红细胞；然后将不同浓度的Percoll分离液（40%、20%、15%、10%和5%，5个梯度，每个梯度5mL），用移液器沿管壁缓缓的从高密度向低密度逐层加至50mL的尖头离心管中。将去除红细胞后的原代细胞（5mLM199培养液重悬）沿离心管管壁缓缓加到不同浓度的Percoll分离液的最上层；400×g离心20s，收集位于40%Percoll分离液中的细胞（大黄体细胞）。用M199培养基洗涤3次后，0.4%台盼蓝4染色，对活细胞进行计数，然后用含10%FBS的M199培养液调整细胞密度至7.5×10cells/mL，吸取2mL接种到6孔板内（已用多聚赖氨酸包被），放入37ºC、5%CO2培养箱中进行观察。2.2.23β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色鉴定2.2.2.13β-HSD活性染色将分离获得的原代猪黄体细胞接种至放置有细胞爬片的24孔板中，待细胞密度达到80%左右时，用4%多聚甲醛固定1h后，将固定好的细胞用PBS漂洗3次，加入300μL3β-HSD染色液，然后在37ºC条件下避光孵育过夜。PBS漂洗3次后，显微镜下观察染色结果并拍照记录。2.2.2.2Oil-Red-O染色鉴定将分离获得的原代猪黄体细胞接种至放置有细胞爬片的24孔板中，待细胞密度达到80%左右时，用4%多聚甲醛固定1h后，将固定好的细胞用PBS漂洗3次，将新鲜配置的Oil-Red-O工作液经0.45μm的滤器过滤后，加至细胞中染色30min。染色结束后用PBS漂洗3次，然后在显微镜下观察染色结果并拍照记录。 14猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究2.2.3猪黄体细胞的永生化2.2.3.1确定G418最佳筛选浓度4将原代猪黄体细胞接种至24孔板内（3×10cells/孔），接种24h后，按照每50μg/mL一个梯度浓度的G418剂量（100~1000μg/mL）处理原代猪黄体细胞，每个浓度梯度的G418设置3个复孔，且每2d更换一次培养液，并每天记录各浓度G418处理下原代猪黄体细胞的死亡情况。待筛选至14d时，确定杀死全部细胞的最小G418浓度即为G418最佳筛选浓度。2.2.3.2pCI-neo-hTERT质粒转染原代猪黄体细胞及pCI-neo-hTERT稳转细胞系的筛选经去内毒素中提试剂盒获得无内毒素pCI-neo-hTERT质粒；然后采用Roche公司X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent进行转染。具体操作步骤如下，将X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent和pCI-neo-hTERT质粒平衡至15~25ºC，短暂漩涡混匀X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent；使用无血清培养基将pCI-neo-hTERT质粒稀释至终浓度为1μg质粒DNA/100μL含10%FBS的M199培养基（0.01μg/μL），轻柔混匀；将3μLX-tremeGENEHPDNATransfectionReagent（μL）加入含有1μgpCI-neo-hTERT质粒DNA的100μL培养液中；X-tremeGENEHPDNATransfectionReagent和pCI-neo-hTERT质粒DNA转染复合物孵育15min后，逐滴加入细胞中，并轻柔振荡或旋转培养皿或培养瓶，确保培养物均匀分布于培养板表面。孵育细胞48h后，更换含100μg/mLG418的完全培养液（含10%FBSM199）继续培养2周；然后将G418浓度降低为50μg/mL，并对存活的细胞进行连续稀释，以获得单克隆细胞。2.2.4转染后的猪黄体细胞端粒酶基因表达及活性鉴定2.2.4.1RT-PCR（Reversetranscription-polymerasechainreaction）法检测转染后猪黄体细胞中hTERT基因的表达（1）引物设计：用于检测hTERT基因的引物序列参考DongFetal.andLiWetal.(Dongetal.2013;Lietal.2012)，ACTB作为内参基因，其引物序列设计参考DingLetal.(Dingetal.2012)。hTERT和ACTB引物序列如下表2-1。表2-1RT-PCR用引物Table2-1TheprimersusedforRT-PCRAbbreviationSequence(5’to3’)ProductlengthGenBankaccessionnumberFTATGCCGTGGTCCAGAAGGhTERT384bpNM_001193376.1RCAAGAAATCATCCACCAAACGFGGACTTCGAGCAGGAGATGGACTB138bpXM_003124280.4RAGGAAGGAGGGCTGGAAGAG注：F指上游引物；R指下游引物。Note:F,Forwardprimer;R,reverseprimer. 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定15（2）RNA提取：原代猪黄体细胞、转染后第30和50代的猪黄体细胞和HeLa（阳性对照）的总RNA采用Invitrogen公司的TRIzol试剂进行提取，用4ºC预冷的PBS漂洗细胞3次，尽量彻底去除上清后向细胞中加入适量TRIzol，室温孵育15min；加入体积为所用TRIzol体积0.2倍的氯仿，用力震荡1min后室温静置5min；然后4ºC、12000×g离心15min，取上清，加入与吸取的上清等体积的异丙醇，将液体颠倒混匀后，室温静置10min，然后放入-80ºC冰箱中静置过夜。4ºC、12000×g离心15min后弃上清；接着用1mL75%乙醇轻洗沉淀2次，颠倒混匀后4ºC、12000×g离心15min，弃上清。最后室温干燥RNA沉淀，并用适量DEPC水溶解RNA沉淀，混匀后紫外分光光度仪NanoDrop2000检测所提RNA质量。（3）RT-PCR：RT-PCR反应体系如下：OligodT2μLdNTP1μLRNA2μgDEPC水Addto12μL混匀后65ºC，5min；冰浴2min后，再加入：5×Buffer4μLDTT2μLRNA酶抑制剂1μLM-MLV1μL混匀后20ºC，15min；37ºC，60min；75ºC，20min。（4）PCR：PCR扩增体系如下：2+10×Buffer（Mg）2.5μLdNTP0.5μL上游引物1μL下游引物1μLcDNA1μLTaq聚合酶0.5μLddH2O18.5μL混匀后95ºC，5min；随后95ºC，30s；60ºC，30s；72ºC，60s进行30个循环；最后72ºC延伸10min。制备2%琼脂糖核酸胶，120V进行核酸电泳30min。电泳结束后，凝胶成像系统拍照记录。2.2.4.2转染后猪黄体细胞端粒酶活性检测PLUS使用Roche公司TeloTAGGGTelomerasePCRELISA试剂盒对转染后猪黄体细胞的端粒酶活性进行检测，具体操作步骤如下：0.125%的胰酶消化细胞，并用血细胞计 16猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究6数器进行细胞计数，分别收集2×10个原代培养黄体细胞、转染后第30和50代的猪黄体细胞和HeLa（阳性对照）；用4ºC预冷的PBS漂洗细胞3次，然后用200μLlysisreagent重悬细胞，放置冰上裂解30min，且每隔10min吹打1次；4ºC、16000×g离心20min；小心收集上清至另一支离心管中，-80ºC保存备用。在PCR管中加入1μL细胞提取液、25μLReactionmixture和5μLInternalstandard；补ddH2O至50μL；25ºC条件下延伸30min，94ºC条件下灭活5min；然后94ºC，30s，50ºC，30s，72ºC，90s进行30个循环；最后72ºC延伸10min。PCR产物用异羟基洋地黄毒苷标记的端粒重复片段特异的ELISA试剂盒在30min内进行检测。用酶标仪读取450nm和690nm处的吸光值。同时细胞裂解液在85ºC下灭活10min后作为阴性对照。样品的吸光值为Absorbance（Abs）=Abs450-Abs690。若样品的吸光值（Abs）减去阴性对照的吸光值（Abs,o）大于2Abs,o，即认为端粒酶阳性。2.2.5核型分析在位于对数生长期的原代猪黄体细胞、转染后第30和50代的猪黄体细胞中加入秋水仙素至终浓度为0.1μg/mL；37ºC、5%CO2下孵育4h后，胰酶消化收集处理过的细胞，用低渗盐溶液0.04MKCl在37ºC下处理20min；然后缓慢加入等体积新鲜配置的预冷的甲醇ː乙酸混合液（体积比为3ː1，v/v），4ºC、1000×g离心10min，弃上清，在涡旋振荡仪上震荡细胞团块，再缓缓加入新鲜配置的预冷的甲醇ː乙酸混合液，4ºC、1000×g离心10min，如此重复3次后弃上清；然后用0.2mL甲醇ː乙酸混合液重悬细胞，并用吸管从高处滴落至预冷的玻片上，使液滴尽量铺开，然后将玻片迅速干燥。然后进行Giemsa染色10min，最后用流动水冲掉Giemsa染色液，油镜下观察。2.2.6透射电子显微镜观察61800r/min离心10min，分别收集3×10个原代猪黄体细胞和转染后第30和50代猪黄体细胞于1.5mL箭头离心管中；然后用预冷的PBS重悬细胞后1800r/min离心10min，如此重复2次后，弃上清，然后缓缓加入2.5%戊二醛（避免冲散细胞团）4ºC过夜固定细胞团，取出离心管中的细胞团，放入PBS中浸泡冲洗1次，然后加入预冷的1%锇酸置于4ºC固定60min，放入PBS中浸泡冲洗3次；置于丙酮/醋酸异戊酯(1:1)脱水10min，用30%、50%、70%、80%、90%、95%、100%梯度酒精脱水每个梯度脱水30min；然后用树脂单体与硬化剂的混合物进行包埋，以替换脱水剂，直到包埋剂均匀地浸透细胞。向2号胶囊模块孔的底部滴加适量包埋剂，把细胞团转移到胶囊底部的中心，然后向胶囊中注满包埋剂，放入60ºC烤箱中烘烤2h，使包埋剂凝固成硬块。取出包埋块，在立体显微镜下将含有细胞样品的部分用刀片修整成足够小的金字塔形，接着用超薄切片机将其切成厚度≤100nm的超薄片，将超薄切片漂浮到水面上。从水面上将切片捞至敷有薄支持膜的特制金属网上；在蜡纸上滴上少量醋酸铀染液，然后将载有切片的金属网轻轻浸入醋酸铀染液中，染色20min，以增强细胞结构的电子反差。染 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定17色结束后，进行水洗后，同样在蜡纸上滴上少量的柠檬酸铅染液，将金属网放入其中染色15min，然后用1%NaOH溶液漂洗1次，水洗2次。将载有切片的金属网凉干后，用真空喷镀仪进行导电处理。最后在透射电镜下观察细胞的超微结构并拍照记录。2.2.73β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色鉴定转染后黄体细胞将转染后30代和50代的猪黄体细胞接种至放置有细胞爬片的24孔板中，待细胞密度达到80%左右时，用4%多聚甲醛固定1h后进行3β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色（方法同2.2.2）。2.2.8台盼蓝法鉴定细胞活性胰酶消化获得细胞后，制成细胞悬液，然后进行适当浓度稀释后，取100μL细胞悬液，加入1滴新鲜配置的0.4%台盼蓝染色液，室温下孵育5min后，用细胞计数板进行细胞计数，其中被染为蓝色的记为死细胞，不着色且折光性好的细胞为活细胞，在显微镜下对死细胞和活细胞分别计数后，根据公式：细胞存活率（%）=活细胞数/（活细胞数+死细胞数）×100%，即得细胞存活率。2.2.9RT-PCR法检测类固醇激素合成相关分子的表达促黄体素受体（Luteinizinghormonereceptor，LHCGR）、催产素受体（Prolactinreceptor，PRLR）、雌激素受体（Estrogenreceptor，ESR）、孕酮受体（Progesteronereceptor，PGR）以及前列腺素F2α受体（ProstaglandinF2αreceptor，PGF2αR）在调控黄体细胞合成孕酮的过程中起着关键作用。类固醇敏感调节蛋白（Steroidogenicacuteregulatoryprotein，StAR）、3β-HSD、P450胆固醇侧裂分解酶（P450cholesterolside-chaincleavageenzyme，P450scc）和20α-HSD等在调控孕酮合成过程中起着关键作用。因此，为验证转染后黄体细胞保持了黄体细胞的关键生物学特性，设计STAR、HSD3B1、CYP11A1、LHCGR、PGR、PRLR、ESR1、ESR2、AKR1C1、和ACTB引物，如下表2-2（其中AKR1C1引物序列参考(Nanjidsurenetal.2014)）： 18猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究表2-2RT-PCR用引物Table2-2TheprimersusedforRT-PCRGenBankaccessionAbbreviationSequence(5’to3’)ProductLengthnumberSTARFCGTCGGAGCTCTCTTCTTGG124bpNM_213755.2RCCTCCTGGTTGCTGAGGATGHSD3B1FCTCCGTGGTCATCCACACTG164bpNM_001004049.1RGTCCAGCCACCTCTATGCTGCYP11A1FGTCCCATTTACAGGGAGAAGCTCG182bpNM_214427.1RGGCTCCTGACTTCTTCAGCAGGAKR1C1FGCCATTGCCAAAAAGGCACAAG229bpNM_001044569.1RTGGATAGTCAGGGTGACCAACLHCGRFCAGCCACTGCTGTGCTTTTA196bpNM_214449.1RGAGTGTCTTGGGTGAGCAGAPGRFGTGTCCTTACCTGTGGGAGC392bpNM_001166488.1RAGTGTCGGGTTTGGTGTTGTPRLRFTGGGAGACTCATTTCGCTGG339bpNM_001001868.1RAAGCTCTTCGGACTTGCCTTESR1FAGGGAAGCTCCTGTTTGCTC212bpNM_214220.1RCCAGAGACTTCAGGGTGCTGESR2FGCCGACAAGGAACTGGTACA399bpNM_001001533.1RATCAGTCACGGCATTCAGCAACTBFGGACTTCGAGCAGGAGATGG138bpXM_003124280.4RAGGAAGGAGGGCTGGAAGAG注：F指上游引物；R指下游引物。Note:F,Forwardprimer;R,reverseprimer.同时，用分别转染连接有STAR、HSD3B1、CYP11A1、LHCGR、PGR、PRLR、ESR1、ESR2和AKR1C1片段的pCI-neo质粒的PK-15细胞作为阳性对照，构建表达质粒的引物设计如表2-3。后续总RNA提取、RT-PCR及PCR试验方法步骤同2.2.4.1。 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定19表2-3RT-PCR阳性对照用引物Table2-3TheprimersusedforpositivecontrolsinRT-PCRAbbreviationSequence(5’to3’)RestrictionSiteProductLengthSTARFCCTCGAGGTTCGACGTCGGAGCTCTCTTXholⅠ247bpRGCGTCGACTAAAGCCTCTCCATGGGCTGSalⅠHSD3B1FGGCTAGCCTGGATGAGCAGTGCCTGAAGNheⅠ447bpRCCCCGGGGTCAGGACGCCATTGTTCTCCSmaⅠCYP11A1FCCTCGAGGTCCCCTCTTCCTGGTGACAATXholⅠ388bpRGCGTCGACCCGACGAAGTCCTGAGACACSalⅠAKR1C1FCCTCGAGGTGGGTGAACCTAAACCACCCXholⅠ334bpRGCGTCGACACAGCTCTGGAAGCATGATGTSalⅠLHCGRFCCTCGAGGCCCTGCCTAGTTATGGGCTGXholⅠ332bpRGCGTCGACTTCGGGAGCACATTGGAGTGSalⅠPGRFCCTCGAGGTGTGGGGATGAAGCATCAGGXholⅠ427bpRGCGTCGACTCGAAGTGTCGGGTTTGGTGSalⅠPRLRFCCTCGAGGCGAACCAGATGGGAAGCAGTXholⅠ562bpRGCGTCGACAGAAGCTCTTCGGACTTGCCSalⅠESR1FCCTCGAGGGCTGGCTACATCATCTCGCTXholⅠ456bpRGCGTCGACTGCAAGGAATGCGATGGAGTSalⅠESR2FCCTCGAGGGCCGACAAGGAACTGGTACAXholⅠ448bpRGCGTCGACACTGCTGCTGGGAGGAGATASalⅠ注：F指上游引物；R指下游引物。上述基因GenBank序列号与表2-2对应基因的序列号相同。Note:F,Forwardprimer;R,reverseprimer.TheGenBankaccessionno.areallsamewiththeno.showeninTable2-2.2.2.10放射免疫法检测LH和氯前列烯醇刺激后孕酮的产生5分别将1.5×10个原代黄体细胞或转染后50代的猪黄体细胞接种至6孔板中，细胞贴壁后，用浓度为0、1、5、10IU/mL促黄体素（Luteinizinghormone，LH）或浓度为0、1、2、4μg/mL氯前列烯醇—PGF2α类似物处理细胞24h。然后收集上清，储存于-20ºC待采用免疫放射法（radioimmunoassay，RIA）检测孕酮含量时取出并进行检测。