基于适配体功能化PDMS膜-SERS检测两种食源性致病菌的研究

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硕士学位论文题目：基于适配体功能化PDMS膜-SERS检测两种食源性致病菌的研究英文并列题目：AptamerfunctionalizedPolydimethylsiloxane（PDMS）film-SERSdetectionmethodsoftwofoodbornepathogenicbacteria研究生：沈默斐专业：营养与食品卫生学研究方向：食品安全检测导师：王周平教授指导小组成员：段诺副教授学位授予日期：2018年6月答辩委员会主席：孙秀兰教授江南大学地址：无锡市蠡湖大道1800号二O一八年六月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研宄成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研宄成果，也不包含本人为获得江南一大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我同工作的同志对本研宄所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。ｔ日签名：讀期：么＾年月曰《Ｚ／关于论文使用授权的说明本学位论文作者完全了解江南大学有关保留：、使用学位论文的规定江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被査阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文，一致并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相。保奋的学位论文在解密后也遵守此规定。Ｉ签名：切：导师签名叫，曰期：叫ｇ年６月６曰 摘要摘要食源性疾病是威胁全球公共卫生的重要因素，对人类健康造成了严重的影响与危害。其中食源性致病菌是引起食源性疾病的主要原因。传统的食源性致病菌检测方法通常在操作步骤和过程上耗时耗力，且在灵敏度和特异性上都有一定的缺陷。因此，发展更为快捷方便、灵敏度高和特异性好的检测方法对保障食品安全具有重要意义。表面增强拉曼光谱（SERS）是一种具有高灵敏度的无损快速检测技术，基于拉曼“热点”作用，制备具有良好SERS效应的基底是SERS技术发展的关键。选择一种稳定、经济的SERS基底固态支撑材料应用于食源性致病菌的快速检测具有十分重要的意义。本研究以纳米金颗粒作为SERS基底，以适配体作为识别分子。构建基于适配体功能化聚二甲基硅氧烷（PDMS）-SERS检测食源性致病菌的方法，并应用于实际样品检测。主要工作内容包括：首先，构建一种基于适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌的方法。首先利用食人鱼溶液（piranha）以及3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对PDMS膜表面进行化学改性，并连接纳米金颗粒制备得到Au-PDMS膜。然后，利用金硫键将适配体固定于Au-PDMS膜形成捕获基底。同时，制备了拉曼信号分子巯基苯甲酸（4-MBA）与副溶血性弧菌适配体同时修饰的纳米金颗粒作为信号分子探针。当靶标存在时，基于适配体与靶标的特异性结合，形成“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构，通过测定拉曼强度从而实现对副溶血性弧菌的检测。结果表明，在最优实验条件下，副溶血26-1性弧菌在1.2×10cfu/mL~1.2×10cfu/mL范围内与4-MBA在1592cm位移处的相对拉2曼强度呈现良好的线性关系（y=544.68x-944.13，R=0.9948），最低检测限为12cfu/mL。将该方法应用于实际虾肉样品检测，结果与平板计数法的检测结果无显著差异，表明该方法准确可靠。其次，构建一种基于适配体免固定化Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌的方法。为进一步提高检测的便捷性，首先通过PDMS前聚体还原氯金酸制备Au-PDMS膜。接着将半胱胺通过金硫键连接于Au-PDMS膜使其表面带正电荷。然后，将信号分子探针（4-MBA通过金硫键连接适配体修饰的纳米金颗粒）通过静电作用吸附于膜表面。当靶标存在时，基于适配体与靶标的特异性结合，信号分子探针与靶标特异性结合并从膜表面脱落，通过测定拉曼强度变化从而实现对副溶血性弧菌的检测。结果显示，在最优实验条件下，26-1副溶血性弧菌在3.3×10cfu/mL~3.3×10cfu/mL范围内和4-MBA在1592cm位移处的相2对拉曼强度呈现良好的线性关系（y=650.78x-1063.2，R=0.9913），最低检测限为33cfu/mL。将该方法应用于实际虾肉样品检测，结果与平板计数法检测的结果相比无显著差异，表明该方法准确可靠。最后，构建一种基于适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌的方法。首先，将两种适配体通过金硫键固定在上述研究制备得到的Au-PDMS膜上，作为固态双重捕获基底。然后，制备4-MBA、尼罗蓝A（NBA）分别修饰的两种信号分子探针。当靶标存在时，基于适配体与靶标的特异性结合，形成双重“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹I 摘要心结构，通过测定拉曼强度从而实现对双靶标的检测。结果表明，在最优实验条件下，26-1副溶血性弧菌在2.5×10cfu/mL~2.5×10cfu/mL范围内和4-MBA在1592cm位移处的相2对拉曼强度呈现良好的线性关系（y=567.24x-485.86，R=0.9883），最低检测限为2526-1cfu/mL。鼠伤寒沙门氏菌在4.5×10cfu/mL~4.5×10cfu/mL范围内和NBA在592cm位移2处的相对拉曼强度呈现良好的线性关系（y=324.57x-514.03，R=0.9892）,最低检测限为45cfu/mL。将该方法应用于实际虾肉样品检测，结果与平板计数法检测的结果相比无显著差异，表明该方法准确可靠。关键词：适配体；聚二甲基硅氧烷；副溶血性弧菌；鼠伤寒沙门氏菌；表面增强拉曼光谱；II AbstractAbstractFoodbornediseaseisanimportantfactorthreateningglobalpublichealth,whichhascausedseriousimpactsandhazardsonhumanhealth.Foodbornepathogensarethemaincausesoffoodbornediseases.Traditionaldetectionmethodsoffoodbornepathogensareusuallytime-consuminginoperationstepsandprocesses,andhavesomedefectsinsensitivityandspecificity.Therefore,itisofgreatsignificancetodevelopamorerapid,convenient,sensitiveandspecificdetectionmethodsforensuringfoodsafety.Surface-enhancedRamanspectroscopy(SERS)isanon-destructiveandrapiddetectiontechnologywithhighsensitivity.Basedonthe"hotspot"effect,preparingasubstratewithagoodSERSeffectisakeyfactorinthedevelopmentofSERStechnology.ItisveryimportanttoselectastableandeconomicalsolidsupportmaterialofSERSsubstrateforrapiddetectionoffoodbornepathogens.Inthisstudy,goldnanoparticleswereusedasSERSsubstrates,andaptamerswereusedasrecognitionmolecules.AmethodbasedonaptamerfunctionalizedPolydimethylsiloxane(PDMS)-SERSforthedetectionoffoodbornepathogenswasdevelopedandappliedtothedetectionofrealsamples.Themainworkincludes:Firstly,amethodbasedonaptamerfunctionalizedPDMSfilmforsandwich-typewasdevelopedforthedetectionofV.parahaemolyticus.Atfirst,thesurfaceofPDMSfilmwaschemicallymodifiedbypiranhaandAPTES,andAu-PDMSfilmwaspreparedbyconnectinggoldnanoparticles.Then,thegold-sulfurbondwasusedtoimmobilateaptamersontheAu-PDMSfilmtoformthecapturesubstrate.Atthesametime,wehadpreparedRamansignalmolecule4-MBAconnectinggoldnanoparticlesmodifiedbyaptamersofV.parahaemolyticusassignalmolecularprobes.Whenthetargetexisted,thesandwichstructureof"capturesubstrate-target-signalmolecularprobe"wasformedbasedonthespecificbindingoftheaptamersandtargets,andthedetectionofV.parahaemolyticuswasachievedby-1measuringtheRamanintensity.Theresultsshowedthesignalof4-MBAat1592cmwas2linearlyrelatedtotheV.parahaemolyticusconcentrationintherangebetween1.2×1062cfu/mL~1.2×10cfu/mL（y=544.68x-944.13，R=0.9948）,withadetectionlimitof12cfu/mL.Themethodhadbeensuccessfullyappliedinspikedprawnsampletesting.Secondly,amethodbasedonaptamernonimmobilizedAu-PDMSfilmfordetectionofV.parahaemolyticuswasdeveloped.Inordertofurtherimprovetheconvenienceofdetection,theAu-PDMSfilmwasfirstlypreparedthroughthereductionofchloroauricacidbyPDMSprecursor.ThencysteaminewasconnectedtotheAu-PDMSfilmbygold-sulfurbondtomakethesurfacepositivelycharged.Then,thesignalmoleculeprobe(4-MBAwasmodifiedbygold-sulfurbondandgoldnanoparticlesmodifiedbyaptamers)wasadsorbedonthesurfaceofthefilmbyelectrostaticinteraction.Whenthetargetexisted,basedonthespecificityoftheaptamerandtarget,thesignalmolecularprobecombinedwiththetargetspecificityandfelloffthesurfaceofthefilm.ThedetectionofV.parahaemolyticuswasachievedbymeasuring-1thechangeofRamanintensity.Theresultsshowedthesignalof4-MBAat1592cmwas2linearlyrelatedtotheV.parahaemolyticusconcentrationintherangebetween3.3×1062cfu/mL~3.3×10cfu/mL(y=650.78x-1063.2，R=0.9913)withadetectionlimitof33cfu/mL.III