每个样品来自独立重复3次的试验。125采用碘[I]-孕酮放射免疫检测试剂盒检测上清中的孕酮浓度，其组内和组间变异系数分别为7.2%和8.9%，最小检测值为0.03ng/mL。 20猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究2.2.11Westernblotting法检测LH和氯前列烯醇刺激后孕酮合成过程中关键蛋白和酶的表达5分别将1.5×10个原代黄体细胞或转染后50代的猪黄体细胞接种至6孔板中，细胞贴壁后，用浓度为0、1、5、10IU/mL促黄体素（Luteinizinghormone，LH）或浓度为0、1、2、4μg/mL氯前列烯醇—PGF2α类似物处理细胞24h。然后用预冷的PBS漂洗细胞2次后，用预冷的RIPA裂解液（含1mmol/mL蛋白酶抑制剂—苯甲基磺酰氟（phenylmethylsulfonylfluoride，PMSF））冰上裂解细胞30min。接着12000×g、4ºC离心15min，收集上清。BCA蛋白浓度检测试剂盒检测各样品的蛋白浓度，并用5×蛋白上样缓冲液与各蛋白样品混匀后，煮沸10min，然后待其冷却至室温后，放入-20ºC保存备用。根据TAKARA产品目录说明书中12%SDS-PAGE的配置方法制备分离胶和浓缩胶，然后每孔加入40μg总蛋白进行蛋白电泳。电泳结束后，进行膜转印将蛋白转印至PVDF膜上，然后用5%脱脂奶粉封闭2h，一抗4ºC孵育过夜。PBST洗涤5次，5min/次；然后辣根过氧化物酶标记的二抗室温条件下孵育1h。PBST洗涤结束后，滴加ECL发光液后，用X-Ray胶片进行曝光、显影和定影，以获得蛋白图像。2.2.12软琼脂试验及裸鼠致瘤试验软琼脂克隆形成试验可用来监测细胞的致瘤性转化及悬浮生长能力。将浓度为1.2%的软琼脂与2×完全培养液等比例混合，然后向6孔板的每孔中加入2mL，做为底层琼o脂；放入4C冰箱使其凝固。然后，将浓度为0.7%的软琼脂与2×完全培养液等比例混4合后，向其中加入0.2mL含1×10个HeLa细胞（作为阳性对照细胞）或转染后50代猪黄体细胞的细胞悬液，充分混匀后作为顶层琼脂加至底层软琼脂上方。将该6孔板放o入37C、5%CO2培养箱中进行培养，待培养至第15天时在倒置相差显微镜下观察细胞集落的形成情况，直径≥100μm的细胞集落即可视为一个克隆。裸鼠致瘤试验在第四军医大学实验动物中心进行，试验步骤严格遵守实验动物管理及使用标准。取8只8周龄雌性胸腺缺陷型BALB/c（nu/nu）裸鼠，随机分为2组。分6别将1×10个HeLa细胞（作为阳性对照）或转染后50代黄体细胞皮下注射入8周龄雌性胸腺缺陷型BALB/c（nu/nu）裸鼠的右后腿，无菌条件下饲养1个月后，拍照测量肿瘤形成大小。处死裸鼠后，采集细胞接种部位的组织，进行固定、包埋和HE染色观察。2.2.13统计学分析运用SPSS17.0软件对试验所得数据进行统计学分析，结果表示形式为Mean±SEM。使用One-WayANOVA进行差异性分析，如果ANOVA显示组间存在显著差异，则用Tukey’s检验进行均值比较。相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（p˂0.05）。 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定212.3结果2.3.1永生化猪黄体细胞系的建立取妊娠30~50d健康母猪的黄体组织进行原代猪黄体细胞的分离、纯化；然后转染pCI-neo-hTERT质粒并用100μg/mLG418进行后续细胞筛选。通过连续稀释法获得单克隆细胞；然后对获得的单克隆细胞进行扩大培养和类固醇合成功能检测，最终确定一株可连续传代50次并未发生衰老迹象且保存类固醇激素合成能力的细胞，命名为hTERT-PLCs。通过台盼蓝染色法对原代猪黄体细胞和第50代hTERT-PLCs的细胞活性进行检测，发现原代猪黄体细胞和第50代hTERT-PLCs的细胞活性分别为(94.14±2.36)%和(94.78±2.13)%，表明转染外源性端粒酶并未对猪黄体细胞的细胞活性产生显著影响。RT-PCR法检测原代猪黄体细胞（primary）、第30代hTERT-PLCs（immor.(p30)）、第50代hTERT-PLCs（immor.(p50)）和HeLa细胞（阳性对照，pos.contr.）中hTERTmRNA水平，结果显示hTERT-PLCs和HeLa细胞都可检测到大小为384bp的hTERT特异性片段，但原代猪黄体细胞中未检测到该特异性条带（图2-1A）。端粒酶活性检测发现，第30代hTERT-PLCs和第50代hTERT-PLCs的端粒酶活性分别是原代猪黄体细胞的端粒酶活性的2.66倍和2.49倍（p˂0.05）（图2-1B）。结果表明，hTERT-PLCs可持续表达hTERT且维持较高的端粒酶活性。核型分析检测结果显示，第30代hTERT-PLCs（passage30）和第50代hTERT-PLCs（passage50）呈二倍体形式，共19对染色体，其中包含18对常染色体和1对性染色体（2n=36±XX）（图2-1C）。 22猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究图2-1原代猪黄体细胞和永生化猪黄体细胞hTERT表达和活性检测及核型分析A:hTERTmRNA水平检测，M:DNAmarker，1:原代猪黄体细胞，2:第30代hTERT-PLCs，3:第50代hTERT-PLCs，4:HeLa细胞（阳性对照）；B:端粒酶活性检测，所有数据来自于3次独立重复试验结果，不同字母表示差异显著（p˂0.05），相同字母表示差异不显著；C:原代猪黄体细胞、第30和50代hTERT-PLCs核型分析Figure2-1AnalysisofhTERTexpression,activity,andkaryotypeinprimaryandimmortalizedPLCsThehTERTmRNAexpressionwasdetectedbyRT-PCR(hTERT384bpandACTB138bp).LaneM:DNAmarker,Lane1:primaryPLCs,Lane2:hTERT-PLCsatpassage30,Lane3:hTERT-PLCsatpassage50,Lane4:positivecontrol(Helacells).B:Theactivityoftelomerase.Thedataisbasedonthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference.C:ThechromosomeanalysisofprimaryandhTERT-PLCsatpassage30and50 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定232.3.2永生化猪黄体细胞形态学特征的鉴定如图2-2所示，永生化第50代猪黄体细胞的形态学特征与原代猪黄体细胞的形态学特征相似。两者都呈现为多角形，且细胞体积相对较大（图2-2A）。此外，3β-HSD活性染色结果显示，原代猪黄体细胞和永生化猪黄体细胞的细胞核周围胞质成份被染为蓝紫色；同时，Oil-Red-O染色结果显示，原代猪黄体细胞和永生化猪黄体细胞中均含有大量红染的脂滴。透射电子显微镜观察结果显示，原代猪黄体细胞（图2-2B）和永生化猪黄体细胞（图2-2C）的细胞间都存在有间隙连接，且两者的细胞质中都含有大量的线粒体和滑面内质网，这些超微结构的形态特征与黄体细胞的基本超微结构形态特征相似(Hoyeretal.1988)。2.3.3类固醇激素合成过程中相关分子的表达通过RT-PCR法检测原代猪黄体细胞和永生化猪黄体细胞中类固醇激素合成过程中一些关键分子的基因表达情况（猪成纤维细胞为阴性对照细胞）。其中，CYP11A1、HSD3B1、STAR和AKR1C1参与孕酮的合成和降解过程；ESR1、ESR2、PGR、PRLR和LHCGR是黄体细胞的一些特征性受体，并参与黄体细胞的类固醇激素合成的调控（图2-3）。 24猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究图2-2原代猪黄体细胞和永生化猪黄体细胞的形态学特征A:光镜下观察原代黄体细胞和永生化第50代猪黄体细胞的3β-HSD和Oil-Red-O染色结果，Bar=100μm；B和C:透射电子显微镜下观察原代猪黄体细胞（B）和永生化第50代猪黄体细胞的亚细胞结构，N:细胞核，M:线粒体（五角星），S:滑面内质网（箭头），L:脂滴，GJ:间隙连接Figure2-2Morphologicalcharacteristicsofprimaryandimmortalizedporcinelutealcells.A:UnderalightmicroscopeshowingtheprimaryandimmortalizedPLCsatpassage50whichwerestainingwith3β-HSDandOil-Red-Ostaining,bar=100μm;BandC:UndertransmissionelectronmicroscopyshowingthecellultrastructuralmorphologyofprimaryPLCs(B)andimmortalizedPLCsatpassage50(C).N:nucleus,M:mitochondrial(asterisk),S:smoothendoplasmicreticulum(arrows),L:lipiddroplet,GJ:gapjunction 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定25图2-3RT-PCR法检测类固醇激素合成相关蛋白、酶和受体的表达M:DNAmarker，1:原代猪黄体细胞，2:第30代hTERT-PLCs，3:第50代hTERT-PLCs，4:猪成纤维细胞（阴性对照）Figure2-3Theexpressionofsteroidogenesis-relatedproteinandenzymesandreceptorsweredeterminedbyRT-PCR.LaneM:DNAmarker;Lane1:thepositivecontrol;Lane2:primaryPLCs;Lane3:hTERT-PLCsatpassage50;Lane4:porcinefetalfibroblasts(asanegativecontrol)2.3.4LH和氯前列烯醇对黄体细胞孕酮合成的影响通过检测不同激素刺激后，孕酮合成过程中关键蛋白和关键酶的表达情况以及孕酮合成情况确定永生化猪黄体细胞是否保留原代猪黄体细胞的主要生物学功能。用不同浓度的LH（0、1、5、10IU/mL）处理黄体细胞24h后，WB检测结果发现，StAR和3β-HSD蛋白表达水平随LH浓度的增加呈上升趋势，而CYP11A1蛋白水平未见明显变化（图2-4A）。相反，用浓度为0、1、2、4μg/mL的PGF2α类似物氯前列烯醇处理黄体细胞24h后，StAR和3β-HSD蛋白表达呈下降趋势（图2-4A）。此外，RIA检测结果显示，不同浓度LH处理黄体细胞24h可显著增加孕酮的合成；然而，PGF2α类似物氯前列烯醇可显著性降低孕酮的合成（图2-4B）。上述试验结果表明，永生化猪黄体细胞的LH受体（LHreceptor）和PGF2α受体（PGF2αreceptor）具有一定的生物学功能，且永生化猪黄体细胞保留类固醇激素合成活性和类固醇激素降解活性。 26猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究图2-4不同激素对永生化猪黄体细胞StAR、3β-HSD和CYP11A1表达及孕酮合成的影响A:Westernblotting检测StAR、3β-HSD和CYP11A1蛋白水平；B:RIA检测培养基中孕酮水平。所有数据来自于3次独立重复试验结果，不同字母表示差异显著（p˂0.05），相同字母表示差异不显著Figure2-4HormoneeffectsontheexpressionofStAR,3β-HSDandCYP11A1,andtheproductionofP4.A:WesternblottingwasperformedtodetectStAR,3β-HSDandCYP11A1proteinlevels.B:ProgesteronelevelsweremeasuredbyRIAafter24h.Thedataisbasedonthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersmeannosignificantdifference2.3.5体内和体外致瘤性分析为验证hTERT-PLCs是否具有锚定生长的能力，将hTERT-PLCs和HeLa细胞接种至软琼脂上。两周后观察发现，HeLa细胞形成了直径超过100μm的细胞克隆团（图2-5A）；但hTERT-PLCs仍以单个细胞的形式存在，未形成任何细胞克隆团（图2-5B）结果表明，hTERT-PLCs保留了锚定生长的能力，在体外培养条件下未出现恶性转化的现象。然后将hTERT-PLCs和HeLa细胞分别注射入8周龄胸腺免疫缺陷性裸鼠的右后腿皮下组织中。31天后观察发现，注射HeLa细胞裸鼠的右后腿部位形成直径为11.63mm的肿瘤组织（图2-5C）；而注射hTERT-PLCs的裸鼠右后腿部位并未出现明显变化（图 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定272-5D）。处死试验用裸鼠，采集注射hTERT-PLCs和HeLa细胞部位的组织进行组织病理切片观察，发现注射HeLa细胞部位的组织呈现明显的核质比例失衡的现象，且可观察到大量的异形细胞核（图2-5E）；而注射hTERT-PLCs部位的组织并未出现明显的病理变化（图2-5F）。同样，体内试验结果表明，hTERT-PLCs并未出现致瘤性。图2-5永生化猪黄体细胞致瘤性分析A、C、E:阳性对照细胞HeLa细胞的致瘤性分析；B、D、F:hTERT-PLCs的致瘤性分析。（A、B）bar=100μm；（E、F）病理切片图的放大倍数为×100，方框中病理切片图的放大倍数为×200Figure2-5AnalysisoftumorigenicityinimmortalizedPLCs.A,C,E:ThetumorigenicityofHeLacells.B,D,F:ThetumorigenicityofhTERT-PLCs.(A,B)bar=100μm;(E,F)×100magnificationand×200magnificationinthebox2.4讨论端粒酶具有减缓衰老、延长生命长度和使细胞发生永生化的功能(Bibby2003;Oshimuraetal.1997)。前期有研究通过转染温度敏感型SV40突变体和转染外源性hTERT分别建立了永生化大鼠黄体细胞系(Suginoetal.1998)和山羊黄体细胞系(Lietal.2012)。通过转染SV40突变体建立的大鼠黄体细胞系缺失了部分调控类固醇激素合成的关键酶和受体；而通过转染外源性hTERT建立的永生化山羊黄体细胞仍保留正常的核型和原始的黄体细胞特性并未发生恶性转化。此外，通过转染外源性hTERT建立的许多细胞系也都保留了初始细胞的细胞特性(Barbieretal.2005;Condonetal.2002;Dongetal.2013;Krikunetal.2004)。根据上述研究报道，本试验采集妊娠第30~50天健康母猪的黄 28猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究体组织，分离纯化获得原代猪黄体细胞后，通过转染外源性hTERT建立的永生化猪黄体细胞系。本试验中，获得了一株能够连续传代50次并稳定表达hTERT、维持较高端粒酶活性、保留正常核型和具有与原代黄体细胞相同生长特性和生物学特性的永生化猪黄体细胞（hTERT-PLCs）。该永生化猪黄体细胞将为研究黄体细胞的多种细胞特性提供稳定、可靠的细胞模型。黄体通过合成孕酮在调控发情周期和维持妊娠过程中起着重要作用，而黄体孕酮的合成主要依赖于大黄体细胞和小黄体细胞。大、小黄体细胞均为单层生长细胞，这两种细胞的大小和形态各不相同。研究表明，人、牛、水牛和猪的小黄体细胞呈纺锤形，而大黄体细胞呈多边形上皮细胞的形态(Baithaluetal.2013;Gregoraszczuk1983;Gregoraszczuk1985;Leietal.1991)。在黄体孕酮合成过程中，3β-HSD可催化孕烯醇酮转化为孕酮，是黄体细胞的特征性标记酶之一(Blacketal.2005;Stoccoetal.2007;Stoccoetal.2005)；同样，细胞中大量脂滴的存在也是黄体细胞的主要特征之一(BeigiBoroujenietal.2012;Hoyeretal.1988;Meyeretal.1991)。因此，具有3β-HSD活性和含有大量脂滴被认为是黄体细胞的两个基本特性(Lietal.2012;Nelsonetal.1992)。本试验的结果显示，hTERT-PLCs呈多边形且3β-HSD活性染色和Oil-Red-O染色结果均显示为阳性，表明获得的hTERT-PLCs可能为黄体细胞。此外，透射电子显微镜结果显示hTERT-PLCs与原代猪黄体细胞的超微结构相似，细胞中均含有大量线粒体和滑面内质网，同样hTERT-PLCs的超微结构特征与前期黄体细胞超微结构特征研究结果相似(Hoyeretal.1988;Meyeretal.1991)。同时，透射电镜结果显示hTERT-PLCs相邻细胞间存在间隙连接。间隙连接是相邻细胞间传递离子、营养物质和代谢物质的一种通道(Kumaretal.1996)；在卵巢相邻细胞间，间隙连接在卵泡形成、卵子发生和类固醇激素合成过程中起到了电位和新陈代谢信息的传递(Borowczyketal.2007;Gershonetal.2008)。此外，滑面内质网在类固醇激素合成中起着重要作用，滑面内质网中的大量内容物表明细胞具有高度活跃的类固醇激素合成活性(Leietal.1991)。因此，hTERT-PLCs具有与原代黄体细胞相似的形态学特征，且hTERT-PLCs可能是猪黄体细胞。在黄体中，孕酮主要由大、小黄体细胞合成。在孕酮合成过程中，StAR将胆固醇从线粒体外膜转运至线粒体内膜，该步骤为孕酮合成过程中的限速步骤；然后胆固醇被位于线粒体内膜的P450scc代谢为孕烯醇酮；最后，经位于滑面内质网的3β-HSD的催化，孕烯醇酮转化为孕酮(Gregoraszczuk1985;Meyeretal.1991;Stoccoetal.2007)。在某些生理或病理条件下，通过提高20α-HSDmRNA水平，促进孕酮代谢为无活性形式的20α-二氢孕酮，从而降低孕酮水平(Stoccoetal.2000;Stoccoetal.2005;Zhongetal.1998)。与原代猪黄体细胞相似，hTERT-PLCs能够表达类固醇激素合成相关蛋白（如StAR、CYP11A1、3β-HSD和20α-HSD），以及参与调控类固醇激素合成的受体。此外，本试验发现，LH可上调StAR和3β-HSD蛋白表达水平，并增强hTERT-PLCs孕酮的合成，表明hTERT-PLCs保留LHCGR和类固醇激素合成中的相关蛋白和酶的活性。同时， 第二章永生化猪黄体细胞系的建立与鉴定29PGF2α类似物能够下调StAR、3β-HSD蛋白表达，降低孕酮水平。结果表明hTERT-PLCs保留PGF2α受体活性，且保留了黄体细胞功能性降解的特性。上述结果表明，本试验所建立的永生化细胞为黄体细胞，并且该细胞系在研究不同激素、细胞因子和微生物对黄体细胞活性和功能的研究过程中可起到关键作用。综上所述，本试验建立了一株与原代黄体细胞具有相似核型和表型特征的永生化猪黄体细胞系，为从细胞和分子水平研究黄体功能提供了可靠的体外细胞模型。2.5小结建立了一株与原代猪黄体细胞具有形态学特性、生物学特性和功能特征等方面一致的永生化猪黄体细胞系，为从细胞和分子水平研究因黄体功能障碍引起的猪繁殖障碍性疾病的发病机制提供了可靠的细胞模型。 30猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究猪细小病毒（Porcineparvovirus，PPV）是一种自主复制型单链DNA病毒。PPV是诱导猪繁殖障碍性疾病的重要病原之一，感染猪临床表现为不孕、早期胚胎死亡、产死胎、畸形胎和木乃伊胎等症状(Huefferetal.2003;Meszarosetal.2017)。黄体在调控发情周期、受精卵着床和维持妊娠的过程中均起着重要作用(Davisetal.2002;Stoccoetal.2007)。黄体细胞是黄体组织的主要功能细胞(Maronietal.2012;Stoccoetal.2007;Walusimbietal.2013)。研究表明妊娠过程中黄体组织损伤可导致流产、木乃伊胎、胎儿的吸收等现象(Givensetal.2008)。有研究发现，PPV感染可引起妊娠猪黄体组织损伤。然而，PPV感染诱导黄体组织损伤机制尚不清楚。本研究拟以黄体细胞为研究对象，首先通过qPCR法鉴定PPV能否在黄体细胞中进行复制，接着通过Hoechst33258染色、DNA片段化分析、流式细胞术等方法明确PPV感染能否诱导黄体细胞凋亡，进一步通过caspase活性检测和Westernblotting等方法探索PPV诱导黄体细胞损伤的机制，以期为研究PPV致病机理奠定理论基础。3.1试验材料3.1.1病毒和细胞PK-15细胞购买于ATCC公司；试验中所用的PPV病毒为PPVYL株，由本实验室分离获得。试验用原代猪黄体细胞同2.2.1。3.1.2主要试剂GelExtractionKitOMEGACaspase-8活性检测试剂盒南京凯基生物有限公司Caspase-9活性检测试剂盒南京凯基生物有限公司Caspase-3活性检测试剂盒南京凯基生物有限公司PlasmidExtractionMiniKit天根生物技术有限公司Caspase-8inhibitorZ-IETD-FMKSigmaCaspase-9inhibitorZ-LEHD-FMKSigmaBaxInhibitorPeptidesV5Sigmap53signalinginhibitorPTF-αSigmaJNKinhibitorSP600125Sigmap38MAPKinhibitorSB203580MerckTRIzolInvitrogen 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究31SYBRPremixExTaqTMIITAKARAHoechst33258SigmaproteinaseKSigmaRNaseATIANGENBiotechFITCAnnexinVBDBiosciencesPISigamAnti-FasantibodySantaCruzAnti-FasLantibodySantaCruzAnti-Bcl-2antibodySantaCruzAnti-BaxantibodySantaCruzAnti-cytochromecantibodySantaCruzAnti-COX4antibodySantaCruzAnti-HistoneH3antibodyCellSignalingTechnologyAnti-p53antibodySantaCruzAnti-p38MAPKantibodySantaCruzAnti-phosphor-p38MAPKantibodyCellSignalingTechnologyAnti-SAPK/JNKantibodySantaCruzAnti-phospho-SAPK/JNKantibodySantaCruzAnti-β-actinantibody天津三箭生物有限公司Anti-α-Tublinantibody金斯瑞生物有限公司Anti-GAPDHantibody金斯瑞生物有限公司HRP-标记二抗Pierce3.1.3主要仪器倒置相差显微镜Olympus荧光显微镜Leica流式细胞仪Accuri™C6,BDBiosciences微板分光光度计（Infinite200PRONano-Quant）Thermo3.2试验方法3.2.1PPV的扩增及病毒滴度的测定将适量PPV病毒液接种至细胞生长密度为70~80%的PK-15细胞中，待出现明显细胞病变效应（cytopathiceffect，CPF）的细胞超过总细胞数的80%时，收集细胞及上清，反复冻融3次后，离心去除细胞碎片，收集上清-80ºC保存。3将PK-15细胞以5×10cells/孔的细胞量接种至96孔板中，细胞贴附过夜后移除培 32猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究养基，用1×PBS漂洗3次后，加入100μL/孔连续10倍浓度稀释的病毒液，置于37ºC含5%CO2的细胞培养箱中感染2h后再去除病毒液，加入含2%胎牛血清的DMEM培养液继续培养至第5天时，通过Reed-Muench法计算获得PPV的病毒滴度（50%tissuecultureinfectivedoses，TCID50）。3.2.2MTT法检测PPV对黄体细胞细胞活性的影响将黄体细胞以5000cells/孔的数量接种至96孔板中，细胞贴附过夜后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后加入0MOI、0.5MOI、1MOI、2MOI、4MOI、6MOI、8MOI和10MOI的PPV病毒液，同时设立空白对照组、阴性对照组，每个时间段的每个组别设置6个重复孔。接种2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的M199培养液。分别在6h、12hp.i.、24hp.i.、36hp.i.和48hp.i.，向每孔中加入500μg/mLMTT溶液，然后37ºC温箱中孵育4h后，去除培养孔中的上清（轻轻吸取，以免将甲瓒结晶吸走）。接着向每个培养孔中加入150μLDMSO，在震荡摇床上震荡10min后，使用微板分光光度计检测各孔在570nm的吸光值（OD值）。最后根据细胞存活率公式，即细胞存活率=（试验组OD值－空白对照组OD值）/（阴性对照组OD值－空白对照组OD值）×100%，计算获得不同感染量在不同时间的细胞存活率。3.2.3qPCR法检测PPV在黄体细胞中的增殖3.2.3.1引物设计用于检测PPV基因的引物序列参考Boisvertetal.(Boisvertetal.2010)，其引物序列如下表3-1。表3-1qPCR用引物Table3-1TheprimersusedforRT-PCRGenBankaccessionAbbreviationSequence(5’to3’)ProductlengthnumberFGGGGGAGGGCTTGGTTAGAATCACPPV196bpNC_001718.1RACCACACTCCCCATGCGTTAGC注：F指上游引物；R指下游引物。Note:F,Forwardprimer;R,reverseprimer.3.2.3.2病毒DNA提取取437.5μL病毒液，加入12.5μL浓度为20mg/mL的蛋白酶K和50μL10%SDS，充分混匀后，56ºC水浴30min。接着，加入500μL酚︰氯仿︰异戊醇=25:24:1（v/v）剧烈摇晃进行抽提；室温下12000×g离心5min。吸取400μL上清液到另一离心管中，加入400μL氯仿，混匀，5min后12000×g离心5min。吸取300μL上清液到另一离心管中，加入30μL2mol/L的醋酸钠溶液和600μL无水乙醇，-20ºC过夜沉淀。将样品取出后，轻轻混匀，然后4ºC下12000×g离心10min，弃去上清液并加入1mL75% 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究33乙醇轻轻混匀后，4ºC下12000×g离心10min，重复加入75%乙醇并离心弃上清；风干后加入适量ddH2O溶解病毒DNA。3.2.3.3载体构建（1）PCR扩增（25μL体系）：以病毒DNA为模板，使用qPCR引物进行PCR扩增，方法同2.2.9。（2）目的产物胶回收：具体步骤参照OMEGAGelExtractionKit说明书。将目的条带从2%琼脂糖核酸胶上切下并放入1.5mL离心管中，加入适量BindingBuffer后放入55ºC水浴锅中水浴直至胶完全融化，期间每2min颠倒混匀一次。将溶液加入到BindDNAMini-colum，10000×g离心1min；弃去滤液，加入适量BindingBuffer，10000×g离心1min；继续弃滤液，然后加入适量SPWBuffer，室温孵育3min后10000×g离心1min；弃去滤液，再加入适量SPWBuffer，室温孵育3min后10000×g离心1min；弃去滤液后，不加任何试剂并进行10000×g离心1min；将上述用到的BindDNAMini-colum放入新的1.5mL离心管中，加入适量ddH2O，60ºC下孵育2min后，10000×g离心10min。（3）TA克隆（10μL体系）：T4ligaseBuffer1μLT4ligase1μLT-vector0.2μL胶收产物5.6μLddH2O2.2μL16ºC过夜连接。（4）热转化：从-80ºC冰箱中取出100μL的CaCl2感受态（DH-5α）并立刻放置在冰上待其融化；待感受态融化后，迅速向其中加入10μL质粒，快速吹打数次后，冰浴30min。冰浴结束后，42ºC热休克90s；然后迅速将其转移至冰上进行冰浴2min。接着向离心管中加入890μLLB培养液，37ºC条件下恒温摇床中以220rpm转速，摇动1h。结束后，3000×g室温离心3min，倒去上清后，用残余的上清液将沉淀吹打混匀。然后吸取适量菌液进行涂板。37ºC过夜培养后，挑取单克隆，然后在37ºC恒温摇床上以220rpm转速过夜摇菌。（5）重组载体鉴定：使用天根PlasmidExtractionMiniKit提取质粒，具体步骤参见PlasmidExtractionMiniKit说明书。PCR鉴定反应体系同2.2.9。3.2.3.4标准曲线的制作紫外分光光度仪NanoDrop2000测定质粒浓度并根据质粒浓度计算其拷贝数。然后将质粒按10倍比例进行倍比稀释，并进行qPCR扩增。SYBR12.5μLTemplate2μL 34猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究上游引物1μL下游引物1μLddH2O8.5μL扩增曲线：95ºC10min；95ºC15s，60ºC1min，40cycles溶解曲线：45ºC至85ºC，30s/循环，且每循环升高0.5ºC。3.2.4PPV感染对黄体细胞损伤的形态观察3.2.4.1倒置相差显微镜观察4将黄体细胞按3.2×10cells/孔的细胞量接种到24孔细胞培养板中，细胞贴附过夜后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后接种4MOIPPV病毒液；接种2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。分别在12hp.i.、24hp.i.、36hp.i.、48hp.i.（每个时间点均设置有mock组，且每个试验组设置3个重复孔）通过倒置相差显微镜进行观察拍照。3.2.4.2荧光显微镜观察4将黄体细胞按3.2×10cells/孔的细胞量接种到24孔细胞培养板中，细胞贴附过夜后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后接种4MOIPPV病毒液；接种2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。分别在12hp.i.、24hp.i.、36hp.i.、48hp.i.（每个时间点均设置有mock组，且每个试验组设置3个重复孔）使用4%多聚甲醛对细胞进行固定20min，1×PBS漂洗3次后，每孔加入适量的10%Hoechst33258染液进行染色，染色完成后1×PBS漂洗3次，并在荧光显微镜下观察拍照。3.2.5DNA片段化分析5将黄体细胞按1.5×10cells/孔的细胞量接种到6孔细胞培养板中，细胞贴附过夜后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后接种4MOIPPV病毒液；接种2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。然后分别在12hp.i.、24hp.i.、36hp.i.、48hp.i.收集细胞，向所收集的细胞中加入200μL细胞裂解液，吹打均匀后4ºC裂解1h，然后12000×g离心10min，吸取上清液至另一新的离心管中。向其中加入5μLRNaseA，37ºC水浴1h。接着加入5μL蛋白酶K，56ºC水浴1h。然后加入210μL酚︰氯仿︰异戊醇=25:24:1，剧烈混匀，12000×g室温离心10min，将上清转移至新的离心管中；重复抽提一次后，向离心管中加入42μL2mol/L醋酸钠和840μL无水乙醇。-20ºC过夜沉淀，接着4ºC条件下12000×g离心10min，弃去上清液并加入1mL75%乙醇轻轻混匀后，4ºC下12000×g离心10min，重复加入75%乙醇并离心弃上清；风干后加入适量ddH2O溶解DNA。最后，制备2%琼脂糖核酸胶，40V电压下跑胶并拍照记录。3.2.6流式细胞术检测5将黄体细胞按1.5×10cells/孔的细胞量接种到6孔细胞培养板中，过夜细胞贴附后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后接种0MOIPPV（mock）、4MOIPPV病毒液或 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究35抑制剂预处理1h后感染4MOIPPV病毒液24h；2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。分别在4hp.i.、8hp.i.、12hp.i.、24hp.i.收集细胞，1×PBS漂洗3次后，去除上清；然后用400μLBindingBuffer重悬细胞，加入4μLAnnexinV-FITC和4μLPI，轻轻混匀后，室温条件下避光反应30min，接着使用Accuri™C6流式细胞仪检测细胞凋亡率。3.2.7分光光度法检测caspase的活性根据南京凯基生物有限公司Caspase-8、-9、-3活性检测试剂盒说明书进行操作。将5黄体细胞按1.5×10cells/孔的细胞量接种到6孔细胞培养板中，细胞贴附过夜后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后0MOIPPV（mock）、接种4MOIPPV病毒液或抑制剂预处理1h后感染4MOIPPV病毒液24h；2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。分别在4hp.i.、8hp.i.、12hp.i.、24hp.i.收集细胞，冰浴的1×PBS漂洗3次后，去除上清。加入50μL裂解液处理30min后，4ºC条件下12000×g离心15min，收集上清液后用微板分光光度计检测上清浓度。取200μg上清，并用裂解液将上清的体积补足至50μL，然后加入50μL2×ReactionBuffer和5μLCsapase底物，37ºC条件下避光孵育4h。接着用微板分光光度计检测405nm波长处其吸光值。3.2.8抑制剂预处理猪黄体细胞特异性抑制剂预处理黄体细胞1h后，感染4MOIPPV病毒液，并于2hp.i.弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液，继续培养8h或24h。抑制剂处理具体流程见图3-1。图3-1抑制剂预处理流程图Figure3-1Schematicdiagramofinhibitorspretreatment3.2.9Westernblotting法检测死亡受体和线粒体通路主要相关蛋白的表达3.2.9.1细胞总蛋白的提取5将黄体细胞按1.5×10cells/孔的细胞量接种到6孔细胞培养板中，细胞贴附过夜后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后0MOIPPV（mock）和接种4MOIPPV病毒液；2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。