AbstractThemethodhadbeensuccessfullyappliedinspikedprawnsampletesting.Finally,amethodbasedonaptamerfunctionalizedPDMSfilmwasdevelopedforthesimultaneousdetectionoftwopathogenicbacteria.TheAu-PDMSfilmmodifiedbytwokindsofaptamerswereusedasthesolid-statecapturingsubstrate,andtwotypesofsignalmolecularprobesmodifiedbyaptamers,4-MBAandNBAwereprepared,andadualsandwichstructurebasedoncapturedsolidsubstratesanddualtargetswasestablishedforSERSdetectionofVibrioparahaemolyticusandSalmonellatyphimurium.Theresultsshowedthesignalof-14-MBAat1592cmwaslinearlyrelatedtotheV.parahaemolyticusconcentrationinthe262rangebetween2.5×10cfu/mL~2.5×10cfu/mL(y=567.24x-485.86,R=0.9883).Thedetectionlimitis25cfu/mL.Inthesameway,TheresultsshowedthesignalofNBAat592-12cmwaslinearlyrelatedtotheS.typhimuriumconcentrationintherangebetween4.5×1062cfu/mL~4.5×10cfu/mL(y=324.57x-514.03,R=0.9892).Thedetectionlimitis45cfu/mL.Themethodhadbeensuccessfullyappliedinspikedprawnsampletesting.Keywords:aptamer；Polydimethylsiloxane；V.parahaemolyticus；S.typhimurium；SERSIV 目录目录摘要.........................................................................................................................................IAbstract....................................................................................................................................III目录.......................................................................................................................................V1绪论........................................................................................................................................11.1食源性致病菌.................................................................................................................11.2食源性致病菌检测技术概述.........................................................................................11.2.1传统微生物检测方法...............................................................................................21.2.2分子生物学方法.......................................................................................................21.2.3免疫学方法...............................................................................................................31.2.4生物传感器方法.......................................................................................................31.3适配体.............................................................................................................................41.3.1适配体概述...............................................................................................................41.3.2适配体在食源性致病菌检测中的应用...................................................................51.4表面增强拉曼光谱.........................................................................................................61.4.1拉曼光谱的概述........................................................................................................61.4.2表面增强拉曼光谱的概述........................................................................................61.4.3表面增强拉曼光谱基底的介绍与应用...................................................................71.5聚二甲基硅氧烷.............................................................................................................81.5.1聚二甲基硅氧烷概述...............................................................................................81.5.2聚二甲基硅氧烷在表面增强拉曼光谱中的应用...................................................81.6本课题的立题意义和研究内容.....................................................................................92实验材料与方法..................................................................................................................112.1实验材料与设备...........................................................................................................112.1.1实验材料与主要试剂.............................................................................................112.1.2主要仪器.................................................................................................................112.2基于适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌方法的研究...................122.2.1检测原理.................................................................................................................122.2.2PDMS膜的制备......................................................................................................122.2.3适配体功能化PDMS膜的制备............................................................................122.2.4信号分子探针的制备.............................................................................................132.2.5实验条件的优化.....................................................................................................132.2.6副溶血性弧菌的检测.............................................................................................142.2.7特异性实验.............................................................................................................142.2.8虾肉样品副溶血性弧菌的空白加标回收.............................................................142.3基于适配体免固定化Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌方法的研究........................152.3.1检测原理.................................................................................................................15V 目录2.3.2Au-PDMS膜的制备................................................................................................152.3.3信号分子探针的制备与固定.................................................................................152.3.4实验条件的优化.....................................................................................................162.3.5副溶血性弧菌的检测.............................................................................................162.3.6特异性实验.............................................................................................................162.3.7虾肉样品副溶血性弧菌的空白加标回收.............................................................162.4基于适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌方法的研究..............................172.4.1检测原理.................................................................................................................172.4.2两种适配体功能化PDMS膜的制备....................................................................172.4.3两种信号分子探针的制备.....................................................................................172.4.4实验条件的优化.....................................................................................................182.4.5副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌的同时检测.....................................................182.4.6特异性实验.............................................................................................................192.4.7虾肉样品副溶血性弧菌及鼠伤寒沙门氏菌的空白加标回收.............................193结果与讨论..........................................................................................................................203.1基于适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌方法的研究...................203.1.1纳米金颗粒的表征.................................................................................................203.1.2Au-PDMS膜的表征................................................................................................203.1.3适配体功能化PDMS膜的表征............................................................................213.1.4副溶血性弧菌信号分子探针的表征.....................................................................223.1.5实验条件的优化.....................................................................................................223.1.6线性范围与检测限.................................................................................................253.1.7特异性实验.............................................................................................................263.1.8虾肉样品中副溶血性弧菌空白加标回收.............................................................273.2基于适配体免固定化Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌方法的研究........................273.2.1Au-PDMS膜的表征................................................................................................273.2.2副溶血性弧菌信号分子探针的表征.....................................................................283.2.3实验条件的优化.....................................................................................................283.2.4线性范围与检测限.................................................................................................293.2.5特异性实验.............................................................................................................303.2.6虾肉样品中副溶血性弧菌的空白加标回收.........................................................313.4基于适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌方法的研究..............................313.4.1Au-PDMS膜的表征................................................................................................313.4.2两种适配体功能化PDMS膜的表征....................................................................313.4.3两种信号分子探针适配体的表征.........................................................................323.4.4实验条件的优化.....................................................................................................343.4.5线性范围与检测限.................................................................................................35VI 目录3.4.6特异性实验.............................................................................................................363.4.7虾肉样品中副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌的空白加标回收.........................38主要结论与展望......................................................................................................................39主要结论..............................................................................................................................39展望......................................................................................................................................39致谢..........................................................................................................................................41参考文献..................................................................................................................................42附录：作者在攻读硕士学位期间发表的论文....................................................................48VII 1绪论1绪论1.1食源性致病菌食源性致病菌是引起食物中毒，导致食源性疾病爆发的主要因素，是食品安全问题[1]的重要隐患。世界卫生组织近二十年的统计，结果显示由致病性微生物导致的疾病患[2-4]病率呈持续上升趋势，占食源性疾病的70%。在美国每年约有7600万例因食源性致[5]病菌引起的病例，导致325,000人住院和5000人死亡。中国食源性疾病暴发检测与报告中也显示，近十年来，由食源性致病菌所引起的事件高达五千多起，导致数千人死亡。食源性致病菌中较为常见的有副溶血性弧菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、[6][7]单核细胞增生李斯特菌等。孙钊等对2012-2016年无锡市食品中食源性致病菌的污染情况进行了调查，共采集1129件样品，结果显示，食源性致病菌样品为158件，总检出率为13.99%，其中副溶血性弧菌为监测样品中检出率最高的食源性致病菌，为[8]22.54%。刘仲义等对2010-2011年江苏部分地区进行沙门菌污染状况调查。结果显示，生猪肉样品为335份，总检出率为9.25%。副溶血性弧菌为革兰氏阴性杆菌，1950年在日本因一次食源性疾病的暴发首次被分[9]离发现，海岸、靠近海岸的海水、海水衍生物以及各类鱼虾贝等海产品都是副溶血性弧菌活跃的场所。该菌在5℃43℃的条件下均可生长，但是不耐高温，烹饪至65℃即可[10]被杀死，但是随着即食生鲜产品（如海蜇、鱿鱼、海虾等）的上市，发生了大量副溶血性弧菌的感染事件。副溶血性弧菌感染除了会引起一般食源性疾病所具有的症状（恶[11]心、呕吐和腹泻等）外，在某些条件下还会引起伤口感染、中耳炎及败血症等。另外一种常见的食源性致病菌—鼠伤寒沙门氏菌，是革兰氏阴性肠道杆菌，是导致急性肠胃[12][13]炎的主要病原菌之一，在生肉类中较为常见，鼠伤寒沙门氏菌不耐高温，可以通过[14][15]彻底烹煮食物以将其杀死，但是随着人们在生活中消费的冷鲜肉数量越来越大，以及不规范的生产操作习惯或者有限简陋的运输条件，导致了大量的鼠伤寒沙门氏菌的感染事件的发生，主要症状为发热、腹泻、厌食、呕吐、腹痛、腹胀等，对人类的健康造成了巨大的威胁。我国食品安全国家标准(GB29921-2013)中对副溶血性弧菌和沙门氏菌都做出了严格的限量规定。对于水产制品中副溶血性弧菌的限量是m=100MPN/g，M=1000MPN/g；对沙门氏菌的指标设置则更为严格。标准对所有11类食品都设置沙门氏菌限量规定，[16]任何产品的任意样品都不得检出沙门氏菌。