分别在4hp.i.、8hp.i.、12hp.i.、24hp.i.收集细胞，冰浴的1×PBS漂洗3次后，去除上清。蛋白提取方法同2.2.11。 36猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究3.2.9.2线粒体蛋白与胞浆蛋白的分离提取将黄体细胞接种0MOIPPV（mock）或4MOIPPV病毒液；2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。分别在4hp.i.、8hp.i.、12hp.i.、24hp.i.收集细胞，冰浴的1×PBS漂洗3次后，去除上清。然后加入1mL线粒体分离试剂吹打混匀细胞，冰浴15min后进行匀浆，直至台盼蓝染色阳性细胞超过总细胞数的50%即可停止。然后将细胞匀浆在4ºC条件下600×g离心10min；收集上清至新的离心管中，接着4ºC条件下11000×g离心10min，收集上清（胞浆蛋白）以及沉淀（线粒体）；然后向沉淀中加入200μL线粒体裂解液进行线粒体蛋白裂解30min。BCA法定量后，加入蛋白上样缓冲液、煮样，-20ºC保存。3.2.9.3细胞核蛋白与胞浆蛋白的分离提取使用冰浴的1×PBS漂洗细胞3次，尽量去除上清后，根据细胞量加入适量的预冷的BufferA（使用前根据使用说明已按照相应比例向每毫升的BufferA中加入了5μL100mol/LPMSF、5μL蛋白酶抑制剂和1μLDTT），涡旋器上涡旋振荡15s后，静置于冰上15min。然后加入预冷的11μLBufferB，涡旋器上涡旋振荡5s，静置于冰上1min。再次涡旋器上涡旋振荡5s，4ºC条件下16000×g离心5min。尽可能迅速地将上清转移至另一预冷的新离心管中，即为胞浆蛋白（冰上放置）。在离心所得的沉淀物中加入100μL预冷的BufferC，涡旋器上涡旋振荡15s，然后在冰上孵育40min，在此期间每间隔10min涡旋震荡15s。接着4ºC条件下16000×g离心5min，尽可能迅速地将上清转移至另一预冷的新离心管中，即为胞核蛋白（冰上放置）。BCA法定量后，加入蛋白上样缓冲液、煮样，-20ºC保存。3.2.9.4Westernblotting方法同2.2.11。3.2.10RT-PCR法检测p53转录水平的变化5将黄体细胞按1.5×10cells/孔的细胞量接种到6孔细胞培养板中，细胞贴附过夜后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后接种0MOI（mock）和4MOIPPV病毒液；2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。分别在4hp.i.、8hp.i.、12hp.i.、24hp.i.收集细胞，提取RNA并进行反转录试验（方法同2.2.4.1），引物设计见表3-2。表3-2RT-PCR用引物Table3-2TheprimersusedforRT-PCRAbbreviationSequence(5’to3’)ProductLengthGenBankaccessionnumberFGTCGGCTCTGACTGTACCACp53380bpNM_213824.3RTTCAGCTCCAAGGCGTCATT注：F指上游引物；R指下游引物。Note:F,Forwardprimer;R,reverseprimer. 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究373.2.11Westernblotting法检测p53蛋白表达和转位以及p38MAPK、JNK总蛋白和蛋白磷酸化水平变化情况方法同3.2.8。3.2.12p53siRNA转染猪黄体细胞为敲除内源性p53，使用不含抗生素、含10%FBS的M199培养液培养细胞至细胞密度达到50%，然后使用脂质体2000向黄体细胞转染50nMp53siRNAs或siCONTROL。转染24h后，使用4MOIPPV感染细胞2h后，更换为含2%FBS的M199培养液继续培养细胞6h。p53siRNA序列见表3-3。表3-3p53siRNA序列Table3-3p53siRNAsequencesTargetgeneSequence(5’to3’)GenBankaccessionnumberGGAAUUUACGGGCCGAGUATTp53AF098067.1UACUCGGCCCGUAAAUUCCTT3.2.13统计学分析运用SPSS17.0软件对试验所得数据进行统计学分析，结果表示形式为Mean±SEM。使用One-WayANOVA进行差异性分析，如果ANOVA显示组间存在显著差异，则用Tukey’s检验进行均值比较。相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（p˂0.05）。3.3结果3.3.1PPV感染对黄体细胞活性的影响以不同感染剂量的PPV感染原代和永生化猪黄体细胞，经MTT法评估PPV感染对黄体细胞的活性作用。结果显示，原代黄体细胞和永生化黄体细胞对PPV感染具有相似的耐受性；0.5~8MOIPPV感染黄体细胞后均可降低黄体细胞的活性，且PPV感染引起的黄体细胞活性降低具有一定的时间依赖性（图3-2）。图3-2MTT法检测PPV感染对原代和永生化黄体细胞活性的影响Figure3-2EffectsofPPV-infectiononprimaryandimmortalizedporcinelutealcellsdetectedbyMTT 38猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究3.3.2PPV在黄体细胞中的增殖为验证黄体细胞是否为PPV的宿主细胞，PPV感染黄体细胞后在不同感染时间收集黄体细胞，并对细胞中的病毒拷贝数进行qPCR检测，结果如图3-3所示，原代黄体细胞中PPV感染12hp.i.的病毒拷贝数显著上升至2hp.i.细胞中的病毒拷贝数12.87倍，相同时间段永生化黄体细胞中的病毒拷贝数上升了15.22倍，显著高于12hp.i.原代黄体细胞中病毒量，这可能与永生化黄体细胞的增殖率高于原代黄体细胞有关；但随感染时间的延长PPVDNA拷贝数在原代和永生化黄体细胞中均逐渐增多且增殖趋势相似。直至感染36~48hp.i.之间细胞中的病毒量出现下降（图3-3），表明，PPV可在黄体细胞中进行复制，且在PPV感染后一定时间或病毒量达到一定水平后黄体细胞可释放大量的病毒。进而表明，黄体细胞为PPV的宿主细胞，且PPV在黄体细胞中的DNA复制可能是造成黄体细胞活性下降的原因。图3-3qPCR法检测PPV在黄体细胞中的增殖Figure3-3PPVDNAreplicationoncelllysatesandculturalmediumweremonitoredbyqPCR3.3.3PPV感染诱导原代和永生化黄体细胞凋亡4MOIPPV感染原代黄体细胞和永生化黄体细胞，分别在12hp.i.、24hp.i.、36hp.i.和48hp.i.对细胞形态学进行观察。倒置显微镜观察结果显示，原代和永生化黄体细胞即出现轻微的细胞病变，且随着PPV感染时间的延长，细胞出现变圆、皱缩、聚堆和脱落的现象（图3-4A）。荧光显微镜观察Hoechst33258染色结果显示，PPV感染12hp.i.原代和永生化黄体细胞中的部分细胞的细胞核即出现固缩现象，随着PPV感染时间的延长，出现核固缩现象的细胞明显增多，且大量细胞出现核碎裂现象（图3-4A）。分别在上述感染时间点收集细胞，提取细胞DNA进行琼脂糖凝胶电泳检测，结果显示，感染24hp.i.即出现轻微的DNAladder现象，且DNAladder现象随着感染时间的延长愈加明显（图3-4B）。结果表明，原代和永生化黄体细胞的病变与PPV感染引起的黄体细胞凋亡有关。流式细胞术检测原代和永生化黄体细胞凋亡率，结果也表明PPV感染可引起黄体细胞发生凋亡，且随感染时间延长原代和永生化黄体细胞的凋亡率显著上升 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究39（图3-4C）。图3-4PPV感染诱导原代和永生化黄体细胞发生凋亡A:原代和永生化黄体细胞形态学观察；B:原代和永生化黄体细胞DNA片段化分析结果；C:原代和永生化黄体细胞凋亡率的检测；所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure3-4PPV-inducedprimaryandimmortalizedporcinelutealcellsapoptosisA:themorphologicalchangesofprimaryandimmortalizedporcinelutealcells;B:theresultsofDNAfragmentationassay;Allthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference 40猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究3.3.4PPV感染经线粒体通路诱导原代和永生化黄体细胞凋亡分别在4MOIPPV感染原代和永生化黄体细胞4hp.i.、8hp.i.、12hp.i.和24hp.i.时收集细胞，通过Caspase活性检测试盒检测caspase-8、-9和-3的活性，结果显示，PPV感染可激活原代和永生化黄体细胞中caspase-9，使caspase-9活性显著升高，而caspase-8活性并未出现显著变化（图3-5A和B）。接着使用20μMcaspase-8或-9特异性抑制剂预处理原代或永生化黄体细胞1h，然后在接种4MOIPPV感染细胞24h后，收集细胞对caspase-3活性进行检测，发现，经caspase-8特异性抑制剂（Z-IETD-FMK）预处理的原代或永生化黄体细胞，caspase-3的活化程度未发生显著变化，而经caspase-9特异性抑制剂（Z-LEHD-FMK）预处理的原代和永生化黄体细胞中caspase-3的活性显著下降，caspase-8或-9特异性抑制剂共同预处理同样显著抑制了caspase-3的活性，但与caspase-9特异性抑制剂单独预处理黄体细胞对caspase-3活性的抑制效率基本一致，差异不显著（图3-5C和D）。进一步证明PPV感染黄体细胞过程中caspase-8并未被激活，PPV通过诱导活化caspase-9激活caspase-3；表明，PPV感染激活了线粒体通路。而在此过程中，原代黄体细胞中caspase-9和-3在PPV感染8hp.i.被显著激活，而在永生化黄体细胞中caspase-9和-3在PPV感染4hp.i.活性便显著升高，结合3.3.1结果推测，PPV诱导caspase的活化可能与黄体细胞中的PPV病毒量有关。然后，如图3-6所示，通过Westernblotting法检测PPV感染不同时间原代和永生化黄体细胞中Fas、FasL、Bax和Bcl-2蛋白表达情况，结果显示，原代和永生化黄体细胞中Fas、FasL在PPV感染过程中蛋白水平均未发生显著变化，但PPV感染可显著提高促凋亡蛋白Bax的表达并显著降低抗凋亡蛋白Bcl-2的表达（图3-6A和B），进而导致Bax/Bcl-2比例显著上升（图3-6C和D）。接着，如图3-7，分离提取胞质和线粒体蛋白，检测Bax和细胞色素c（cytochromec，cytc）在胞质和线粒体中蛋白水平的变化，发现，PPV感染原代和永生化黄体细胞后，均可显著促进促凋亡蛋白Bax从细胞质向线粒体的转位并显著促进cytc从线粒体向细胞质的释放。上述结果进一步证明，PPV感染经线粒体通路诱导黄体细胞凋亡，而在此过程中并未激活死亡受体通路。 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究41图3-5PPV感染对黄体细胞caspase活性的影响A和C:原代黄体细胞；B和D:永生化黄体细胞；A和B:Caspase活性检测试剂盒检测caspase-8、-9和-3活性；C和D:caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-8、-9特异性抑制剂对caspase-3活性的影响；所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure3-5EffectsofPPV-infectiononcaspase-8,-9and-3activityAandC:primarylutealcells;BandD:immortalizedlutealcells;AandB:theactivitycaspase-8,-9,and-3weremeasuredbyCaspasescolorimetricassaykit;CandD:Effectsofcaspase-8or-9inhibitorsoncaspase-3activitymeasuredbycaspases-3colorimetricassaykit.Allthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference 42猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究图3-6PPV感染对原代和永生化黄体细胞中Fas、FasL、Bax和Bcl-2蛋白表达的影响A和C:原代黄体细胞检测结果；B和D:永生化黄体细胞检测结果；A和B:Westernblotting法检测Fas、FasL、Bax和Bcl-2蛋白表达；C和D:Bax/Bcl-2比例的变化；所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure3-6EffectsofPPV-infectiononFas,FasL,BaxandBcl-2expressiondetectedbywesternblottingAandC:primarylutealcells;BandD:immortalizedlutealcells;AandB:theexpressionofFas,FasL,BaxandBcl-2weredetectedbywesternblotting;CandD:Bax/Bcl-2ratio.Allthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究43图3-7Westernblotting法检测PPV感染对Bax和cytc蛋白转位的影响A:原代黄体细胞；B:永生化黄体细胞Figure3-7EffectsofPPV-infectiononBaxtranslocationandcytcreleasedetectedbywesternblottingA:primarylutealcells;B:immortalizedlutealcells3.3.5p53参与调控PPV诱导的黄体细胞凋亡首先，通过Westernblotting和RT-PCR法检测p53在PPV感染黄体细胞过程中是否被激活。结果显示，PPV感染可引起黄体细胞中p53蛋白含量显著升高，且随感染时间的延长，p53蛋白在黄体细胞中的含量显著上升（图3-8A和C），表明，PPV感染激活了p53的转录非依赖途径；RT-PCR结果显示，随感染时间的延长p53mRNA水平显著上升（图3-8B和D），表明PPV感染激活p53的转录依赖途径。接着，使用p53特异性抑制剂（pifithrin-α，PTF-α）预处理黄体细胞和p53特异性siRNA转染黄体细胞，通过Westernblotting法检测Bax蛋白表达情况、caspase活性检测试剂盒检测caspase-3活性变化和流式细胞术检测黄体细胞细胞凋亡率的变化，以确定p53在PPV诱导黄体细胞凋亡过程中的作用。结果显示，p53抑制剂和p53特异性siRNA可显著抑制PPV感染引起的Bax蛋白表达的上升、caspase-3活性的上升和黄体细胞凋亡率的上升（图3-9），表明，p53参与调控PPV诱导的黄体细胞凋亡。 44猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究图3-8PPV诱导p53蛋白积累和mRNA水平升高A和B:原代黄体细胞；C和D:永生化黄体细胞；A和C:Westernblotting法检测p53蛋白水平变化；B和D:RT-PCR法检测p53mRNA水平的变化；所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure3-8PPV-inducedtheaccumulationofp53andtheincreaseofp53mRNAlevelAandB:primarylutealcells;CandD:immortalizedlutealcells;AandC:Theexpressionofp53proteinwasdetectedbywesternblotting;BandD:Thelevelofp53mRNAwasdetectedbyRT-PCR.Allthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究45图3-9p53特异性抑制剂及p53特异性siRNA对PPV诱导原代黄体细胞凋亡的影响A-C:p53特异性抑制剂对PPV诱导原代黄体细胞凋亡相关因素的影响；D-F:p53特异性siRNA对PPV诱导原代黄体细胞凋亡相关因素的影响；A和D:Westernblotting法检测Bax蛋白表达；B和E:caspase-3活性检测试剂盒检测caspase-3活性；C和F:流式细胞术检测细胞凋亡率；所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure3-9Effectsofp53specificinhibitorandspecificp53siRNAonPPV-inducedprimarylutealcellsapoptosisA-C:effectsofp53specificinhibitor;D-E:effectsofspecificp53siRNA;AandD:theexpressionofBaxwasdetectedbywesternblotting;BandE:theactivityofcaspase-3wasmeasuredbycaspases-3colorimetricassaykits;CandF:thecelluralapoptoticrateweredetectedbyFlowcytometer;Allthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference3.3.6PPV诱导黄体细胞中的p38MAPK发生磷酸化通过Westernblotting法检测PPV感染不同时间后原代和永生化黄体细胞中p38MAPK和JNK蛋白的表达情况，结果显示PPV感染可引起原代和永生化黄体细胞中磷酸化p38MAPK蛋白水平显著升高，而JNK蛋白在PPV感染过程中未发生显著变化（图3-10）。 46猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究图3-10PPV感染对黄体细胞中p38MAPK和JNK蛋白的影响A:原代黄体细胞；B:永生化黄体细胞；所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure3-10EffectsofPPV-infectiononp38MAPKandJNKinlutealcellsA:primarylutealcells;B:immortalizedlutealcells;Allthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究473.3.7磷酸化p38参与调控PPV感染引起的黄体细胞凋亡使用p38特异性抑制剂（SB203580）预处理黄体细胞后，提取总蛋白检测细胞中p53和Bax蛋白的表达情况，发现p38特异性抑制剂能够显著抑制PPV感染引起的p53蛋白积累以及Bax蛋白表达的升高（图3-11A）。同时，分离提取胞质蛋白和胞核蛋白，通过Westernblotting检测发现p38特异性抑制剂能够抑制p53蛋白向细胞核的转位（图3-11B）。接着通过流式细胞术检测p38特异性抑制剂对PPV诱导猪黄体细胞凋亡率的影响，发现p38特异性抑制剂可显著抑制PPV诱导的黄体细胞凋亡率的上升（图3-11C）。图3-11p38特异性抑制剂对p53蛋白和转位以及黄体细胞凋亡的影响A:Westernblotting法检测p53和Bax蛋白表达及p53蛋白转位；B:流式细胞术检测细胞凋亡率；所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure3-11Effectsofp38specificinhibitoronp53expressionandtranslocationaswellascellsapoptosisA:p53andBaxproteinexpressionandthetranslocationofp53;B:apoptoticratiodetectedbyFlowcytometry;Allthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference3.4讨论研究表明，细菌、真菌、和病毒等多种病原微生物能够引起母猪出现生殖障碍性疾病；其中，病毒是引起母畜发生繁殖障碍的主要病原(Givensetal.2008)。前期研究发现PPV感染可引起胎儿多个组织器官损伤，进而导致胎儿死亡、木乃伊化等；并通过研究PPV对胎儿发育的影响来阐明PPV的致病机理，但很少见到关于PPV对母体影响的研究。黄体组织在维持妊娠过程中起着关键作用，研究表明，黄体组织损伤可引起胎儿流产，产死胎、木乃伊胎等现象。早期研究发现，PPV感染可引起黄体组织损伤。然而，PPV感染引起黄体组织损伤的机制目前仍不清楚。因此，本章通过研究PPV感染体外培养的黄体组织主要功能细胞—黄体细胞，明确PPV感染对黄体细胞的影响，为进一 48猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究步揭示PPV诱导母猪繁殖障碍提供新的理论依据。本章研究发现，PPV可在体外培养的原代和永生化黄体细胞中进行复制，并引起细胞出现典型的细胞病变；这种现象与PPV诱导宿主细胞凋亡的现象一致(Zhangetal.2015;Zhaoetal.2016)。同时，PPV感染可引起黄体细胞出现染色质固缩、DNA片段化以及AnnexinV染色阳性等细胞凋亡的典型特征(Kerretal.1972)，表明，PPV感染可引起黄体细胞发生凋亡。细胞凋亡信号通路包括死亡受体通路和线粒体通路。死亡受体通路是通过同源配体与死亡受体结合，激活死亡受体家族中的成员（如Fas和TNFR等），导致死亡受体发生聚集，同时形成死亡诱导信号复合体接着激活caspase-8。活化的caspase-8可诱导膜通透性增强进而活化线粒体通路或直接激活下游caspase-3诱导细胞凋亡(Danialetal.2004;Hengartner2000;Scaffidietal.1998)。本研究中caspase活性检测结果显示PPV感染过程中caspase-8并未被激活，且caspase-8特异性抑制剂对PPV诱导的黄体细胞caspase-3活性升高未出现显著影响。同时Fas和FasL蛋白表达水平在PPV感染过程中也未发生显著变化，更进一步说明，PPV诱导黄体细胞凋亡过程中死亡受体通路并未被激活。多种刺激可激活Bcl-2家族中的促凋亡成员进而激活线粒体通路介导的细胞凋亡。促凋亡和抗凋亡Bcl-2家族蛋白在线粒体表面聚集，竞争性的调控线粒体外膜的完整性；当促凋亡Bcl-2家族蛋白上调可使线粒体中的凋亡因子释放，如细胞色素c（cytochromec，cytc）。进入细胞质的cytc与Apaf-1和pro-caspase-9组装形成凋亡体进而激活caspase-9。活化的caspase-9可激活caspase-3诱导细胞凋亡(Danialetal.2004;Hengartner2000;Lietal.2004;Logueetal.2008)。本研究结果显示PPV诱导黄体细胞中Bax/Bcl-2比例升高以及cytc释放进入细胞质。同时，caspase-9和caspase-3的活性升高，这也就表明PPV可能是通过激活线粒体通路诱导猪黄体细胞发生凋亡。肿瘤抑制因子p53是DNA损伤反应的重要参与成员(Chenetal.1996;Lane1992)，p53在细胞质中的积累可直接激活促凋亡蛋白Bax使线粒体细胞膜通透性增强进而诱导细胞凋亡(Chipuketal.2004)。前期研究表明p53参与调控人细小病毒（ParvovirusB19，B19）诱导的细胞凋亡(Yaegashietal.1999)；细小病毒家族成员中鼠细小病毒（Parvovirusminutevirus，MVM）诱导DNA损伤过程，可通过p53转录依赖通路和转录非依赖通路上调Bax蛋白的表达(Adeyemietal.2010;Adeyemietal.2012)，这也意味着p53同样参与调控MVM诱导的细胞凋亡。本章研究证实PPV感染黄体细胞过程中激活了p53转录依赖型和非依赖型通路。p53特异性抑制剂和p53siRNA预处理黄体细胞可显著抑制PPV诱导的Bax表达升高和caspase-3活性升高；并能显著抑制PPV诱导的黄体细胞凋亡。因此，本研究证实p53在PPV诱导黄体细胞凋亡过程中起着重要的调控作用。此外，本章研究发现PPV感染黄体细胞过程中激活了p38MAPK信号转导通路。p38MAPK作为丝裂原活化蛋白激酶（mitogen-activedproteinkinase，MAPKs）家族成员之一，参与多种信号转导通路，其中包括参与调控细胞凋亡信号转导通路(Brownetal.2006;Cargnelloetal.2011;Perfettinietal.2005;Vargheseetal.2016)。本研究结果显示p38 第三章猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡信号转导通路研究49MAPK在PPV感染0.5-1hp.i.发生磷酸化；这也就表明，PPV在粘附细胞的过程中即激活了p38MAPK信号转导通路。此外，p38MAPK特异性抑制剂预处理可抑制p53的积累和转位，并抑制黄体细胞凋亡。因此，我们推测抑制p38MAPK和p53的活化可能可以用于避免妊娠过程中黄体细胞损伤和临床治疗PPV诱导的母猪繁殖障碍性疾病。综上所述，PPV感染通过激活p38MAPK、p53和线粒体通路诱导猪黄体细胞凋亡。这也就表明，PPV诱导的繁殖障碍性疾病可能与PPV诱导黄体细胞凋亡有关。本研究系统地阐明了PPV诱导黄体细胞凋亡的信号转导通路，为揭示PPV诱导猪繁殖障碍性疾病提供了新的理论基础。并为预防和治疗PPV诱导母畜繁殖障碍提供了新的思路和方向。3.5小结PPV感染原代和永生化黄体细胞后可在黄体细胞中进行复制，并引起细胞出现典型的细胞病变和细胞凋亡特征。PPV感染可激活caspase-9和caspase-3，并上调Bax蛋白表达，抑制Bcl-2蛋白表达，诱导Bax蛋白转位和cytc从线粒体释放进入细胞质中；但PPV感染过程中caspase-8并未被激活，且Fas和FasL的蛋白表达也未发生变化。结果表明，PPV感染通过激活线粒体通路诱导黄体细胞凋亡。同时，PPV感染过程激活了p53转录依赖通路和转录非依赖通路，并通过活化的p53上调黄体细胞中Bax蛋白表达、caspase-3活性和黄体细胞凋亡率。此外，p38MAPK发生磷酸化，磷酸化的p38MAPK参与调控p53蛋白的积累和转位、Bax蛋白的表达以及黄体细胞凋亡率。研究结果表明，PPV感染是通过激活p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞凋亡的。 50猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究第四章猪细小病毒抑制猪黄体细胞孕酮产生机制研究妊娠过程中，孕酮可促进子宫内膜发育为胚胎着床提供有利条件，并通过抑制子宫基层活动维持妊娠正常进行(Bhurkeetal.2016;Conneelyetal.2007;Stoccoetal.2007)，同时孕酮还可以抑制胎儿早产(Romeroetal.2014)，所以维持机体正常生理浓度的孕酮是母体成功妊娠的关键。母猪妊娠过程所需的孕酮主要由黄体组织提供(Lemonetal.1977)，且黄体细胞是黄体组织中合成孕酮的功能性细胞(Lemonetal.1977;Talbottetal.2014)。这也就表明，猪黄体细胞孕酮产生被抑制可能会导致母猪繁殖障碍。已有研究发现，一些病毒或药物等可通过抑制机体孕酮水平，进而引起胎儿早产或死亡率升高等现象(Littaueretal.2017;Pappetal.2015)。然而，PPV感染诱导胎儿死亡是否与机体孕酮水平有关，以及PPV感染与黄体孕酮产生之间的关系目前尚不清楚。因此，本研究拟以猪黄体细胞为研究对象，探索PPV感染后黄体细胞孕酮产生情况，进一步明确PPV感染抑制孕酮产生的机制。4.1试验材料4.1.1病毒和细胞同3.1.2。4.1.2主要试剂BaxInhibitorPeptidesV5Sigmap53signalinginhibitorPTF-αSigmaJNKinhibitorSP600125Sigmap38MAPKinhibitorSB203580MerckTRIzolInvitrogenSYBRPremixExTaqTMIITAKARAHRP-标记二抗PiercerabbitmonoclonalantibodyStARCellSignalingTechnologyrabbitmonoclonalantibodyP450sccCellSignalingTechnologygoatpolyclonalantibody3β-HSDSantaCruz125碘（I）孕酮放射免疫检测试剂盒天津九鼎生物技术有限公司4.2试验方法4.2.1放射免疫法检测孕酮的产生5将黄体细胞按1.5×10cells/孔的细胞量接种到6孔细胞培养板中，细胞贴附过夜后 第四章猪细小病毒抑制猪黄体细胞孕酮产生机制研究51移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后0MOIPPV（mock）和4MOIPPV病毒感染黄体细胞2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。继续培养24h后收集培养液，储存于-20ºC待采用RIA法检测，检测方法同2.2.10。4.2.2Real-timePCR法检测黄体细胞中孕酮合成关键蛋白和酶的表达5将黄体细胞按1.5×10cells/孔的细胞量接种到6孔细胞培养板中，过夜细胞贴附后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后接种4MOIPPV病毒液，2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液，分别在0hp.i.、12hp.i.、24hp.i.和36hp.i.收集细胞。4.2.2.1提取总RNA向各时间点细胞中加入1mLTRIzol，涡旋震荡仪上震荡10min。200μL的氯仿（总体积的1/5），震荡60s，冰上放置120s。然后12000×g4°C离心10min。吸取上清于另一新EP管中，加入800μL的异丙醇轻轻颠倒混匀，-20°C冰箱放置2h后，-80°C超低温冰箱过夜。接着，12000×g4°C离心15min后弃上清。向EP管中加入1mL75%乙醇进行洗涤，12000×g4°C离心10min，弃上清，相同步骤重复一次。开盖空离1min，然后放于超净工作台中将残余乙醇去除。DEPC水溶解RNA，并用NanoDrop2000核酸分光光度计测定浓度。4.2.2.2RNA反转录每组分别取2000ng总RNA，根据InvitrogenM-MLV反转录试剂盒说明书进行反转录，体系见表4-1。表4-1反转录体系Table4-1SystemofRT-PCRAmplification组分（Components）体积（Volume）dNTPs1µLOligo（dT）2µLddH2O1µL5×FirstBuffer4µLDTT2μLRNase抑制剂1µLM-MLV1µLTotal20µL反应条件为37℃50min，70℃15min；获得cDNA。4.2.2.3Real-timePCR以获得的cDNA为模板，进行real-timePCR。ACTB为内参基因，孕酮合成过程中关键蛋白和酶的定量引物序列见表4-2。 52猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究表4-2Real-timePCR引物序列Table4-2Sequencesofreal-timePCRprimerProductGenBankaccessionAbbreviationPrimersequence(5’to3’)lengthnumberFCGTCGGAGCTCTCTTCTTGGSTAR124bpNM_213755.2RCCTCCTGGTTGCTGAGGATGFGTCCCATTTACAGGGAGAAGCTCGCYP11A1182bpNM_214427.1RGGCTCCTGACTTCTTCAGCAGGFCTCCGTGGTCATCCACACTGHSD3B1164bpNM_001004049.1RGTCCAGCCACCTCTATGCTGFGTCACCAACTTGGGACGACAACTB138bpXM_003124280.4RAGGCGTACAGGGACAGCA注：F指上游引物；R指下游引物。Note:F,Forwardprimer;R,reverseprimer.Real-timePCR反应体系如下：SYBR12.5μLTemplate2μL上游引物1μL下游引物1μLddH2O8.5μL扩增曲线：95°C10min；95ºC15s，60°C20s，72°C40s，40cycles。溶解曲线：45°C至85ºC，30s/循环，且每循环升高0.5°C。4.2.3Westernblotting法检测黄体细胞中孕酮合成关键蛋白和酶的表达5将黄体细胞按1.5×10cells/孔的细胞量接种到6孔细胞培养板中，过夜细胞贴附后移除培养基，用1×PBS漂洗3次，然后接种0MOIPPV（mock）、4MOIPPV病毒液，2h后，弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。继续培养24h后收集细胞。方法同2.2.11。4.2.4放射免疫法检测特异性抑制剂预处理后PPV感染对黄体细胞孕酮产生的影响特异性抑制剂预处理黄体细胞1h后，感染4MOIPPV病毒液，并于感染2hp.i.弃去病毒液更换为含2%FBS的细胞培养液。继续培养24h，收集培养液并储存于-20ºC待采用RIA法检测，检测方法同2.2.10。抑制剂处理具体流程见图4-1。 第四章猪细小病毒抑制猪黄体细胞孕酮产生机制研究53图4-1抑制剂预处理流程图Figure4-1Schematicdiagramofinhibitorspretreatment4.2.5统计学分析运用SPSS17.0软件对试验所得数据进行统计学分析，结果表示形式为Mean±SEM。使用One-WayANOVA进行差异性分析，如果ANOVA显示组间存在显著差异，则用Tukey’s检验进行均值比较。相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（p˂0.05）。4.3结果4.3.1PPV感染抑制原代和永生化黄体细胞孕酮产生4MOIPPV感染原代黄体细胞和永生化黄体细胞，然后在感染24hp.i.收集细胞上清，通过放射免疫法检测上清中孕酮含量发现，PPV感染后原代黄体细胞上清中孕酮含量与原代细胞对照组相比下降了4.66倍；永生化黄体细胞上清液中的孕酮含量与永生化细胞对照组相比也下降了5.42倍（图4-2）。