因此，对于两种危害巨大、严重影响人们生活健康的食源性致病，建立快速灵敏、经济便捷的检测技术是十分必要的。1.2食源性致病菌检测技术概述常用的食源性致病菌的检测方法包括传统的微生物检测方法，分子生物学方法，免疫学方法，以及生物传感器方法。1 江南大学硕士学位论文1.2.1传统微生物检测方法传统的微生物培养法如平板计数法是建立在对样品分离、纯化培养和生化鉴定基础[17]上的一种常用分析方法。整个流程虽然操作比较繁琐，工作量大，不能满足现场快速[18]检测的需求，但因其结果稳定性好而被作为检测食源性致病菌的标准方法。尽管当前这种方法是最经典且稳定性最好的方法，但随着生物技术发展，许多相较于传统方法更快速、灵敏度更好的新技术出现在了食源性致病菌的检测领域。1.2.2分子生物学方法分子生物学检测技术在目前微生物检测领域属于应用较广的检测技术。核酸是遗传信息的编码、传输和表达的重要单元，该方法通过对检测物中的核酸进行扩增来增强其反应信号，从而达到识别相应微生物种类的目的。这种检测方法具有特异性好、灵敏度高、操作便捷等特点。分子生物学方法包括了聚合酶链式反应技术（PolymeraseChainReaction，PCR）、DNA探针技术、生物芯片技术、环介导恒温扩增技术(LAMP)等。[19]其中PCR技术被广泛使用，PCR技术还包括常规PCR、多重PCR、实时荧光定量[20][21][22]PCR、免疫PCR等。Sabet等应用PCR技术对食品样品中的金黄色葡萄球菌进行[23]快速检测，检测时间低于3h。Zhang等分别对副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌的引物标记FAM（羧基荧光素）、ROX（罗丹明）、HEX（六氯荧光素氨基磷酸酯）三种荧光基团，利用多重实时荧光定量PCR方法，实现对生虾中副溶血性弧菌、单核细胞增生李斯特菌和沙门氏菌的同时检测，样品中的副溶血性弧菌检测限达到112cfu/mL，单核细胞增生李斯特菌检测限达到158cfu/mL，沙门氏菌检测限达到103cfu/mL。DNA探针技术是利用特异性DNA片段作为检测探针，检测在样品中与探针碱基信息互补配对的微生物，某些标记物（放射性同位素、酶、荧光素、化学发光物、[24]镧系元素等）可以反映出检测微生物的含量。曹小红等通过制备地高辛标记DNA探针，对副溶血性弧菌tlh基因进行检测，从而达到副溶血性弧菌菌株的鉴定目标。为提高检测效率，在DNA探针技术基础上发展了生物芯片技术。该技术是由微电子学与生命科学等学科相互关联发展出来的一门新技术，生物芯片能够直接检测致病菌的DNA，[25]相对于传统的生物检测技术具有所需样品量少、信息量大、污染少等优点。Disney[26]等利用多种单糖衍生物制备的芯片进行大肠杆菌的检测。环介导恒温扩增技术[27]（LAMP），这是一种进化的核酸扩增方法，现在已经广泛作为食源性致病菌检测的手段，它是针对目的DNA链上的6个区域设计4条特异性引物，利用一种链置换DNA聚合酶在恒温条件下进行扩增反应，可在30～60min内实现高效率的扩增。LAMP技术的出现解决了PCR对温度循环仪器的要求，LAMP反应中，固定温度的条件下样品[28]就可大量扩增并且无需温度循环。Ohtsuka等采用LAMP技术对可能感染沙门氏菌的水样鸡蛋进行抽样检测，并与传统平板培养法和PCR法进行比对，结果显示在110个样品中，PCR法有10%未能检出，而该方法全部检出且耗时短，具有灵敏度高、检测高效的特点。2 1绪论1.2.3免疫学方法免疫学检测一般是针对不同的机体有不同的抗原，而抗原（包括蛋白，多糖和细胞表面的其它分子）能刺激机体产生相应的特异性抗体，当抗原和抗体在体外特异性结合后，可出现肉眼可见或借助仪器可检测出的反应现象，通过监测这些信号来检测的方法。该方法灵敏度高，特异性好，已被广泛应用于食源性致病菌的检测，包括酶联免疫吸附[29][30][31][32]技术（ELISA）、免疫磁性分离技术和化学发光免疫分析法等。如Wu等以抗沙门氏菌单克隆抗体C1359作为检测抗体，以抗沙门氏菌多克隆抗体作为捕获抗体，建4立了一种沙门氏菌双抗夹心ELISA的快速检测方法，该方法检测限为1×10cfu/mL。[33]Chunklok等同样利用ELISA方法，实现对鼠伤寒沙门氏菌的检测。将修饰有辣根过氧化物酶（HRP）的抗体固定于单壁碳纳米管（SWCNTs）上形成抗体-SWCNTs-HRP复合物，由于碳纳米管具有较大的表面积体积比，能固定较多的标记有HRP的抗体，当存在抗原时，更多标记有HRP的抗体被固定在板底，加入TMB即可显色从而达到放3[34]大信号，提高检测灵敏度的效果，最低检测限可达10cfu/mL。Xiong等将大肠杆菌O157:H7的抗体固定于磁珠，当靶标菌存在时，大肠杆菌O157:H7被磁珠捕获。使用此方法对牛奶样品中的大肠杆菌O157:H7进行检测，其捕获效率可达99.8%（菌数为16[35]10-10cfu/mL，磁珠量为0.05mg）。Magliulo等构建了一种同时检测大肠杆菌、结肠炎耶尔森杆菌、鼠伤寒沙门氏菌和单增李斯特菌的多通路“三明治”夹心化学发光免疫法，将每种细菌的单克隆抗体分别固定在微孔板中，当样品加入时，能够特异性结合相应单克隆抗体的细菌被捕获于板底，随后加入针对四种细菌的过氧化物酶标记的多克隆抗体的混合物，并使用低光电荷耦合成像装置，通过增强型基于鲁米诺的化学发光测4量每个孔中结合的多克隆标记抗体的过氧化物酶活性，每种菌的检测限可达10cfu/mL。1.2.4生物传感器方法生物传感器方法是一种由化学、物理、生物、医学、材料和电子技术等多种学科互相关联所形成的高新微量分析方法。生物传感器一般由生物分子识别元件以及信号转换元件组成。其中识别元件一般由抗原或抗体分子组成，信号转换元件一般以电容生物、[36]表面胞质团共振、石英晶体微平衡器等为主。与传统的检测方法相比，生物传感器方法灵敏度高、操作简便，而且成本低、便于携带。随着纳米技术的不断进步与发展，越来越多的研究利用电学方法、光学技术等手段发展新的信号转换元件。根据信号转换方式不同，可将电化学生物传感器分为电流信号改变、电阻信号改变[37]和电势信号改变的三种传感器。该方法具有灵敏度高，检测效率高的特点。Luo等构建了一种以光电倍增管作为信号转换元件的电化学生物传感器。将样品中的生物荧光信号通过光电倍增管转换为电流信号，根据输出电流和入射光子数成正比，可以计算出38样品中大肠杆菌、金黄色葡萄球菌和细菌总数，结果显示在10～10cfu/mL范围内与[38]平板计数法有很好的相关性。Pal等构建了一种利用导电物质聚苯胺改变系统的电阻值，从而实现对细菌的检测的生物传感器。首先将聚苯胺与蜡样芽孢杆菌抗体连接，聚苯胺是一种良好的导电聚合物，当蜡样芽胞杆菌存在时，抗原-抗体特异性结合使得电3 江南大学硕士学位论文极间形成电桥，导致系统的电阻值变化从而实现对蜡样芽胞杆菌检测信号的变化，检测[39]限为35~88cfu/mL。Gustavo等构建了一种将单壁碳纳米管作为电子离子转换器的生物传感器，实现对大肠杆菌的检测。适配体通过与单壁碳纳米管上的羧基形成酰胺键被固定在碳纳米管上，当适配体和靶标分子大肠杆菌发生特异性结合时，引起电势变化从而实现大肠杆菌检测信号的变化，并将此方法应用到实际样品牛奶和苹果汁中大肠杆菌的检测，检测限分别为6cfu/mL，26cfu/mL。[40]光生物传感器也是近年来研究的热点。Sim等建立了一种基于微流控技术的光化学生物传感器。在入射光的存在下，固定在波导传感器上的抗体与靶标抗原反应，使传感器表面的折射率产生变化，导致了磁电场两种偏振发生变化，从而对实际样品中的单[41]增李斯特菌进行检测。Shrivastava等建立了一种基于金黄色葡萄球菌适配体识别的荧光生物传感器。制备了荧光纳米磁珠并与适配体连接，将适配体作为识别元件。利用发光二极管作为激发源的智能手机照相机进行荧光成像识别荧光信号，最低检测限为10cfu/mL，其检测原理如图1-1所示。传统的电学信号作为转换元件因其较高的成本限制了其推广与应用。相较于电化学法，光学法由于更易实现小型化、快速便捷的检测，更多地运用在对于致病菌检测的生物传感器的研究应用中。然而这些方法的识别原件都是以抗体为主，但抗体的制备需要较高成本且不易储存，使用起来有一定局限性。近年来有许多新方法、新技术被应用于识别原件以及信号转换元件，如寡核苷酸适配体和表面增强拉曼光谱。图1-1图示为基于荧光纳米磁珠检测金黄色葡萄球菌的原理图Fig.1-1SchematicsofdetectionofS.aureusbasedonfluorescentmagneticnanoparticles.1.3适配体1.3.1适配体概述适配体是指通过指数富集的配体进化（systematicevolutionofligandsbyexponentialenrichment,SELEX）技术，从人工合成的寡核苷酸文库中进行筛选，从而获得可以与靶[42]标分子特异结合的单链DNA或RNA片段。当环境中存在靶标分子时，ssDNA或RNA适配体会针对靶标分子进行相应的空间折叠，形成茎环、发夹、G-四联体等高度有序的[43-44]三维空间结构，通过氢键、范德华力等作用力的作用，与靶标形成稳定的复合物。由于不同的靶标有不同的构型，因此相应的适配体空间结构也十分复杂多样，并具有很好的特异性和亲和性，被誉为“人工抗体”。相较于抗体，适配体在许多方面弥补了抗4 1绪论体的一些缺点和不足，并在某些方面加以改善。随着适配体筛选技术的逐步推动与发展，适配体慢慢成了抗体良好的替代品。它打破了人们对于核酸只具有遗传信息的存储和转[45-46]运功能的传统认识。相对于一般抗体，适配体的优势在于：1）筛选周期短，一般经历10～20轮筛选后即达到亲和饱和度，整个过程持续约1~2个月时间。并且适配体可直接从体外文库中筛选并合成，无需传统制备抗体中的动物实验过程，降低了时间与经济成本。2）适配体的靶标范围广，体外筛选靶分子可以是蛋白质、氨基酸、多肽、药物、[47]维生素、金属离子、有机染料，甚至致病菌、细胞、病毒等。3）与传统抗体相比，适配体性质更为稳定，不受合成批次的影响，而且易于修饰，如在5’端或3’端标记FAM、巯基基团、生物素等，且活性不受影响。基于适配体的种种优势，在相关的筛选技术逐步得到持续发展建立成熟体系后，适配体被广泛应用于众多研究领域，包括医学药物研发和疾病诊断等。在食品安全控制领[48-50][51-54][55-56]域，适配体已成功应用于对重金属、真菌毒素、食源性致病菌、农药残留[57-58]等的检测。1.3.2适配体在食源性致病菌检测中的应用随着人们对食品安全的日益关注，适配体在食源性致病菌中的应用越来越多，研究也越深入。Wang课题组一直致力于食源性致病菌适配体的筛选与应用研究，利用Cell-SELEX技术，先后得到了针对副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌、志贺宋内氏菌、[59-61]金黄色葡萄球菌和阪崎肠杆菌等食源性致病菌的适配体，为食源性致病菌的检测提[62]供了新思路。Wu等将适配体连接到具有过氧化物酶活性的ZnFe2O4/rGO纳米材料上组成一种光信号生物传感器，实现对鼠伤寒沙门氏菌的检测。当靶标鼠伤寒沙门氏菌存在时，体系形成“适配体-靶标-连有适配体的ZnFe2O4/rGO纳米材料”的夹心结构，加入TMB产生显色反应从而实现对鼠伤寒沙门氏菌的可视化检测，此方法检测限可达11[63]cfu/mL，其检测原理如图1-2所示。John等同样利用夹心法构建了一种基于适配体的[64]量子点荧光生物传感器，用于空肠弯曲杆菌的检测，检测限低至3cfu/mL。Wu等将标记拉曼信标罗丹明的适配体与Au@Ag核壳纳米颗粒连接，并与相应的cDNA结合，+体系存在靶标Ag时，适配体形成了发夹结构使得信标靠近基底，从而产生拉曼强度变化来达到超敏检测目的，其检测限可达50pM。在这些应用中，表面增强拉曼光谱作为一种具有高灵敏度，便捷操作以及能够定性定量的方法，通过与适配体的联用被广泛应用到对食源性致病菌的检测研究之中。5 江南大学硕士学位论文图1-2基于ZnFe2O4/rGO纳米材料作为过氧化物模拟酶对鼠伤寒沙门氏菌的比色检测原理图Fig.1-2SchematicofZnFe2O4/rGOasaperoxidasemimeticsforcolorimetricdetectionofS.typhimurium.1.4表面增强拉曼光谱1.4.1拉曼光谱的概述[65]Raman在1928年第一次发现了拉曼散射现象，拉曼散射是一种非弹性散射效应。其原理是当单色光照射到分子表面时产生散射光，而其中小部分的散射光会与分子产生[66-67]能量交换并改变光谱的波长，从而产生拉曼光谱。拉曼光谱与红外光谱类似，是一[68]种分子振动光谱，通过分子内官能团的振动产生谱图。由于不同分子有着不同的官能团，所以每一种分子具有特定的拉曼光谱，这一特点就是拉曼光谱的指纹特性，人们利用这一点，对测得的分子官能团的振动形式产生的拉曼光谱进行对比，达到快速检测分[69]析的目的。但是，由于拉曼散射中分子的拉曼散射截面极小，最强的拉曼散射也只有[70-71]整体散射光的千分之几，所以拉曼散射在本质上信号强度极其微小，这限制了其在检测领域的发展和应用。1.4.2表面增强拉曼光谱的概述[72]表面增强拉曼光谱(SERS)是一种具有高灵敏度的无损快速检测技术。Fleschman[73]在1974年发现了表面增强拉曼现象，当吡啶分子靠近并吸附在银电极表面时，吡啶分子的拉曼信号强度有很大增加，他们认为由于电极粗糙的表面积增加，从而产生了拉曼信号的增强。随着SERS技术的发展，人们发现拉曼信号的增强不仅仅简单的由表面[74]积的增加导致，还受粗糙表面的影响，是一种电磁增强机制。随着对SERS的深入研[75][76]究，其增强机制背后的电荷转移效应也被发现。如图1-3所示，当金属表面由于电磁波的射入而与之相互作用时，若此时金属表面粗糙，电磁波将在粗糙表面激发出局域表面等离子体，等离子体共振使得粗糙表面上形成非常强的局域电场，从而导致该区域[77-78]内的拉曼信号也随之增加。简而言之，SERS是一种基于纳米尺度颗粒体系或粗糙[79]金属表面的异常光学增强现象，采用表面增强技术采集待测样品的拉曼光谱，可以较[80]大幅度提高待检测物质的拉曼光谱强度。SERS具有操作简单、快速等优势，并且有着很高的特异性与灵敏性，所以在小分子、蛋白质、癌细胞检测方面的应用受到非常广[81-85]泛的关注。6 1绪论图1-3局域表面等离子体共振效应Fig.1-3IllustrationoftheLSPReffect1.4.3表面增强拉曼光谱基底的介绍与应用当今SERS研究的重点就是如何提高由表面等离子体共振效应引起的局域电场增强。[86]因金属纳米结构表面具有强大的电场增强位置即SERS热点，所以当前SERS的主要[87]研究是针对纳米金属材料作为SERS基底展开的。纳米金属材料因其尺寸小，比表面积大，具有独特的光、电学以及物化性质等特点，成为当今使用最广泛的SERS基底。[88][89]传统的SERS增强基底有金属纳米溶胶，例如纳米金颗粒，纳米银颗粒等。近十几[90]年来，纳米金颗粒由于其制备方法简单，性质稳定以及良好的生物相容性，作为SERS基底材料被广泛的应用在快速检测小分子、金属离子、蛋白质、致病菌、核酸及肿瘤细[91][92]胞的研究中。Joseph等利用纳米金、纳米银作为SERS基底，分别使用4-巯基苯甲酸、4,6-二甲基-2-巯基嘧啶和2-硫尿嘧啶作为信号分子，实现对鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌O157:H7及金黄色葡萄球菌的同时检测。首先，将SERS基底分别与目标菌的抗体相连，当目标菌存在时，相应的拉曼信号分子会与之结合，产生拉曼增强效应，通过对SERS强度的检测实现对致病菌的检测。为了进一步提高SERS检测的灵敏度，人们[93]研究了纳米金与其他纳米材料的复合SERS基底。Yan等设计了银壳包金核的SERS基底用于检测氯霉素，通过靶标的存在与标记了信号分子Cy5的适配体竞争从而达到检[94]测目的，检测限可达0.19pg/mL。Zhang等利用Fe3O4磁性纳米粒子与纳米金颗粒的复合材料作为SERS基底，同时利用两种拉曼信号标记对鼠伤寒沙门氏菌和金黄色葡萄[95]球菌进行同时检测，检测限分别可达到15cfu/mL，35cfu/mL。Yao等将Au@Ag作为SERS基底，罗丹明作为信号分子，通过滚环扩增法提供了大量位点，从而对SERS信号进行放大达到检测副溶血性弧菌的目的，检测限可达到1cfu/mL。如今，SERS检测技术普遍应用于液态体系，检测操作步骤繁多且成本高昂，这较大局限了检测方法在实际快速检测中的应用与推广。因此选择一种合适、稳定、廉价的固态支撑基底应用于实际快速检测有十分重要的意义。7 江南大学硕士学位论文1.5聚二甲基硅氧烷1.5.1聚二甲基硅氧烷概述聚二甲基硅氧烷（Poly(dimethylsiloxane),PDMS）作为一种被广泛使用的高分子聚[96]合物，有着生物相容性，弹性，气体渗透性，高透光性，良好的耐热性、稳定性以及[97-99][100]廉价并易于制作成型等优点，并且具有独特的可弯曲性能。这些特点使PDMS作为SERS基底的支撑材料有良好的应用前景，并引起了人们的广泛关注。PDMS作为一种柔性固态基底相对于液态检测体系，能够适用于多种复杂的检测环境与背景，有较高的实际使用意义。相对于一些传统的固态基底（硅片、玻璃片等），有着不易碎、充分接触样品等优点。这些特质使PDMS运用于实际快速检测中有着天然的优势。虽然PDMS有许多优点，但是它也具有高疏水性，非特异性吸附等不利的缺点，所以对PDMS表面改性以及赋予其一定功能化性质的研究具有十分重要的意义。1.5.2聚二甲基硅氧烷在表面增强拉曼光谱中的应用PDMS可以通过化学，物理等方法改性后与纳米材料复合，从而作为固态的SERS基底载体。PDMS作为载体既可保留纳米材料的性质又可提高复合材料的性能。现今有[101]许多对PDMS复合纳米材料的研究，Devi等利用PDMS前聚体对氯金酸水溶液进行还原生成Au-PDMS复合膜后，再利用EDC和NHS对其改性，将其应用于结合血清白[102]蛋白（HSA）的检测，检出限达到10g/ml。Sadabadi等利用乙醇在聚合物内渗透率高的特性，选择氯金酸乙醇溶液改进了作为生物传感性能材料的Au-PDMS复合膜，研究证明了改善过后的纳米金粒子在PDMS内分布更多并提高聚合物的自由体积。由于纳米金颗粒的存在，纳米复合材料的孔隙率比PDMS高40倍左右。此外，还发现了纳米[103]复合材料的弹性比PDMS高约20%。Feng等采用磁控溅射镀膜仪将不同厚度的金镀在PDMS表面（0.4、0.8、1.2、1.6、2、2.5、3.5、5和10nm）并对复合膜的性能进行研究。PDMS及其复合材料作为SERS检测中的基底载体已被广泛应用于分析检测领域。[104]陈慧等利用PDMS对有机物的富集功能，通过在纳米金粒子单层膜表面旋涂一层PDMS从而得到复合SERS基底，并对多环芳烃进行检测。相比于单一的基底，此方法[105]的检测限最少降低了一个数量级。Kumar等利用睡莲叶片作为模板，将PDMS覆盖在烘干的叶片表面，得到天然的微纳米结构并用热蒸镀系统将银镀在其表面，利用复合−7[106]材料优良的光学性质，通过SERS技术检测低浓度的孔雀石绿（10M）。Shiohara等通过3-氨丙基三乙氧基硅烷（APTES）对PDMS改性并将其浸泡在纳米金星溶液后制[107]备得到SERS基底，并基于PDMS良好的柔性检测水果表面的有害物质。Zhan等应用转移印花法制备具有一定图案的金银纳米结构PDMS膜作为柔性SERS基底。首先，制备聚苯乙烯纳米小球并将其装载在硅片上形成模板，然后将PDMS倾倒在模板表面固化形成具有纳米阵列的基底，再对基底改性使纳米金颗粒负载到基底上。最后通过化学方法在其表面生长银纳米颗粒，从而得到相应的SERS基底。这种方法制备的柔性SERS7基底在弯曲表面检测待测物时，增强因子可达到10，其重现性偏差小于13%。其制备8 1绪论原理图如1-4所示：图1-4图示为制备柔性低耗SERS基底的过程Fig.1-4SchematicsofthefabricationprocessforpreparingaflexiblelowcostSERSsubstrate.1.6本课题的立题意义和研究内容食源性致病菌是引起我国食物中毒事件的主要因素，严重危害人们的健康，并对经济造成极大的损失，成为现今重要的公共卫生问题之一。目前针对食源性致病菌的传统检测方法存在耗时长、操作繁琐、成本高昂等缺点。因此开发灵敏高效、快速便捷、经济节约的检测方法非常必要。适配体相较于抗体，不仅具有高特异性、高亲和性的特点，更具有良好的化学稳定性以及制备成本低等优点。SERS是一种高灵敏度的无损快速检测技术，PDMS膜是一种优良的固态支撑材料，为SERS技术提供了稳定的检测前提，使其具有广泛的应用范围以及适用于复杂检测环境的能力。本研究利用适配体功能化PDMS膜作为固态捕获基底作为识别元件，为直接检测食源性致病菌提供了可行性，并制备拉曼信号分子连接适配体修饰的纳米金作为信号分子探针作为信号转换元件，使SERS检测体系不局限于液态体系从而有着更加实用的应用范围。主要研究内容如下：1.基于适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌方法的研究。首先，利用食人鱼溶液（piranha）以及APTES对PDMS膜表面进行化学改性，并连接纳米金颗粒制备得到Au-PDMS膜。然后，利用金硫键将适配体固定在Au-PDMS膜形成捕获基底。同时，制备了拉曼信号分子4-MBA与副溶血性弧菌适配体同时修饰的纳米金颗粒作为信号分子探针。当靶标存在时，基于适配体与靶标的特异性结合，构建了“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构，从而实现对副溶血性弧菌的SERS检测。实验中对APTES制备Au-PDMS膜的时间与温度、适配体与Au-PDMS膜连接的浓度与时间、副溶血性弧菌信号分子探针制备的条件进行优化，以达到SERS效应最好最稳定的SERS基底和最佳的实验条件，建立标准曲线达到定量检测副溶血性弧菌的目的。2.基于适配体免固定法Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌方法的研究。为进一步提高检测的便捷性与效率，首先，通过PDMS前聚体还原氯金酸制备Au-PDMS膜。接着将半胱胺通过金硫键连接于Au-PDMS膜使其表面呈正电荷。然后，将信号分子探针（4-MBA通过金硫键连接适配体修饰的纳米金颗粒）通过静电吸附于膜表面。当靶标9 江南大学硕士学位论文存在时，基于适配体与靶标的特异性结合，信号分子探针与靶标特异性结合并从膜表面脱落，引起拉曼信号强度变化，从而达到便捷快速的通过SERS技术检测副溶血性弧菌的目的。实验中对半胱胺修饰Au-PDMS膜的浓度与时间、信号分子探针与Au-PDMS膜孵育的时间进行了优化，以达到SERS效应最好最稳定的SERS基底和最佳的实验条件，建立标准曲线达到定量检测副溶血性弧菌的目的。3.基于适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌方法的研究。为进一步实现多种致病菌的同时检测方法，首先，利用金硫键将两种适配体固定在上述研究制备得到Au-PDMS膜作为固态双重捕获基底。然后，制备了4-MBA、NBA分别修饰的两种信号分子探针。当靶标存在时，构建了双重“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构，从而实现双靶标同时SERS检测。实验中对Au-PDMS膜与两种适配体连接条件、鼠伤寒沙门氏菌信号分子探针制备的条件进行优化。以达到SERS效应最好最稳定的SERS基底和最佳的实验条件，建立标准曲线达到定量检测副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌的目的。10 2实验材料与方法2实验材料与方法2.1实验材料与设备2.1.1实验材料与主要试剂氯金酸（HAuCl4•4H2O）、无水乙醇（C2H5OH，质量分数≥99%，分析纯）、氯化钠（NaCl）、巯基苯甲酸（4-MBA）、二水合柠檬酸三钠（C6H5Na3O7•2H2O）、十二烷基磺酸钠（C12H25SO3Na）、浓盐酸、浓硫酸、双氧水、半胱胺盐酸盐、氯化钾、氯化钠、磷酸氢二钠、磷酸氢二钾、胰蛋白胨、酵母粉，购买自国药集团化学试剂有限公司。PDMS（SYLGARD184硅橡胶）购买自美国道康宁公司。三（2-羧乙基）膦盐酸盐（TCEP，≥98.0%）、3-氨基丙基三乙氧基硅烷碳（APTES）、尼罗蓝A（NBA）购买自西格玛奥里奇公司（中国，上海）。副溶血性弧菌VibrioparahaemolyticusATCC17802、鼠伤寒沙门氏菌SalmonellatyphimuriumATCC14028、金黄色葡萄球菌StaphylococcusaureusATCC29213、大肠杆菌EscherichiacoliATCC25922、李斯特菌ListeriamonocytogenesATCC19115和志贺痢疾杆菌ShigellaflexneriATCC12022，上述标准菌株从美国典型菌种保藏中心获得。微生物均在培养基中孵育，孵育温度为37℃，180rpm摇床。超纯水（18.2MΩ）为美国Millipore净水系统提供。虾肉购买于欧尚超市。以上试剂均为分析纯水平。由上海生工生物科技有限公司合成适配体序列：巯基化副溶血性弧菌适配体序列为：5’-SH-ATAGGAGTCACGACGACCAGAATCTAAAAATGGGCAAAGAAACAGTGACTCGTTGAGATACTTATGTGCGTCTACCTCTT[108]GACTAAT-3’。