结果表明，PPV感染能够显著降低黄体细胞孕酮产生能力。图4-2放射免疫法检测PPV感染对原代和永生化黄体细胞孕酮产生的影响所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure4-2EffectsofPPV-infectiononprogesteroneproductioninprimaryandimmortalizedlutealcellsdetectedbyradioimmunoassayAllthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference 54猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究4.3.2PPV感染对黄体细胞孕酮合成的影响通过检测PPV感染后猪黄体细胞孕酮合成过程中关键蛋白和关键酶的表达情况，发现PPV感染可显著抑制StAR、3β-HSD和CYP11A1mRNA和蛋白的表达，且随着PPV感染时间的延长PPV对StAR、3β-HSD和CYP11A1mRNA和蛋白表达的抑制作用更为明显。这也就表明，PPV感染还可通过抑制黄体细胞孕酮的合成来降低黄体细胞的孕酮产生能力（图4-3和图4-4）。图4-3PPV感染对原代黄体细胞StAR、3β-HSD和CYP11A1mRNA和蛋白表达的影响A:Real-timePCR检测STAR、HSD3B1和CYP11A1mRNA水平；B:Westernblotting检测StAR、3β-HSD和CYP11A1蛋白水平。所有数据来自于3次独立重复试验结果，不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure4-3TheinfluenceofPPVinfectionontheexpressionofStAR,3β-HSDandCYP11A1inporcineprimarylutealcellsA:Real-timePCRwasperformedtodetectSTAR,HSD3B1andCYP11A1mRNAexpression.B:WesternblottingwasperformedtodetectStAR,3β-HSDandCYP11A1proteinlevels.Thedataisbasedonthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersmeannosignificantdifference 第四章猪细小病毒抑制猪黄体细胞孕酮产生机制研究55图4-4PPV感染对永生化黄体细胞StAR、3β-HSD和CYP11A1mRNA和蛋白表达的影响A:Real-timePCR检测STAR、HSD3B1和CYP11A1mRNA水平；B:Westernblotting检测StAR、3β-HSD和CYP11A1蛋白水平。所有数据来自于3次独立重复试验结果，不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure4-4TheinfluenceofPPVinfectionontheexpressionofStAR,3β-HSDandCYP11A1inporcineimmortalizedlutealcellsA:Real-timePCRwasperformedtodetectSTAR,HSD3B1andCYP11A1mRNAexpression.B:WesternblottingwasperformedtodetectStAR,3β-HSDandCYP11A1proteinlevels.Thedataisbasedonthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersmeannosignificantdifference4.3.3调控PPV感染诱导黄体细胞凋亡过程的相关因子对黄体细胞孕酮产生的影响4.3.3.1Bax参与调控PPV诱导的黄体细胞孕酮产生水平的下降100μmBax转位特异性抑制剂（BaxInhibitorPeptideV5，BIPV5，可特异性的抑制线粒体通路介导的细胞凋亡）预处理原代和永生化黄体细胞1h后，用4MOIPPV感染原代黄体细胞和永生化黄体细胞，然后在感染24h后收集细胞上清，通过放射免疫法检测上清中孕酮含量，发现，与PPV感染组相比，BIPV5预处理组原代黄体细胞上清中孕酮水平上升了2.43倍，同样BIPV5预处理组永生化黄体细胞上清的孕酮水平较未经BIPV5预处理组上升了2.73倍（图4-5）。结果表明，PPV感染可经线粒体通路介导的细胞凋亡参与调控黄体细胞的孕酮产生。 56猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究图4-5放射免疫法检测Bax抑制剂对黄体细胞孕酮产生的影响所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure4-5EffectsofBaxinhibitorontheproductionofprogesteronedetectedbyradioimmunoassayAllthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference4.3.3.2p53参与调控PPV诱导的黄体细胞孕酮产生水平的下降用20ΜPTF-α预处理黄体细胞1h后，4MOIPPV感染黄体细胞，24h后收集原代和永生化黄体细胞上清，进行免疫放射法检测细胞培养上清中孕酮水平，发现PTF-α后可显著抑制PPV引起的黄体细胞孕酮产生水平的下降，表明，p53参与调控PPV诱导的黄体细胞孕酮产生水平的下降（图4-6）。然而，p53特异性抑制剂预处理仅使PPV感染组黄体细胞的孕酮水平恢复至mock组黄体细胞孕酮水平51%~54%左右，表明可能存在其他分子参与介导PPV诱导的孕酮水平下降。图4-6放射免疫法检测p53特异性抑制剂对黄体细胞孕酮产生的影响所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure4-6Effectsofp53specificinhibitoronprogesteroneproductionofprimaryandimmortalizedlutealcellsdetectedbyradioimmunoassayAllthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference4.3.2.3磷酸化p38参与调控PPV感染引起的孕酮产量下降p38特异性抑制剂预处理黄体细胞1h后感染PPV，在感染24hp.i.对上清液中孕酮 第四章猪细小病毒抑制猪黄体细胞孕酮产生机制研究57含量进行检测，结果显示，p38特异性抑制剂可显著上调因PPV感染引起的原代和永生化黄体细胞孕酮产量的下降（图4-7），这也就表明p38参与调控PPV感染引起的孕酮产量下降。图4-7放射免疫法检测p38特异性抑制剂对黄体孕酮产生的影响所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure4-7Effectsofp38specificinhibitoronprogesteroneproductioninprimaryandimmortalizedlutealcellsAllthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference4.4讨论黄体细胞孕酮合成过程中，胆固醇作为孕酮合成的底物进入细胞后，首先由位于线粒体外膜的StAR将其运送至线粒体基质中，接着由位于线粒体内膜的P450scc/CYP11A1将胆固醇转化为孕烯醇酮。孕烯醇酮可自由进出线粒体，当其扩散进入胞质后，可在位于滑面内质网的3β-HSD的催化作用下，转化为具有生物学活性的孕酮(Huangetal.2013b;Stoccoetal.2007)。多种因素可通过调控孕酮合成过程中StAR、P450scc和3β-HSD的表达，完成对细胞或机体孕酮水平的调控(Uniyaletal.2015;Wangetal.2016)。本研究发现，PPV感染猪黄体细胞降低黄体细胞培养液中孕酮含量，并抑制了孕酮合成过程中StAR、P450scc和3β-HSD的表达。这也就表明，PPV感染可能是通过抑制黄体细胞孕酮的合成降低了猪黄体细胞孕酮产量。此外，研究发现环氧丙酰胺可通过诱导大鼠睾丸间质细胞凋亡抑制细胞孕酮的产生(Lietal.2017)。双酚A和类黄酮非瑟酮诱导的猪卵巢颗粒细胞凋亡也参与抑制了颗粒细胞孕酮的产生(BujnakovaMlynarcikovaetal.2018)。这也就表明，细胞凋亡可能能够在一定程度上可抑制细胞孕酮的产生。本文第三章研究发现PPV感染通过激活p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞凋亡。为探究PPV感染诱导黄体细胞凋亡与黄体孕酮产生之间的关系，本研究使用Bax特异性抑制剂预处理黄体细胞，发现Bax特异性抑制剂预处理可显著上调PPV诱导的孕酮含量的下降。由此推测，线粒体介导的凋亡信号转导 58猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究通路可能参与了PPV感染抑制猪黄体细胞孕酮产生的过程。然而，与mock组黄体细胞的孕酮含量相比，Bax抑制剂预处理后的孕酮水平上升了52.16%，但并未完全恢复。接着，使用p53特异性抑制剂、p53siRNA和p38特异性抑制剂预处理黄体细胞，并结合第三章研究结果，发现，当PPV感染诱导黄体细胞存活率的比率回升至mock组黄体细胞存活率的93.92%~89.52%时，黄体细胞孕酮产量仅回升至mock组黄体细胞孕酮产量的59.8%~63.79%。表明，PPV感染诱导的黄体细胞凋亡参与抑制黄体细胞孕酮的产生，但PPV感染过程中黄体细胞孕酮产量的下降并不完全由PPV诱导的黄体细胞凋亡造成。综上所述，PPV感染可通过抑制黄体细胞孕酮合成降低黄体细胞孕酮的产生；同时，PPV感染诱导黄体细胞凋亡也参与抑制黄体细胞孕酮的产生。进而推测，PPV感染抑制黄体细胞孕酮产生可能也是PPV诱导胎儿死亡的诱因之一。4.5小结PPV感染可通过抑制孕酮的合成，降低黄体细胞孕酮产生水平。同时，PPV诱导的黄体细胞凋亡可引起的黄体细胞孕酮产量的下降，但黄体细胞孕酮产生水平的下降仅部分依赖于PPV诱导的黄体细胞凋亡。 第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究59第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究妊娠过程中，机体黄体损伤或孕酮水平下降，可引起胎儿早产和胎儿死亡等相关繁殖障碍性疾病的发生。第三章和第四章的研究阐明了体外条件下PPV感染诱导猪黄体细胞凋亡的信号转导通路和抑制黄体细胞孕酮产生的相关机制。在本章我们拟通过PPV人工感染初孕母猪，放射免疫法检测PPV感染后机体血清中孕酮水平，原位杂交染色法检测PPV在黄体组织中的分布及复制情况，并通过TUNEL染色结合间接免疫荧光法和透射电子显微镜观察检测黄体细胞的凋亡情况，最后通过Westernblotting等方法进一步在体内条件下验证PPV感染引起黄体组织损伤的作用机制以及PPV感染对黄体组织孕酮产生的影响。5.1试验材料5.1.1病毒和细胞同3.1.2和2.2.1。5.1.2实验动物选取36头8月龄、体重50kg左右、经检测体内无PPV抗体、且猪圆环病毒2型（porcinecircovirustype2）、猪流感病毒（swineinfluenzavirus）、猪戊型肝炎病毒（swinehepatitisEvirus）、脑心肌炎病毒（encephalomyocarditisvirus）、CFSV、猪繁殖和呼吸综合征病毒PRRSV血清反应阴性的健康初孕母猪。5.1.3主要试剂猪细小病毒IgG抗体诊断试剂盒Bio-XLTUNEL细胞凋亡检测试剂盒（红光）碧云天FITC标记荧光二抗博士德Anti-GID-APRocheUltraPureTMSalmonSpermDNASolutionInvitrogen聚蔗糖（Ficoll400）Sigma聚乙烯吡咯烷酮（polyvinylpyrrolidone）Sigma硫酸葡聚糖上海生工蛋白酶KSigmaNBT/BCIPStockSolutionRocherabbitmonoclonalantibodyStARCellSignalingTechnology 60猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究rabbitmonoclonalantibodyP450sccCellSignalingTechnologygoatpolyclonalantibody3β-HSDSantaCruz5.1.4主要试剂的配置（1）HCl-醋酸酐-三乙醇胺：三乙醇胺670μL醋酸酐300μLHCl250μL超纯水48mL将三乙醇胺加入ddH2O中，磁力搅拌器混匀；在孵育玻片前，加入醋酸酐；新鲜配置。（2）蛋白酶K：将蛋白酶K加入PK缓冲液中，至终浓度为20μg/mL，分装后-20°C保存。（3）10%甲酰胺：10mL甲酰胺和990mL高压灭菌水相互稀释至500mL，4°C保存。（4）50%硫酸葡聚糖（w/v）：50g硫酸葡聚糖加入蒸馏水中加热至溶解，定容至100mL，分装，-20℃保存。。（5）20×SSC：NaCl175.3g二水合柠檬酸钠88.2g向烧杯中加入800mL去离子水，充分搅拌溶解，滴加14mol/LHCl，调节PH至7.0后，加去离子水定容至1L。高温高压灭菌后，室温保存。（6）50×Denhardt’s：Ficoll4005gpolyvinylpyrrolidone5gBSA5g加入去离子水约400mL，充分搅拌溶解；加去离子水将溶液定容至500mL；0.45μm滤器过滤后，分装成每份25mL，-20°C保存。（7）染色液（1L）：0.45μm滤器过滤后，4°C保存Tris-HCl（pH-9.0）1.2114gMgCl210.165gNaCl5.844g5.1.5主要仪器正置荧光显微镜Leica 第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究615.2试验方法5.2.1人工感染PPV将试验用36头初孕母猪按每栏3头数量随机进行分栏。当母猪出现发情时，连续2天对其进行人工授精，并将人工授精的第1天记为妊娠第0天，根据妊娠第21天血清中孕酮含量确定成功受孕的母猪，按照它们发情时间将36头配种成功的母猪随机分为PPV感染组和对照组，每组18头母猪。与此同时，PPV组被转移至另一个独立的猪舍7中，每栏安置3头母猪。并在妊娠第22天（Day22）通过滴鼻的方式，接种10mL10TCID50/mL的PPV或10mL细胞培养液，并记为感染后第一天（0dp.i.）。随后，每7天进行一次采血，并将分离获得的血清储存至-20ºC冰箱中以备后续测定血清中孕酮含量使用（图5-1）。然后，分别在21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.，各处死6头对照组母猪和6头PPV组母猪，采集各脏器进行多聚甲醛固定和液氮冻存。感染流程如图5-1。图5-1人工感染PPV流程图Figure5-1SchematicdiagramofPPVinfectionartificialinvivo5.2.2血清中PPV抗体水平的检测分别在连续配种第1天（Day0）、配种后第22天（即感染后第0天，0dp.i.）、7dp.i.、14dp.i.、21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.，收集静脉血，待血凝后取血清，置1.5mL灭菌离心管中。取10μL血清向其中加入390μL样品稀释液。设置空白对照孔（样品稀释液100μL）1孔，阴性和阳性对照（阴性、阳性对照各100μL）各2孔；样品孔每孔加入稀释后的样品100μL，混匀，37°C条件下反应30min。然后扣去各孔的液体，每孔加入300μL洗涤液洗涤板孔，每次加满洗涤液后放置30s，洗涤5次。然后每孔加入100μL酶标记物，空白孔除外；37°C条件下反应30min，扣去各孔中的液体，每孔加入300μL洗涤液洗涤板孔，每次加满洗涤液后放置30s，洗涤5次。接着，每孔依次加入底物A和底物B各50μL，混匀；37°C条件下避光反应10min；然后每孔加入50μL终止液，混匀终止反应。最后，测量并记录样品血清和对照孔的吸光值A(450)，用A(650)作为参比波长。结果判定方法：阴性对照≤0.1，阳性对照≥0.6。样品A值≥0.38判定为阳性；样品A值0.2≤A˂0.38判定为可疑；样品A值˂0.2为阴性。5.2.3血清中孕酮含量的检测分别在连续配种第1天（Day0）、配种后第22天（即感染后第0天，0dp.i.）、7dp.i.、 62猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究14dp.i.、21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.，收集静脉血，待血凝后取血清，后续方法同2.2.10。5.2.4原位杂交法检测PPV在黄体组织中的分布及复制情况的确定5.2.4.1原位杂交探针的设计：原位杂交用探针序列参考(Oraveerakuletal.1992)；互补探针（complementaryprobe，CP）用于标记ssDNA，可定位PPV病毒；复制型探针（replicativeformprobe，RFP）用于标记PPV的复制链，可定位PPV进行复制的组织和细胞。原位杂交用探针由上海生工合成，引物经HPLC纯化后，将地高辛标记于探针的5’端。探针序列如下表5-1。