巯基化鼠伤寒沙门氏菌适配体序列为：5’-SH-AGTAATGCCCGGTAGTTATTCAAA[18]GATGAGTAGGAAAAGA-3’2.1.2主要仪器AR224CN电子天平，奥豪斯仪器（中国）有限公司；SZCL-2A数显智能控温磁力搅拌器，杭州瑞佳精密科学仪器有限公司；ShimadzuUV-2300紫外-可见光（UV-vis）分光光度计（Shimadzu，日本）；Starter3C实验室pH计，奥豪斯仪器（中国）有限公司；Centrifuge5424R台式高速冷冻离心机，德国Eppendorf公司；不锈钢高压灭菌锅，购自上海申安医疗器械厂；1300SERIESA2生物安全柜，ThermoScientrific（上海）仪器有限公司；ZQZY-70B振荡培养箱，上海知楚仪器有限公司；JEM-2100HR透射电子显微镜，200kV工作电压，日本电子公司（JEOLLtd，日本）；S-4800场发射扫描电子显微镜（HitachiLtd，日本）；电热鼓风干燥箱，上海一恒科学仪器有限公司；Direct-Q3超纯水制备仪，美国Millipore公司；拉曼测试使用共聚焦显微镜拉曼光谱仪（法国HORIBAJobinYvonS.A.S.公司.）。12mW633nm发射光源作为激发光源。拉曼光谱的数据处理均使用Labspec6.0软件。11 江南大学硕士学位论文2.2基于适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌方法的研究2.2.1检测原理首先，通过化学改性方法制备得到Au-PDMS膜。然后，将适配体通过金硫键固定在膜表面作为固态捕获基底。同时，将4-MBA通过金硫键连接适配体修饰的纳米金颗粒作为信号分子探针。当体系中加入靶标菌时，捕获基底与信号分子探针能与靶标同时特异性结合，形成“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构，当靶标菌浓度增加时-1引起拉曼强度增加，从而根据4-MBA在1592cm位移处的相对SERS强度的增加，达到定量检测目的。图2-1基于适配体功能化PDMS膜-SERS检测副溶血性弧菌原理图Fig.2-1SchematicofaptamerfunctionalizedPDMSfilm-SERSdetectionmethodsforVibrioparahaemolyticus2.2.2PDMS膜的制备将购买的PDMS试剂中的主剂：辅剂（即聚二甲基硅氧烷前聚体：固化剂）按照[109]10：1于试管中混合并用玻璃棒充分搅拌。搅拌至胶体内气泡大小均匀，并无明显大的气泡，说明PDMS的主剂与辅剂已经混合均匀。将0.285mL混合后的胶体缓缓倒入35mm的塑料培养皿中，使其完全平铺于培养皿表面，再将培养皿放入真空干燥箱中，在常温下抽真空1h，直到胶体内的气泡全部消失。然后将培养皿放入烘箱中，于70℃烘干过夜，待PDMS胶体完全凝固成型后，获得纯净的PDMS膜。切割成大小均匀的片状，储存备用。2.2.3适配体功能化PDMS膜的制备2.2.3.1纳米金颗粒制备用于实验的所有玻璃器皿通过浓盐酸与浓硝酸的体积比为3：1的王水浸泡过夜，[110]然后用超纯水冲洗并烘干。根据Ziegler等方法制备纳米金颗粒溶液。首先向三口圆底烧瓶中加入1%氯金酸水溶液0.5mL，49mL的超纯水（≥18.2MΩ），于120℃均匀搅拌，煮沸5-10min（120rpm）后再迅速加入5%柠檬酸钠0.5mL，待溶液反应生成酒红色后关闭油浴锅，静置溶液冷却到室温，得到纳米金颗粒溶液。将制备得到的纳米金12 2实验材料与方法颗粒溶液于4℃避光保存。利用透射电子显微镜（TEM）和紫外-可见吸收光谱对纳米金颗粒进行表征。2.2.3.2Au-PDMS膜的制备采用化学改性的办法制备Au-PDMS膜。具体操作步骤如下：将制备好的PDMS小片浸泡于piranha溶液（浓硫酸：双氧水=3：1）中，于40℃处理60s后立即用超纯水反复超声冲洗三遍，再用氮气吹干。将羟基化后的PDMS小片置入1.5mL离心管内，并加入5%的APTES乙醇溶液至浸没，于70℃反应3h。取出制备好的小片并用大量的[107]超纯水反复超声冲洗若干次后，用氮气干燥，得到氨基化PDMS小片。取制备好的纳米金溶液，在12000rpm转速下离心30min，去除3/4的上清液后重悬得到浓缩的纳米金溶液。将制备好的氨基化PDMS小片浸没在足量的纳米金溶液中孵育过夜后，用超纯水反复清洗干净，得到Au-PDMS膜。对制备好的Au-PDMS膜采用紫外-可见吸收光谱，扫描电子显微镜（SEM）进行表征。2.2.3.3适配体功能化PDMS膜的制备取制备好的Au-PDMS膜小片，利用无水乙醇超声清洗10min，氮气吹干。将其置入1.5mL离心管内，向离心管内加入500μL巯基化副溶血性弧菌适配体溶液（40nM），于37℃摇床180rpm孵育24h后，取出膜小片并利用无水乙醇，超纯水交替清洗数次，最终得到适配体功能化PDMS膜。对制备得到的适配体功能化PDMS膜用紫外-可见吸收光谱表征。2.2.4信号分子探针的制备4-MBA、巯基化副溶血性弧菌适配体修饰的纳米金颗粒的制备。首先，取等量的巯基化副溶血性弧菌适配体（10μM）和TCEP（1mM）混合静置0.5h，再取80μL混合后的上述溶液加入到920μL的浓缩过的纳米金溶液中，于37℃，150rpm摇床中反应12h；然后，向上述溶液中加入20μL10%SDS水溶液，于37℃，150rpm摇床，陈化12h，陈化过程中逐次加入NaCl溶液（0.5M），使反应体系中的NaCl终浓度达到0.25M，每次加入NaCl溶液后，进行超声处理10s左右。陈化结束后，于25℃，12000rpm离心30min，弃去上清，再用超纯水溶解沉淀，如此共重复两次，以去除未连接到纳米金上的适配体；最后，将0.1mL4-MBA（1mM）加入到1mL制备好的上述溶液中，于20℃摇床160rpm，反应过夜；然后，离心去除未结合的4-MBA。制备得到的信号分子探针置于4℃冰箱备用。2.2.5实验条件的优化2.2.5.1APTES制备Au-PDMS膜条件的优化本研究主要对制备Au-PDMS膜时APTES改性PDMS膜的时间以及温度进行优化。首先，APTES与PDMS膜孵育时间分别为1h，2h，3h，4h，5h，利用紫外-可见吸收光谱分别测定纳米金颗粒与改性PDMS膜孵育前后在520nm处的吸光度，根据吸光13 江南大学硕士学位论文度的变化来确定APTES改性PDMS膜的最佳孵育时间。然后，用同样的方法在APTES与PDMS膜孵育温度分别为10℃，30℃，50℃，70℃，90℃的条件下确定最佳孵育温度。以上实验均设置三次平行重复。2.2.5.2Au-PDMS膜与适配体连接条件的优化本研究主要针对Au-PDMS膜与适配体连接时适配体溶液终浓度以及孵育时间进行优化。首先，选用500μL终浓度分别为20nM，30nM，40nM，50nM，60nM，70nM，80nM的适配体溶液与Au-PDMS膜于37℃摇床180rpm孵育24h，利用紫外-可见吸收光谱对孵育前后适配体在260nm处的相对吸光度记录并确定最佳适配体终浓度。然后，用同样的方法在Au-PDMS膜与适配体孵育时间分别为0h，12h，24h，36h，48h的条件下确定最佳孵育时间。以上实验均设置三次平行重复。2.2.5.3副溶血性弧菌信号分子探针制备条件的优化本研究主要针对适配体在信号分子探针制备过程中的终浓度以及盐在陈化过程中的终浓度进行优化。首先，取活化好的适配体溶液加入到纳米金溶液中，使其在体系中的终浓度分别为100nM，200nM，300nM，400nM，500nM，于37℃，150rpm摇床中反应12h后再陈化12h，于25℃，12000rpm离心30min。利用紫外-可见吸收光谱对孵育前后适配体在260nm处的相对吸光度记录并确定最佳适配体终浓度。然后，用同样的方法在陈化过程中盐的终浓度分别为0.1M，0.15M，0.2M，0.25M，0.5M，0.75M的条件下确定最佳盐陈化终浓度。以上实验均设置三次平行重复。2.2.6副溶血性弧菌的检测用上述所构建的检测方法，在最优条件下对副溶血性弧菌进行检测。具体步骤如下：对处于对数生长期的菌液（OD600=0.3）进行梯度稀释，取100μL相应浓度梯度的菌液涂板计数，另取不同浓度的副溶血性弧菌菌液各500μL进行检测，将制备好的适配体功能化PDMS膜置于离心管内并加入500μL副溶血性弧菌溶液，于37℃置入摇床180rpm孵育1h，将适配体功能化PDMS膜取出并用PBS缓冲液清洗两遍，以去除物理吸附在膜上的菌液，再取500μL信号分子探针溶液与清洗后的适配体功能化PDMS膜孵育，于37℃，150rpm孵育1h，取出适配体功能化PDMS膜，再用PB缓冲液清洗两遍，以去除物理吸附在膜上的信号分子探针，最后对适配体功能化PDMS膜进行SERS测试，确定线性范围以及检测限。2.2.7特异性实验为了验证该方法的特异性，选取四种致病菌（金黄色葡萄球菌、鼠伤寒沙门氏菌、大肠杆菌、单增李斯特菌），在最优条件下与副溶血性弧菌同时进行检测试验。菌液浓6度都在10cfu/mL左右，操作步骤见2.2.6。2.2.8虾肉样品副溶血性弧菌的空白加标回收新鲜的虾购买于当地超市，然后用冰袋运到实验室。25g虾肉放入无菌乳钵磨碎，14 2实验材料与方法自225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1-2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，静置1h去除沉淀团聚体和悬浮物。取上清液并添加不同量的副溶血性弧菌配置的不同浓度的菌液，利用适配体功能化PDMS膜对副溶血性弧菌SERS检测方法进行检测，操作步骤见2.2.6。所得结果与传统的平板计数法进行比较并计算回收率。2.3基于适配体免固定化Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌方法的研究2.3.1检测原理首先，通过PDMS前聚体对氯金酸还原制备Au-PDMS膜。然后，将半胱胺通过金硫键连接于Au-PDMS膜使其表面呈正电荷。制备信号分子探针（4-MBA通过金硫键连接适配体修饰的纳米金颗粒）静电吸附于膜表面。当体系中加入靶标菌时，信号分子探针与靶标特异性结合并从膜表面脱落，当靶标菌浓度增加时引起拉曼强度减少，从而根-1据4-MBA在1592cm位移处的SERS强度的减少，达到定量检测目的。图2-2基于Au-PDMS膜-SERS检测副溶血性弧菌方法原理图Fig.2-2SchematicofAu-PDMSfilm-SERSdetectionmethodsforVibrioparahaemolyticus2.3.2Au-PDMS膜的制备将购买的PDMS试剂中的主剂：辅剂（即聚二甲基硅氧烷预聚物：固化剂）按照100:6的比例于试管中混合并用玻璃棒充分搅拌。搅拌至胶体内气泡大小均匀，无明显大的气泡，说明PDMS的主剂与辅剂已经混合均匀。将200μL上述混合物加入到96微孔板中，并置于真空干燥箱，常温下抽真空1h，直到胶体内的气泡全部消失，然后将微孔板放入烘箱中，于70℃烘干过夜。向制备好的PDMS微孔板内加入100μL1%氯金酸乙醇溶液，于室温下静置48h，得到Au-PDMS膜，再用乙醇清洗复合膜表面并用氮[102]气吹干备用。2.3.3信号分子探针的制备与固定信号分子探针的制备如2.2.4所述。将固定在96微孔板中的Au-PDMS膜与100μL半胱胺甲醇溶液（1.25M）孵育过夜，然后用乙醇与超纯水反复清洗。再将信号分子探针于95℃下加热8min，再冰浴8min，之后立即将100μL信号分子探针与半胱胺修饰15 江南大学硕士学位论文[96]的Au-PDMS膜于70℃下孵育1h，最后用PB缓冲液清洗未连接的信号分子探针。2.3.4实验条件的优化2.3.4.1半胱胺修饰Au-PDMS膜条件的优化本研究主要对半胱胺修饰Au-PDMS膜时的浓度以及孵育时间进行优化。首先，取100μL浓度分别为0.3125M，0.625M,1.25M，2.5M，5M的半胱胺甲醇溶液与Au-PDMS膜孵育过夜，信号分子探针于95℃下加热8min，再冰浴8min，将100μL信号分子探针与半胱胺修饰的Au-PDMS膜于70℃下孵育1h。利用拉曼光谱对-1Au-PDMS膜进行测试并记录4-MBA在1592cm位移处的拉曼强度来确定最佳孵育浓度。然后，用同样的方法在半胱胺与Au-PDMS膜孵育时间分别为0.5h，3h，6h，12h，24h的条件下确定最佳孵育时间。以上实验均设置三次平行重复。2.3.4.2信号分子探针孵育时间的优化本研究主要针对信号分子探针与半胱胺修饰的Au-PDMS膜孵育时间进行优化。首先，取信号分子探针于95℃下加热8min，再冰浴8min，将100μL信号分子探针与半胱胺修饰的Au-PDMS膜于70℃下分别孵育10min，30min，60min，90min，120min。适配体连接时适配体溶液终浓度以及孵育时间进行优化。利用拉曼光谱对Au-PDMS膜-1进行测试并记录4-MBA在1592cm位移处的拉曼强度来确定最佳孵育时间。以上实验均设置三次平行重复。2.3.5副溶血性弧菌的检测用上述所构建的检测方法，在最优条件下对副溶血性弧菌进行检测。具体步骤如下：对微孔板进行SERS测试后，向微孔板中加入副溶血性弧菌样品溶液200μL，混合均匀，于37℃静置孵育30min，再用PB缓冲液清洗微孔板去除与副溶血性弧菌特异性结合的信号分子探针，然后再次进行SERS测试，确定线性范围以及检测限。