表5-1原位杂交用探针Table5-1TheprobesusedforInsituhybridisationAbbreviationSequence(5’to3’)Producelength（nt）ModificationCP5'GCAGTACCAATTCATCTTCT3'205’DIGRFP5'TGGTCTCCTTCTGTGGTAGG3'205’DIG5.2.4.2原位杂交检测黄体组织中PPV病毒及复制型病毒DNA的分布（1）脱蜡水合：二甲苯Ⅰ脱蜡10min，二甲苯Ⅱ脱蜡10min，酒精二甲苯混合液5min，100%酒精Ⅰ5min，100%酒精Ⅱ5min，95%酒精5min，90%酒精5min，80%3min，70%3min，蒸馏水3min；（2）PBS（高压灭菌）洗涤1min，3次；（3）0.3%Triton-X-100，室温浸泡20min，PBS洗涤2min，3次；（4）蛋白酶K（每个切片100μL），室温孵育20min；（5）0.2%甘氨酸室温2min；（6）PBS（高压灭菌）浸泡1min，3次；（7）HCl-醋酸酐-三乙醇胺缓冲液，室温浸泡10min，2×SSC洗涤5min，3次；（8）PBS（高压灭菌）浸泡2min，3次；（9）5×SSC，浸泡5min，2次；（10）吸水纸吸去周围多余的液体；预杂交：加预杂交液20μL/张切片，盖上硅化盖玻片，37°C（与杂交温度相同）湿盒内3h以封闭非特异性杂交位点；（11）吸水纸吸去周围多余的液体；杂交：每张切片上加杂交液20μL，加盖硅化盖片，37°C孵育16~18h；（12）杂交后漂洗：2×SSC，35°C，洗涤3min，2次；10%甲酰胺，35°C，洗涤15~20s，2次；0.5×SSC，35°C，洗涤3min，2次；2×SSC，35°C，洗涤3min，2次；2×SSC，室温，洗涤3min。 第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究63（13）封闭：2%山羊血清+2mg/mlBSA（in2×SSC），室温封闭2h；（14）Anti-DIG-AP（in封闭液）4°C过夜封闭；（15）PBST，室温洗10min，4次；（16）染色液室温染色10min，2次；（17）用吸水纸吸去液体，每个样品加50μL配好的NBT/BCIP底物溶液，室温避光显色15min，显色一段时间后可将切片取出置于10×目镜下观察显色程度，注意防止破片干涸，然后浸入蒸馏水中终止反应（18）PBS洗5min，2次；（19）高压灭菌水室温浸泡5min；（20）梯度脱水，70%—85%—90%—100%Ⅰ—100%Ⅱ，各3min，酒精二甲苯混合液5min，二甲苯Ⅰ5min，二甲苯Ⅱ5min.中性树胶封片，显微镜下观察并记录结果。（21）判定结果：光镜下，阳性部位为蓝紫色颗粒。RFP杂交判定可支持PPV复制的细胞，然后通过细胞形态观察，初步确定支持PPV复制的细胞类型。5.2.5Westernblotting法检测黄体组织中PPV的表达方法同2.2.11。5.2.6HE染色分别在21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.处死妊娠母猪后，采集其卵巢组织。将所取组织，切成大小约为1cm×1cm×2cm的组织块，用PBS中漂洗3次，每次漂洗5min，然后浸入4%多聚甲醛液中进行固定，固定完全后去除组织块使用递升梯度密度乙醇进行脱水、二甲苯透明后进行石蜡包埋，然后用切片机制备厚度为4μm组织切片，然后37°C烘干进行脱蜡。将脱蜡后的组织切片进行递减梯度密度乙醇复水，然后进行苏木素染色；接着通过1%盐酸乙醇混合液进行分化；自来水冲洗进行蓝化；将组织切片放入递升梯度密度乙醇进行脱水，然后进行伊红染色。接着在二甲苯：无水乙醇混合液和二甲苯中进行透明；最后经中性树脂封片，显微镜观察染色结果。5.2.7TUNEL染色首先使用二甲苯进行脱蜡，递减梯度密度酒精和蒸馏水进行复水。接着用100μL20μg/mL的蛋白酶K在37°C条件下处理组织切片20min；经PBS洗涤3次后；将组织切片置于柠檬酸钠抗原修复液中95°C热修复15min；冷却至室温后，使用10%山羊血清封闭，37°C条件下进行封闭30min；弃去封闭液，滴加20μL/组织特异性一抗（anti-StARantibody）对黄体细胞进行特异性标记，4°C孵育过夜。然后用PBS进行漂洗，按照20μL/组织的剂量向组织切片滴加FITC标记的荧光二抗，37°C条件下避光孵育2h；然后用PBS进行漂洗，而后按照50μL/组织的剂量向组织切片滴加TUNEL检 64猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究测液，37°C条件下避光孵育1h；经PBS漂洗后，使用DAPI染色液对所有细胞的细胞核进行染色，经PBS漂洗后，滴加防荧光猝灭剂进行封片。荧光显微镜下观察拍照。5.2.8透射电子显微镜观察黄体组织细胞超微结构变化方法同2.2.6。5.2.9Westernblotting法检测黄体组织中细胞凋亡信号转导通路主要相关蛋白的表达方法同3.2.9。5.2.10Real-timePCR法检测黄体组织中孕酮合成过程中关键蛋白和酶基因的表达从液氮中取出21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.的卵巢组织，分别取少量黄体组织于Ep管中，加入适量TRIzol后进行总RNA提取，方法同4.2.2。5.2.11Westernblotting法检测黄体组织中孕酮合成过程中关键蛋白及酶的表达从液氮中取出21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.的卵巢组织，分别取少量黄体组织于Ep管中，加入适量蛋白裂解液RIPA（含1%PMSF）后进行总蛋白提取，方法同2.2.11。5.2.12统计学分析运用SPSS17.0软件对试验所得数据进行统计学分析，结果表示形式为Mean±SEM。使用One-WayANOVA进行差异性分析，如果ANOVA显示组间存在显著差异，则用Duncan检验进行均值比较。相同字母表示差异不显著，不同字母表示差异显著（p˂0.05）。5.3结果5.3.1人工感染PPV不同时间妊娠猪血清中PPV抗体水平的变化分别在连续配种的第1天标记为妊娠第0天（Day0）和配种后22d（Day22/0dp.i.）进行采血，然后在感染PPV后每7天进行一次采血，分离血清进行PPV抗体水平的检测。经猪细小病毒（PPV）IgG抗体诊断试剂盒检测发现，未感染PPV的初孕母猪其PPV抗体水平始终维持在阴性水平以上、阳性水平以下，PPV感染状态表现为可疑；感染PPV的初孕母猪血清中的抗体水平在感染PPV前，表现为可疑状态，但当感染PPV7dp.i.时血清中PPV抗体水平显著上升，表现为PPV感染阳性，且随感染时间的延长，初孕母猪血清中的PPV抗体水平始终高于阳性水平（图5-2），表明PPV人工感染模型建立成功。 第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究65图5-2PPV感染不同时间PPV抗体水平的变化Figure5-2EffectsofPPV-infectiononPPVIgGlevels5.3.2人工感染PPV不同时间妊娠猪血清中孕酮水平的变化攻毒后每7天进行采血，通过放射免疫法检测妊娠猪血清中孕酮浓度，以监测PPV感染对初孕母猪妊娠及黄体组织功能活性的影响。结果显示，随PPV感染时间的延长PPV攻毒组血清中的孕酮含量显著下降，而对照组血清中孕酮含量并未发生显著变化。在14dp.i.妊娠猪血清中的孕酮含量即发生显著下降，在感染PPV21dp.i.，孕酮含量将至22.32±5.56ng/mL，与同时间的对照组相比，下降了8.23倍；感染PPV28dp.i.，孕酮含量将至8.53±1.87ng/mL，与同时间的对照组相比，下降了21.12倍；感染PPV35dp.i.时，孕酮含量将至4.02±1.09ng/mL，与同时间的对照组相比，下降了46.81倍（图5-3）。结果表明，PPV可显著降低妊娠猪血清中孕酮水平，由于妊娠母猪血清中的孕酮主要来源于黄体，进而表明体内条件下PPV感染降低了妊娠猪黄体组织的孕酮产生能力。图5-3PPV感染不同时间孕酮水平的变化Figure5-3EffectsofPPV-infectiononprogesteronelevels 66猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究5.3.3人工感染PPV不同时间对初孕猪卵巢大体剖检观察结果分别在21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.对对照组和PPV感染组的初孕母猪进行剖检，并对其卵巢组织的大体变化进行观察。如图5-4所示，对照组卵巢未见明显异常，但是PPV感染组各个时间点均可见卵巢出现病变，表现为黄体质地柔软，颜色变浅，呈囊肿样（图5-4B-D，五星）；PPV感染28dp.i.卵巢的卵泡周围及黄体部位可见多个灰白色病灶（图5-4C，箭头）。图5-4人工感染PPV不同时间初孕母猪卵巢组织大体剖检变化A:21dp.i.对照组卵巢组织，B:21dp.i.PPV组卵巢组织，C:28dp.i.PPV组卵巢组织，D:35dp.i.PPV组卵巢组织Figure5-4ThegrosschangesinporcineovaryafterPPV-infectionA:Theovaryofcontrolgroupat21dp.i..B:TheovaryofPPV-infectiongroupat21dp.i..C:TheovaryofPPV-infectiongroupat28dp.i..D:TheovaryofPPV-infectiongroupat35dp.i.5.3.4人工感染PPV后PPV在黄体组织中复制及病毒载量的观察分别在21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.处死对照组和PPV感染组的初孕母猪，采集卵巢组织进行原位杂交染色，染色结果显示，21dp.i.黄体组织部分细胞进行PPV病毒复制，且主要为黄体细胞；而大量病毒位于组织渗出液中。28dp.i.可见进行PPV复制的细胞显著增多，表明PPV侵染的细胞数显著增多。与28dp.i.黄体组织中病毒量相比，35dp.i.黄体组织中的PPV病毒量显著增多（图5-5）。这也就表明，PPV病毒可在黄体细胞中进行复制，且黄体组织中的PPV病毒载量与PPV感染时长呈正相关。 第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究67图5-5PPV感染不同时间在黄体组织中的病毒载量及复制情况观察Figure5-5ObservationofPPVloadenandreplicationinporcinecorpusluteum5.3.5人工感染PPV不同时间对初孕母猪黄体组织损伤和细胞凋亡的影响分别在21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.处死对照组和PPV感染组的初孕母猪，采集卵巢组织进行HE染色以及TUNEL和间接免疫荧光染色，HE染色结果显示，与对照组相比，21dp.i.的黄体组织可看到大片病灶区，在病灶区内可看到组织水肿、结构疏松，大量黄体细胞固缩；28dp.i.可见PPV感染组中的黄体细胞空泡变形愈加严重，出现固缩、核消失的细胞显著增多；在35dp.i.，可见黄体细胞的胞浆空泡、成丝网状空泡变性，胞膜界限轮廓不清，部分细胞出现凝固性坏死（图5-6，右侧）。TUNEL和间接免疫荧光染 68猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究色结果显示，随着PPV感染时间延长黄体组织中凋亡细胞量显著上升，且发生凋亡的细胞主要为类固醇分泌型黄体细胞（图5-6，左侧）。图5-6人工感染PPV对黄体组织病理学损伤和细胞凋亡的观察Figure5-6ObservationofPPV-infectiononmorphologicalabnormalitiesandlutealcellsapoptosisinporcinecorpusluteum5.3.6人工感染PPV对初孕母猪黄体组织细胞超微结构的影响取PPV感染35dp.i.初孕母猪黄体组织进行超微结构观察发现，对照组黄体组织的黄体细胞中含有大量的脂滴和分泌颗粒，细胞器结构完整（图5-7A）；PPV感染导致黄体细胞出现严重变性，细胞发生凋亡变化。图5-7B、D可见细胞的线粒体、内质网等细胞器高度扩张、溶解，胞浆结构疏松、溶解，胞浆中脂滴和分泌颗粒显著减少。图5-7B和C中细胞核固缩，胞质体积减小；图5-7C中可见细胞核固缩、胞质体积明显减小，呈现出凋亡小体的典型特征。 第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究69图5-7人工感染PPV对黄体细胞超微结构损伤的观察透射电子显微镜下观察感染PPV35dp.i.，初孕母猪黄体细胞超微结构变化情况A:对照组，B-D:PPV感染组；N:细胞核，P:细胞质，L:脂滴，S:分泌颗粒，ER:内质网Figure5-7ObservationofPPV-infectiononlutealcellultrastructuralmorphologicallessioninporcinecorpusluteumUndertransmissionelectronmicroscopyshowingtheultrastructuralmorphologyofthecorpusluteumfrompregnancygiltsat35dp.i..A:Controlgroup,B-D:PPVgroup.N:nucleus,P:cytoplasm,L:lipiddroplet,S:secretorygranules,ER:endoplasmicreticulum5.3.7人工感染PPV通过线粒体通路介导黄体组织中细胞凋亡分别在21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.处死对照组和PPV感染组的初孕母猪，收集卵巢组织，提取卵巢黄体组织蛋白，通过Westernblotting法检测cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白的表达情况，发现，与对照组相比，PPV感染初孕母猪可诱导黄体组织中活化的caspase-9和caspase-3表达显著上升，并显著上调促凋亡蛋白Bax的表达，抑制抑凋亡蛋白Bcl-2的表达（图5-8），这一结果与PPV感染体外培 70猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究养黄体细胞结果一致。结果表明，体内感染PPV同样可通过激活线粒体通路诱导黄体组织中的黄体细胞凋亡。图5-8PPV感染对初孕母猪黄体组织中cleaved-caspase-9、cleaved-caspase-3、Bcl-2和Bax蛋白表达的影响所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure5-8EffectsofPPV-infectiononcleaved-caspase-9,cleaved-caspase-3,Bcl-2andBaxexpressiondetectedinporcinecorpusluteumAllthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference5.3.8人工感染PPV促进p53蛋白在黄体组织细胞中的积累为确定p53是否参与PPV感染诱导初孕母猪黄体组织细胞凋亡过程，通过Westernblotting法检测21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.对照组和PPV感染组中p53蛋白水平变化。结果显示，与对照组相比，p53蛋白在PPV感染组中的表达量显著上升（图5-9）。这一结果与PPV感染体外培养黄体细胞结果一致。结果表明，PPV感染初孕母猪同样激活了黄体组织中黄体细胞的p53信号转导通路。5.3.9人工感染PPV诱导黄体组织细胞中p38蛋白发生磷酸化与PPV感染体外培养黄体细胞结果一致，p38在PPV感染初孕母猪的黄体组织中的磷酸化水平相较于对照组也发生显著上升（图5-10）。结果表明，PPV感染初孕母猪过程中黄体组织中黄体细胞的p38MAPK信号通路同样被激活。 第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究71图5-9PPV感染对初孕母猪黄体组织中p53和p-p38蛋白表达的影响所有数据来自3次独立试验，且不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure5-9EffectsofPPV-infectiononp53andp-p38expressiondetectedinporcinecorpusluteumAllthedatashownarerepresentativeofthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersnosignificantdifference5.3.10人工感染PPV不同时间对初孕母猪黄体组织中孕酮合成相关蛋白和酶表达的影响提取21dp.i.、28dp.i.和35dp.i.对照组和PPV感染组的初孕母猪黄体组织的总RNA和蛋白，通过Real-timePCR法和Westernblotting法检测StAR、3β-HSD和CYP11A1的表达情况，结果显示，与对照组相比，PPV感染显著下调StAR、3β-HSD和CYP11A1mRNA和蛋白的表达（图5-10），结果与第四章体外试验结果一致，表明PPV感染可通过抑制黄体组织中黄体细胞孕酮的合成降低机体的孕酮水平。 72猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究图5-10PPV感染对猪黄体组织StAR、3β-HSD和CYP11A1mRNA和蛋白表达的影响A:Real-timePCR检测STAR、HSD3B1和CYP11A1mRNA水平；B:Westernblotting检测StAR、3β-HSD和CYP11A1蛋白水平。