2.3.6特异性实验选择四种细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌，痢疾志贺氏菌）与副溶血性弧菌在最优条件下进行SERS测试，所有反应条件保持一致。以信号分子探针的SERS强度差值为标准，评价该检测方法对副溶血性弧菌检测的特异性。所有菌液的浓6度在10cfu/mL左右，操作步骤见2.3.5。2.3.7虾肉样品副溶血性弧菌的空白加标回收新鲜的虾购买于当地超市，然后用冰袋运到实验室。25g虾肉放入无菌乳钵磨碎，自225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1-2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，静置1h去除沉淀团聚体和悬浮物。取上清液并添加不同量的副溶血性弧菌配置的不同浓度的菌液，利用该检测方法进行检测，操作步骤见2.3.5。所得结果与传统的平板计数法进行比较并计算回收率。16 2实验材料与方法2.4基于适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌方法的研究2.4.1检测原理首先，通过化学改性方法制备得到Au-PDMS膜。然后，将副溶血性弧菌以及鼠伤寒沙门氏菌适配体通过金硫键固定在膜表面作为固态双重捕获基底。同时，将4-MBA通过金硫键连接适配体修饰的纳米金颗粒作为副溶血性弧菌信号分子探针，NBA通过吸附作用连接适配体修饰的纳米金颗粒作为鼠伤寒沙门氏菌信号分子探针。当体系中加入两种靶标菌时，捕获基底与两种信号分子探针能分别与两种靶标同时特异性结合，形成双重“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构，当靶标菌浓度增加时引起拉曼强-1-1度增加，从而根据4-MBA在1592cm位移处SERS强度的增加，NBA在592cm位移处SERS强度的增加达到同时定量检测两种致病菌的目的。图2-3适配体功能化PDMS膜-SERS同时检测两种致病菌方法原理图Fig.2-3SchematicofaptamerfunctionalizedPDMSfilm-SERSdetectionmethodsforVibrioparahaemolyticus、Salmonellatyphimurium2.4.2两种适配体功能化PDMS膜的制备Au-PDMS膜的制备如2.2.3.2所述。首先取制备好的Au-PDMS小片，利用无水乙醇超声清洗10min，氮气吹干。将其置入1.5mL离心管内，向离心管内分别加入250μL巯基化副溶血性弧菌适配体（80nM）以及巯基化鼠伤寒沙门氏菌适配体溶液（80nM），于37℃摇床180rpm孵育24h后取出膜小片，利用无水乙醇，超纯水交替清洗几次，最终得到适配体功能化PDMS膜。对制备得到的适配体功能化PDMS膜用紫外-可见吸收光谱表征。2.4.3两种信号分子探针的制备副溶血性弧菌信号分子探针的制备如2.2.4所述。鼠伤寒沙门氏菌信号分子探针的制备：首先，取等量的巯基化鼠伤寒沙门氏菌适配体（10μM）和TECP（1mM）混合17 江南大学硕士学位论文静置0.5h，再取100μL混合后的上述溶液加入到1mL的浓缩过的纳米金溶液中，于37℃置入摇床150rpm中反应12h；然后，向上述溶液中加入20μL10%SDS水溶液，于37℃置入摇床150rpm，陈化12h，陈化过程中逐次加入NaCl溶液（0.5M），使反应体系中的NaCl终浓度达到0.25M，每次加入NaCl溶液后，进行超声处理10s左右。陈化结束后，于25℃，12000rpm离心30min，弃去上清，再用超纯水溶解沉淀，如此共重复两次，以去除未连接到纳米金的适配体；最后，将45μLNBA（10μM）加入到1mL制备好的上述溶液中，于常温摇床160rpm，反应2h；然后，离心去除未结合的NBA。制备得到的鼠伤寒沙门氏菌适配体和NBA同时修饰的纳米金颗粒于4℃冰箱保存备用。2.4.4实验条件的优化2.4.4.1Au-PDMS膜与两种适配体连接条件的优化本研究主要针对Au-PDMS膜与两种适配体连接时适配体溶液终浓度进行优化。选用250μL终浓度分别为60nM，70nM，80nM，90nM，100nM的两种适配体溶液进行等比例混合与Au-PDMS膜于37℃摇床180rpm孵育24h，利用紫外-可见吸收光谱对反应前后适配体在260nm处的相对吸光度记录并确定最佳适配体终浓度。以上实验均设置三次平行重复。2.4.4.2鼠伤寒沙门氏菌信号分子探针的优化本研究主要针对鼠伤寒沙门氏菌适配体在信号分子探针制备过程中的终浓度进行优化。取活化好的适配体溶液加入到纳米金溶液中，使其在体系中的终浓度分别为200nM，300nM，400nM，500nM，600nM，于37℃，150rpm摇床中反应12h后再陈化12h，于25℃，12000rpm离心30min。利用紫外-可见吸收光谱对反应前后适配体在260nm处的相对吸光度记录并确定最佳适配体终浓度。以上实验均设置三次平行重复。2.4.5副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌的同时检测用上述所构建的检测方法，在最优条件下对副溶血性弧菌进行检测。具体步骤如下：将制备好的适配体功能化PDMS膜置入离心管中，加入副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌样品溶液各250μL，混合均匀，于37℃，150rpm摇床反应1h。将适配体功能化PDMS膜取出并用PBS缓冲液清洗两遍，以去除物理吸附在膜上的菌液，再取副溶血性弧菌信号分子探针溶液、鼠伤寒沙门氏菌信号分子探针溶液各250μL与清洗后的适配体功能化PDMS膜同时孵育，于37℃，150rpm摇床孵育1h，取出适配体功能化PDMS膜，再用PB缓冲液清洗两遍，以去除物理吸附在膜上的多余信号分子探针，最后对适配体功能化PDMS膜进行SERS测试。对处于对数生长期的副溶血性弧菌菌液（OD600=0.3）进行梯度稀释，取100μL相应浓度梯度的菌液涂板计数，另外取250μL采用上述实验方法进行检测，得到副溶血性弧菌的线性范围和检测限。对处于对数生长期的鼠伤寒沙门氏菌菌液（OD600=0.3）进行梯度稀释，取100μL相应浓度梯度的菌液涂板计数，另外取250μL采用上述实验方法进行检测，得到鼠伤寒沙门氏菌的浓度和检测限。18 2实验材料与方法2.4.6特异性实验选择四种细菌（金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、单增李斯特菌，痢疾志贺氏菌）与副溶血性弧菌，鼠伤寒沙门氏菌在最佳条件下进行SERS检测，检测条件保持一致。分-1-1别以4-MBA在1592cm位移处和NBA在592cm位移处的SERS强度作为标准，对6该方法检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌检测的特异性进行分析。菌液浓度都在10cfu/mL左右，操作步骤见2.4.5。2.4.7虾肉样品副溶血性弧菌及鼠伤寒沙门氏菌的空白加标回收新鲜的虾购买于当地超市，然后用冰袋运到实验室。25g虾肉放入无菌乳钵磨碎，自225mL3%氯化钠碱性蛋白胨水中取少量稀释液加入无菌乳钵，样品磨碎后放入500mL无菌锥形瓶，再用少量稀释液冲洗乳钵中的残留样品1-2次，洗液放入锥形瓶，最后将剩余稀释液全部放入锥形瓶，充分振荡，静置1h去除沉淀团聚体和悬浮物。取上清液并向其中加入不同量的副溶血性弧菌以及鼠伤寒沙门氏菌，制备浓度不同的菌液，利用本方法进行检测，操作步骤见2.4.5。所得结果与传统的平板计数法进行比较并计算回收率。19 3结果与讨论3结果与讨论3.1基于适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌方法的研究本方法以适配体功能化PDMS膜作为固态捕获基底。用4-MBA标记的纳米金颗粒作为信号分子探针。利用适配体特异性识别目标待测物，为特异性检测提供了基础。3.1.1纳米金颗粒的表征为验证纳米金颗粒是否制备成功，利用紫外-可见分光光度仪以及透射电子显微镜进行表征。紫外-可见光谱图如图3-1（A）所示，纳米金颗粒在520nm处有最大吸收峰。TEM结果如图3-1（B）所示，纳米金颗粒分布均一，尺寸大小在15nm左右。结果表明，纳米金颗粒的制备成功，可用于后续实验操作。AB图3-1纳米金颗粒的紫外可见-吸收光谱图（A），纳米金颗粒的透射电子显微镜（B）Fig.3-1UV-visibleabsorptionspectrumofAuNPs(A),TransmissionElectronMicroscopeofAuNPs(B)3.1.2Au-PDMS膜的表征为验证Au-PDMS膜是否制备成功，利用扫描电子显微镜以及共聚焦显微镜拉曼光谱仪进行表征。SEM结果如图3-2（A）所示，SEM电镜图显示纳米金颗粒均匀的分布在PDMS膜表面。粒径大小为13-15nm，分散性良好。拉曼光谱结果如图3-2（B）所示，单独的4-MBA溶液（d）所测得的拉曼光谱图表现为一条水平线，单独的PDMS膜（c）的拉曼光谱图几乎表现为一条水平线，4-MBA与PDMS膜（b）孵育后的拉曼光谱图也同样表现为一条水平线。而由于Au-PDMS膜表面结合了纳米金颗粒，4-MBA在Au-PDMS膜（a）上的拉曼光谱图表现出强度明显的拉曼特征峰，其中C-C的伸缩-1-1振动产生了1085cm的特征峰，苯环的伸缩振动产生了1592cm的特征峰。结果表明，纳米金颗粒成功修饰在PDMS膜表面，可用于之后的实验操作中。20 江南大学硕士学位论文AB图3-2Au-PDMS膜的扫描电镜图（A），Au-PDMS膜的SERS强度对比图（B）:4-MBA与Au-PDMS膜（a），4-MBA与PDMS膜（b），PDMS膜（c），4-MBA（d）Fig.3-2ScanningelectronmicrographoftheAu-PDMSfilm(A),ThecomparisonofSERSintensitiesobtainedfromAu-PDMSfilm(B):4-MBAwithAu-PDMSfilm(a),4-MBAwithPDMSfilm(b),PDMSfilm(c),4-MBA(d)3.1.3适配体功能化PDMS膜的表征为了验证巯基化副溶血性弧菌适配体是否成功固定于Au-PDMS膜表面，利用紫外-可见分光光度仪进行表征。紫外-可见光谱图结果如图3-3所示，与Au-PDMS膜孵育后适配体溶液在260nm处的吸光值相较于孵育前，有着明显减少。由于巯基化副溶血性弧菌适配体修饰了巯基，在缓冲液体系中活化后，能够通过金硫键与Au-PDMS膜表面的纳米金结合，从而将适配体固定在膜表面，导致了吸光度的减少，证明了巯基化副溶血性弧菌适配体与Au-PDMS膜的成功结合。图3-3适配体原液（a）和Au-PDMS膜反应后上清液（b）适配体的紫外-可见吸收光谱Fig.3-3UV-visibleabsorptionspectrumofinitialaptamerssolution(a)andsupernatantliquorafteraptamersconjugationtoAu-PDMSfilm(b)21 3结果与讨论3.1.4副溶血性弧菌信号分子探针的表征为了验证副溶血性弧菌信号分子探针的是否成功制备，利用紫外-可见吸收光谱和拉曼光谱进行表征，紫外-可见光谱图结果如图3-4（A）显示，适配体结合纳米金颗粒前，在260nm处（a）前的吸光度较强。当与纳米金颗粒孵育后，上清液的吸光度在260nm处（b）较弱，这是由于巯基化副溶血性弧菌适配体通过金硫键与纳米金颗粒结合。证明了适配体成功修饰到纳米金颗粒上并可用于后续实验；拉曼光谱结果如图3-4（B）显示，相对于4-MBA（b）和适配体修饰的纳米金颗粒（c），4-MBA与适配体修饰的纳-1-1米金颗粒孵育后（a），在1085cm和1592cm位移处出现两个特征峰，其中C-C的-1-1伸缩振动产生了1085cm的特征峰，苯环的伸缩振动产生了1592cm的特征峰。表明了4-MBA成功连接到适配体修饰的纳米金颗粒上，证明了副溶血性弧菌信号分子探针的成功制备。AB图3-4紫外-可见吸收光谱（A）以及拉曼光谱（B）对信号分子探针的表征：适配体原液（a）和与纳米金颗粒孵育后上清液（b）;4-MBA与修饰了适配体的纳米金颗粒连接后溶液（a），4-MBA（b），纳米金颗粒（c）的拉曼光谱比较Fig.3-4TheUV–visspectrum(A)andtheSERSspectra(B)ofself-assembledRamansignalmolecules：Aptamersolutionbefore(a)andafter(b)incubatingwithAuNPs;thecomparisonofSERSintensitiesobtainedfromAuNPswith4-MBAsolutionincubatedovernight(a),4-MBAsolution(b)andAuNPs(c)3.1.5实验条件的优化3.1.5.1APTES制备Au-PDMS膜条件的优化本研究主要对制备Au-PDMS膜时APTES改性PDMS膜的时间以及温度进行优化。