所有数据来自于3次独立重复试验结果，不同字母表示差异显著（p<0.05），相同字母表示差异不显著Figure5-10TheinfluenceofPPVinfectionontheexpressionofStAR,3β-HSDandCYP11A1inporcinecorpusluteum.A:Real-timePCRwasperformedtodetectSTAR,HSD3B1andCYP11A1mRNAexpression.B:WesternblottingwasperformedtodetectStAR,3β-HSDandCYP11A1proteinlevels.Thedataisbasedonthreeindependentexperiments,thedifferentletterindicatessignificantdifference(p<0.05),andthesamelettersmeannosignificantdifference5.4讨论本文第三章和第四章研究结果显示，PPV感染体外培养的猪黄体细胞通过激活p38、p53和线粒体通路诱导黄体细胞凋亡，并通过抑制孕酮合成过程中关键蛋白StAR及关键酶3β-HSD和CYP11A1的表达抑制黄体细胞孕酮的产生。本章研究通过PPV人工感染初孕母猪，进一步明确了体内感染条件下PPV对黄体组织的结构和功能的影响及作用机制。我们发现，体内感染条件下，在黄体组织中，PPV主要在黄体细胞中进行复制，黄体组织中的病毒载量也随感染时间延长而显著增多。PPV感染初孕母猪诱导其黄体组织损伤时，可诱导大量黄体细胞发生凋亡。体内感染条件下，p53、p38和线粒体通路同样参与了PPV感染诱导初孕母猪黄体组织中黄体细胞凋亡的过程。同时，PPV感染通过抑制黄体组织孕酮的合成显著降低了妊娠猪循环系统中孕酮含量。病毒的复制是诱导细胞凋亡的诱因，病毒载量与凋亡严重程度呈正相关(Lenzoetal.2002;Ritteretal.2010;Samueletal.2007)。本章研究发现PPV感染初孕母猪后，在其黄体组织中PPV主要在黄体细胞中进行复制，随着感染时间的延长，黄体组织中PPV载 第五章猪细小病毒感染诱导初孕母猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生研究73量显著升高，且受感染细胞数量也显著增加。同时，黄体组织病理损伤愈加严重，黄体组织中发生凋亡的黄体细胞数量也显著增多。这也就表明，PPV在黄体细胞中的复制和黄体组织中PPV病毒载量的升高可能是诱导黄体细胞凋亡的原因，且黄体组织中发生凋亡的黄体细胞数量又决定了黄体组织损伤的严重程度。第四章研究发现，PPV感染体外培养猪黄体细胞可通过抑制孕酮合成降低黄体细胞孕酮的产量。本章研究进一步通过研究PPV感染后初孕母猪机体孕酮水平发现，体内条件下PPV感染同样可以抑制黄体细胞中StAR、3β-HSD和CYP11A1的表达，进而抑制了黄体组织孕酮的产生。有研究表明，黄体组织孕酮产量的下降可导致黄体组织细胞凋亡(Stoccoetal.2007;Yadavetal.2005)。所以，虽然前期第四章研究结果显示PPV感染诱导黄体细胞凋亡参与抑制黄体细胞孕酮的合成。但是，PPV诱导黄体细胞凋亡前，PPV感染对黄体组织孕酮产量的影响仍需进一步确认；且PPV感染诱导的黄体组织细胞凋亡与PPV感染诱导黄体组织孕酮产量下降之间的关系也有待进一步研究。综上所述，人工感染PPV诱导初孕母猪黄体组织中黄体细胞凋亡过程中同样激活了p38、p53和线粒体通路，同时，人工感染PPV也可通过抑制黄体细胞孕酮合成进而导致初孕母猪血清中孕酮水平下降。5.5小结在初孕母猪黄体组织中，PPV主要在黄体细胞中进行复制；初孕母猪黄体组织中PPV病毒量、黄体组织和黄体细胞病理学损伤程度以及黄体组织中发生凋亡的细胞数量与PPV感染时间长度成正比。PPV人工感染初孕母猪黄体组织细胞凋亡过程中同样诱导了p38蛋白磷酸化、p53蛋白积累并抑制了Bcl-2蛋白表达、促进了Bax蛋白表达；同时，人工感染PPV也能够抑制黄体细胞孕酮合成过程中关键蛋白StAR及关键酶3β-HSD和CYP11A1的表达导致初孕母猪血清中孕酮水平降低。 74猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究结论1.采集妊娠30~50d健康母猪卵巢，通过胶原酶消化法和密度梯度离心法分离纯化获得原代黄体细胞，经转染pCI-neo-hTERT质粒，建立了一株与原代猪黄体细胞在形态学特性、生物学特性和功能特征等方面一致的永生化猪黄体细胞系。2.PPV可以在原代和永生化黄体细胞中进行复制，并引起细胞出现典型凋亡特征。PPV感染可激活线粒体通路诱导黄体细胞凋亡。PPV感染激活了p53信号通路，并通过活化的p53调控线粒体通路诱导黄体细胞凋亡。p38MAPK发生磷酸化，磷酸化的p38MAPK参与调控p53、线粒体通路诱导黄体细胞凋亡。3.PPV感染可通过下调孕酮合成过程中的关键蛋白StAR及关键酶3β-HSD和CYP11A1的表达，抑制黄体细胞孕酮的合成。抑制PPV诱导的黄体细胞凋亡可部分上调PPV感染引起的黄体细胞孕酮产生水平。4.PPV可以在初孕母猪黄体组织的黄体细胞中进行复制，随着PPV感染时间的延长黄体组织中PPV病毒量显著上升，黄体组织和黄体细胞病理学损伤愈加严重，黄体组织中发生凋亡的细胞数量也显著增多，且凋亡细胞主要为黄体细胞。人工感染PPV诱导初孕母猪黄体组织细胞凋亡过程中同样激活了p38、p53和线粒体通路。人工感染PPV能够通过抑制黄体组织孕酮合成，导致初孕母猪血清中孕酮水平下降。 创新点75创新点1.建立了一株与原代猪黄体细胞在形态学特性、生物学特性和功能特征等一致的永生化猪黄体细胞系。2.发现了PPV感染可诱导黄体细胞凋亡，PPV感染通过激活p38、p53和线粒体通路诱导猪黄体细胞凋亡。3.发现了PPV感染可通过诱导黄体细胞凋亡和抑制黄体细胞孕酮产生，从而降低机体孕酮产生水平。4.通过对初孕母猪进行人工感染PPV，验证了PPV感染诱导黄体组织细胞凋亡和降低机体孕酮产生水平的分子机制。 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英文缩略词及中英文对照91英文缩略词及中英文对照英文缩写英文全称中文名PPVporcineparvovirus猪细小病毒hTERThumantelomerasereversetranscriptase人端粒酶反转录酶3β-HSD/HSD3B13β-hydroxysteroiddehydrogenase3β-羟基类固醇脱氢酶StAR/STARSteroidogenicacuteregulatoryprotein类固醇敏感调节蛋白P450scc/CYP11A1P450cholesterolside-chaincleavageenzyme胆固醇侧裂分解酶LHCGRLuteinizinghormonereceptor促黄体素受体PGRProgesteronereceptor孕酮受体PGF2αRProstaglandinF2αreceptor前列腺素F2α受体PRLRProlactinreceptor催产素受体ESREstrogenreceptor雌激素受体LHLuteinizinghormone促黄体素PGF2αProstaglandinF2α前列腺素F2αcaspaseaspartate-specificcysteineproteases天冬氨酸特异性半胱氨酸蛋白酶MAPKmitogen-activatedproteinkinase促分裂原活化蛋白激酶WNVWestnilevirus西尼罗病毒CVB3CoxsackievirusB3萨奇病毒B3CMVCytomegalovirus巨细胞病毒HSVHerpessimplexvirus单纯疱疹性病毒HBVHepatitisBvirus乙型肝炎病毒HCVHepatitisCvirus丙型肝炎病毒TMeVtheiler'smouseencephalomyelitisvirus脑脊髓炎病毒SINVsindbisvirus辛德毕斯病毒MVEVMurrayValleyencephalitisvirus美利谷脑炎病毒CTLsCytotoxicTlymphocytes细胞毒性T淋巴细胞cytcCytochromec细胞色素cAPAF1Apoptosispeptidaseactivatingfactor1凋亡蛋白活化因子-1vBcl-2sviralBcl-2proteins病毒Bcl-2蛋白vMIAViralmitochondria-localizedinhibitorof病毒线粒体局限性凋亡抑制apoptosis剂vMAPViralmitochondrialantiapoptoticprotein病毒线粒体抗凋亡蛋白ANTAdeninenucleotidetranslocase腺嘌呤核苷酸转位酶VDACvoltage-dependentanionchannel电压依赖阴离子通道PTPCpermeabilitytransitionporecomplex渗透转换孔复合物MAP2microtubule-associatedprotein2微管相关蛋白2 92猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究TBPTATAboxbindingproteinsTATA盒结合蛋白TAFsTBP-associatedfactorsTBP-相关因子DDRDNAdamageresponseDNA损伤反应EBVEpstein-Barrvirus埃博拉病毒LMPlatentmembraneprotein潜伏膜蛋白ALVavianleukosisviruses禽白血病病毒LMBVlargemouthBassvirus大鲈鱼病毒ROSreactiveoxygenspecies活性氧NCVNewcastlediseasevirus新城疫病毒IL-6Interleukin-6促进白介素-6AKAVakabanevirus赤羽病毒PRRSVporcinereproductiveandrespiratory猪生殖和呼吸综合征病毒syndromevirusUPRunfoldedproteinresponse未折叠蛋白反应PEDVporcineepidemicdiarrheavirus猪流行性腹泻病毒P4Progesterone孕酮CPFcytopathiceffect细胞病变效应MOI感染复数 致谢93致谢转眼间，自己的博士研究生生活即将结束，瞬间感慨万分。在攻读博士研究生的这5年时间里，我的导师童德文教授如同对待自己的儿女般在工作和生活中都给予了我莫大的鼓励与指导。同时，童老师严谨治学的态度、谦和宽博的胸怀、钻心科研的工作精神也深深地感染着我，激励着我。在今后的工作中，我将时刻铭记童老师对我的教诲，更加努力的做好自己的工作，以期最好的报答老师。在此，我想向我的恩师致以最诚挚的感谢！祝愿您身体健康、工作顺利、事事顺心如意！感谢黄勇教授、赵晓民副教授、常玲玲讲师、张文龙副教授和杜谦博士后，感谢他们在我的整个博士研究生工作过程中给予我的耐心指导和无私帮助，在我学习和试验过程中也都提出了各种宝贵的建议和意见。在此对各位老师表示衷心的感谢，祝您们身体健康、工作顺利！感谢同届进入本实验室的同门李德龙博士，过往的工作中他给我很多帮助和支持。感谢博士研究生罗小毛、王彤彤、马雪连、张秀娟、王晓亚、韩聪、武星辰、王振宇和硕士研究生张倢、李珏君、郭建雄、张泽林、熊颖黎、张小华以及邵婷师妹等在试验中对我的帮助。有你们博士生活如此多彩，祝你们试验顺利，学业有成！特别感谢我的家人，在生活中他们给予了我很多的理解、支持、鼓励与欢乐。在我迷茫时，你们是我奋发向上的强大动力，是我能够顺利完成学业的坚强后盾。感谢你们对我的爱，一路上有你们，我将努力前行，永不放弃！最后，感谢所有曾经帮助过我的老师、同学和朋友们，祝你们身体健康、工作顺利、生活幸福！张樑2018年4月 94猪细小病毒诱导猪黄体细胞凋亡及抑制孕酮产生机制研究作者简介张樑，女，汉族，中共党员，1987年9月出生，籍贯河南省新郑市，2006年9月考入河南科技大学动物科技学院动物医学专业，2010年6月获得农学学士学位。2010年9月考入西北农林科技大学动物医学院临床兽医学专业，2013年6月获得农学硕士学位。2013年9月考入西北农林科技大学动物医学院基础兽医学专业，师从童德文教授，主要从事动物病理学方面的研究。一、博士期间发表论文情况：1.LiangZhang,ZhenyuWang,JieZhang,XiaomaoLuo,QianDu,LingingChang,XiaominZhao,YongHuang,DewenTong.PorcineparvovirusinfectionimpairsprogesteroneproductioninlutealcellsthroughMAPKs,p53andmitochondria-mediatedapoptosis.BiologyofReproduction,2018,doi:10.1093/biolre/ioy014.(SCI,IF:3.432,JCR1区)2.LiangZhang,YongHuang,ZhenyuWang,XiaomaoLuo,HonglingZhang,QianDu,LinglingChang,XiaominZhao,DewenTong.Establishmentandcharacterizationofatelomeraseimmortalizedporcinelutealcells.Theriogenology,2017,94:105-113.(SCI,IF:1.986,JCR1区)3.LiangZhang,JieZhang,TingShao,XiaomaoLuo,QianDu,LingingChang,XiaominZhao,YongHuang,DewenTong.PPVinfectionresultsinreproductivefailurebydisruptingprogesteroneregulation.JournalofCellularPhysiology,待投4.ZhangWenlong,WangZhenyu,ZhangLiang,ZhangZelin,ChenJinxuan,ChenWeicong,TongDewen.Melatoninstimulatestheproductionofprogesteronealongwiththeexpressionofcholesterolside-chaincleavageenzyme(P450scc)andsteroidogenicacuteregulatoryprotein(StAR)incorpusluteumofpregnantsows.Theriogenology,2018,108:297-305.(SCI,IF:1.986)5.ZhaoXiaomin,XiangHailing,BaiXiaoyuan,FeiNaijiao,HuangYong,SongXiangjun,ZhangHonglin,ZhangLiang,TongDewen.Porcineparvovirusinfectionactivatesmitochondria-mediatedapoptoticsignalingpathwaybyinducingROSaccumulation.VirologyJournal,2016,13:26.(SCI,IF:2.139)6.ZhaoXiaomin,SongXiangjun,BaiXiaoyuan,FeiNaijiao,HuangYong,ZhaoZhimin,DuQian,ZhangHonglin,ZhangLiang,TongDewen.miR-27battenuatesapoptosisinducedbytransmissiblegastroenteritisvirus(TGEV)infectionviatargetingrunt-relatedtranscriptionfactor1(RUNX1).PeerJ,2016,4:e1635.(SCI,IF:2.177) 作者简介957.ZhangHongling,HuangYong,WangLili,YuTingting,WangZengguo,ChangLingling,ZhaoXiaomin,LuoXiaomao,ZhangLiang,TongDewen.Immortalizationofporcineplacentaltrophoblastcellsthroughreconstitutionoftelomeraseactivity.Theriogenology,2016,85(8):1446-56.(SCI,IF:1.986)8.LuHao,MaFeng,ZhangLiang,WangJianguo,WuChenchen,ZhaoBaoyu.Swainsonineinducedapoptosispathwayincerebralcorticalneurons.ResearchinVeterinaryScience,2015,102:34-7.(SCI,IF:1.504)9.ZhangHongling,HuangYong,DuQian,LuoXiaomao,ZhangLiang,ZhaoXiaomin,TongDewen.PorcineparvovirusinfectioninducesapoptosisinPK-15cellsthroughactivationofp53andmitochondria-mediatedpathway.BiochemicalandBiophysicalResearchCommunications,2015,456(2):649-55.(SCI,IF:2.371)二、博士期间参加会议情况：1.中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十一次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第二十次学术研讨会.中国山西太原.（PPT汇报）2.中国畜牧兽医学会兽医病理学分会第二十次学术研讨会暨中国病理生理学会动物病理生理专业委员会第十九次学术研讨会.中国宁夏.（PPT汇报）
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