首先，对APTES孵育时间进行优化，优化结果如图3-5（A）所示。以浸没PDMS膜前后纳米金溶液的相对吸光度作为纵坐标，在孵育前3h，相对吸光度随着孵育时间逐渐增加；当孵育时间超过3h后，相对吸光度随着孵育时间逐渐减少；当反应时间达到3h时，相对吸光度达到最大值。当反应时间较短时，APTES未有足够时间对PDMS膜进行改性，得到的相对吸光值较小；而时间过长时，可能有过量的APTES附着在PDMS膜表面影响改性效果。因此选择3h作为APTES改性的最佳时间并用于后续实验。其次，对APTES孵育温度进行优化，优化结果如图3-5（B）所示。以浸没PDMS膜前后22 江南大学硕士学位论文纳米金溶液的相对吸光度作为纵坐标，随着反应温度从10℃~70℃逐渐增加，纳米金溶液的相对吸光度逐渐增加，当反应温度超过70℃时，纳米金溶液的相对吸光度开始减少。当反应温度较低时，APTES未能达到最佳改性温度，不能很好的对PDMS膜进行改性，得到的相对吸光值较小；而反应温度较高时，可能影响APTES改性效果。因此选择70℃作为APTES改性的最佳温度并用于后续实验。AB图3-5APTES改性时间优化（A），APTES改性温度优化（B）Fig.3-5OptimizationforthetimeofAPTESmodification(A)，OptimizationforthetemperatureofAPTESmodification(B)3.1.5.2Au-PDMS膜与适配体连接条件的优化本研究主要针对Au-PDMS膜与适配体连接时适配体溶液终浓度以及孵育时间进行优化。首先，对适配体溶液终浓度进行优化，优化结果如图3-6（A）所示。利用紫外-可见吸收光谱记录与Au-PDMS膜孵育前后的适配体在260nm处的相对吸光度为纵坐标，当终浓度从20nM增加到70nM的过程中，260nm相对吸光度逐渐增加并趋于稳定，当终浓度达到40nM，相对吸光度达到最大值。这可能是随着终浓度的增加，适配体依靠金硫键连接在Au-PDMS膜表面时达到饱和状态。因此，选择适配体终浓度为40nM作为最优适配体终浓度并用于后续实验。其次，对孵育时间进行优化，优化结果如图3-6（B）所示。利用紫外-可见吸收光谱记录与Au-PDMS膜孵育前后的适配体在260nm处的相对吸光度为纵坐标，在孵育前24h，相对吸光度随着孵育时间逐渐增加；当孵育时间超过24h后，相对吸光度随着孵育时间缓慢减少；当孵育时间达到24h时，相对吸光度达到最大值。当孵育时间较短时，适配体溶液未有充足的时间与Au-PDMS膜连接，得到的相对吸光值较小；而时间过长时，由于孵育时间过久可能导致适配体溶液再次脱落。因此，选择Au-PDMS膜孵育时间为24h作为最优孵育时间并用于后续实验。23 3结果与讨论AB图3-6连接Au-PDMS膜适配体终浓度的优化（A），适配体与Au-PDMS膜孵育时间的优化（B）Fig.3-6OptimizationfortheconcentrationofaptamersmodifyingAu-PDMSfilm(A)，OptimizationforthetimeofaptamersmodifyingAu-PDMSfilm(B)3.1.5.3副溶血性弧菌信号分子探针的优化本研究主要针对适配体在信号分子探针制备过程中的终浓度以及盐在陈化过程中的终浓度进行优化。首先，对适配体溶液终浓度进行优化，优化结果如图3-7（A）所示。利用紫外-可见吸收光谱记录适配体与纳米金颗粒孵育前后在260nm处的相对吸光度作为纵坐标，随着终浓度在100nM~400nM范围逐渐增加，260nm相对吸光度逐渐增加；当终浓度达到500nM时，260nm相对吸光度略微减少；当终浓度达到400nM，相对吸光度达到最大值。这可能是由于纳米金颗粒的表面积有限，当适配体依靠金硫键连接到纳米金表面时会达到一个饱和的状态，随着适配体的终浓度继续增加，结合的适配体的量并不会再继续增加甚至可能影响连接导致相对吸光度的下降。因此，选择副溶血性弧菌适配体的终浓度为400nM作为最优适配体终浓度并用于后续实验。其次，对盐在陈化过程中的终浓度进行优化，优化结果如图3-7（B）所示。利用紫外-可见吸收光谱记录适配体与纳米金颗粒陈化过程前后在260nm处的相对吸光度作为纵坐标，随着盐陈化终浓度在0nM~0.25nM范围内逐渐增加，260nm处的相对吸光度逐渐增加；随着盐陈化终浓度在0.25M后逐渐增加，260nm处的相对吸光度逐渐减少；当盐陈化终浓度达到0.25M时，相对吸光度达到最大值。因为陈化过程中加盐的目的是保护溶液体系稳定以及促进适配体与纳米金颗粒的连接，所以当盐陈化终浓度较低时，体系中的适配体与纳米金颗粒相对来说过量，相对吸光度变化较小；而盐陈化终浓度较大时，体系中的盐相对适配体与纳米金颗粒来说过量，从而导致溶液体系的不稳定，影响适配体与纳米金颗粒的结合。因此，选择盐陈化过程中的终浓度为0.25M作为最优终浓度并用于后续实验。24 江南大学硕士学位论文AaB图3-7连接纳米金颗粒的适配体终浓度优化（A），陈化过程的盐浓度优化（B）Fig.3-7Optimizationfortheconcentrationsofaptamersinself-assembledRamansignalmolecules(A)Optimizationfortheconcentrationsofsaltinageingprocess(B)3.1.6线性范围与检测限根据设计的实验原理，当体系中存在副溶血性弧菌时，捕获基底与信号分子探针与靶标特异性结合形成“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构，通过SERS在1592-1cm位移处检测到拉曼信号。随着副溶血性弧菌浓度的增加，更多的适配体捕获到副溶血性弧菌，从而更多的信号分子探针被固定到基底上，引起拉曼强度增强。在最优的实验条件下，对不同浓度的副溶血性弧菌进行SERS检测。拉曼光谱结果如图3-8（A）所-1示，随着副溶血性弧菌浓度的增加，4-MBA在1592cm位移处的拉曼强度逐渐增加。26线性结果如图3-8（B）所示，副溶血性弧菌菌落数的对数值在1.2×10cfu/mL~1.2×10-1cfu/mL范围内与信号分子探针在1592cm位移处的相对拉曼强度呈现良好的线性关系2（y=544.68x-944.13，R=0.9948），最低检测限为12cfu/mL。25 3结果与讨论AB图3-8不同浓度副溶血性弧菌的拉曼光谱图（A）副溶血性弧菌菌落数的对数值与拉曼强度之间的线性关系（B）Fig.3-8TheSERSresponsespectraofthismethodinthepresenceofdifferentconcentrationofVibrioparahaemolyticus(A)CprrelationbetweenRamanintensityandconcentrationsofVibrioparahaemolyticus(B)3.1.7特异性实验对该检测方法进行特异性实验，选择了四种细菌（鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，单6增李斯特菌，金黄色葡萄球菌）进行特异性对照实验。为了最佳实验结果，选择10cfu/mL菌液浓度，特异性结果如图3-9所示。鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，单增李斯特菌，金-1黄色葡萄球菌在1592cm位移处拉曼强度与副溶血性弧菌相比，没有明显的拉曼特征峰。说明此方法特异性良好可适用于副溶血性弧菌，这是基于适配体有着高特异性和高亲和性的特点。图3-9本方法的特异性分析，（a）副溶血性弧菌；（b）空白；（c）鼠伤寒沙门氏菌；（d）大肠杆菌；（e）单增李斯特菌；（f）金黄色葡萄球菌Fig.3-9Thespecificityevaluationoftheproposedmethod,(a)Vibrioparahemolyticus;(b)blank;(c)Salmonellatyphimurium;(d)Escherichiacoli;(e)Listeriamonocytogenes;(f)Staphylococcusaureus26 江南大学硕士学位论文3.1.8虾肉样品中副溶血性弧菌空白加标回收将本实验所建立的适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌方法用于虾肉样品的空白加标回收实验。用此方法与传统的平板计数法分别对不同浓度的副溶血性弧菌进行检测，然后对比得到的结果，计算出回收率。结果如表3-1所示。此方法检测结果与平板培养法无明显差异（回收率在97.70%~105.3%之间），能够适用于实际样品中检测副溶血性弧菌。表3-1此方法与平板培养法对虾肉样品的空白加标回收结果对比表Table3-1RecoverytestofVibrioparahaemolyticusinthespikedprawnsamplesbythemethod.虾肉样品添加浓度(cfu/mL)检出浓度(cfu/mL)回收率33NO11.2×10(1.17±0.02)×1097.70%44NO21.2×10(1.26±0.03)×10105.3%55NO31.2×10(1.22±0.05)×10101.6%66NO41.2×10(1.21±0.12)×10100.7%3.2基于适配体免固定化Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌方法的研究本方法通过PDMS前聚体还原氯金酸制备Au-PDMS膜制备于96微孔板内并通过金硫键连接半胱胺。将信号分子探针通过静电作用吸附在膜表面，从而构建了一种简单便捷的检测副溶血性弧菌的SERS方法。3.2.1Au-PDMS膜的表征为验证Au-PDMS膜是否制备成功，利用扫描电子显微镜以及紫外-可见分光光度仪进行表征。SEM结果如图3-10（A）所示，大量的AuNPs良好的分布在PDMS膜表面，且分布均一，稳定。紫外-可见光谱图结果如图3-10（B）所示，Au-PDMS膜在533nm处有明显的最大吸收峰（a）；而单独的PDMS膜无明显吸收峰（b）；因Au-PDMS膜表面有纳米金颗粒存在，制备得到的Au-PDMS膜呈现酒红色，色泽明显，分布均匀（c）。结果表明，纳米金颗粒成功制备在PDMS膜表面，可用与之后的实验操作中。27 3结果与讨论AB图3-10Au-PDMS膜的扫描电镜图（A）；Au-PDMS膜（a）与PDMS膜（b）紫外-可见吸收光谱对比图（B），Au-PDMS膜的光学照片（c）Fig.3-10ScanningelectronmicrographoftheAu-PDMSfilm(A),ThecomparisonofUV-visibleabsorptionspectrum(B)obtainedfromAu-PDMSfilm(a)andPDMSfilm(b)ThephotoofAu-PDMSfilm(c)3.2.2副溶血性弧菌信号分子探针的表征副溶血性弧菌信号分子探针的表征同3.1.4。3.2.3实验条件的优化3.2.3.1半胱胺修饰Au-PDMS膜条件的优化本研究主要对半胱胺修饰Au-PDMS膜时的浓度以及孵育时间进行优化。首先，对半胱胺浓度的进行了优化，优化结果如图3-11（A）所示。利用拉曼光谱记录4-MBA-1在1592cm位移处的拉曼强度作为纵坐标，随着半胱胺浓度在0M~1.25M范围逐渐增-1加，4-MBA在1592cm处的拉曼强度也逐渐增加；当半胱胺浓度超过1.25M后，4-MBA-1在1592cm处的拉曼强度逐渐趋于稳定；当半胱胺浓度较低时，Au-PDMS膜表面还存在大量的纳米金未被修饰，因此拉曼强度随半胱胺的浓度增加而增加；当半胱胺浓度达到一定值时，半胱胺连接在Au-PDMS膜表面的量达到饱和状态，拉曼强度趋于稳定。因此，选择半胱胺浓度为1.25M作为最优浓度并用于后续实验。其次，对半胱胺与Au-PDMS膜孵育时间进行优化，优化结果如图3-11（B）所示。利用拉曼光谱记录4-MBA-1在1592cm位移处的拉曼强度作为纵坐标，在孵育前12h，拉曼强度随着孵育时间逐渐增加；当孵育时间超过12h后，拉曼强度趋于稳定；当孵育时间较短时，半胱胺未有充足的时间与Au-PDMS膜连接，得到的拉曼强度较小；当孵育时间达到一定值时，半胱胺连接在Au-PDMS膜表面的量达到饱和状态，拉曼强度趋于稳定。因此，选择半胱胺与Au-PDMS膜孵育时间为12h作为最优孵育时间并用于后续实验。28 江南大学硕士学位论文AB图3-11连接Au-PDMS膜半胱胺浓度的优化（A），半胱胺与Au-PDMS膜孵育时间的优化（B）Fig.3-11OptimizationfortheconcentrationofcysteaminemodifyingAu-PDMSfilm(A)，OptimizationforthetimeofcysteaminemodifyingAu-PDMSfilm(B)3.2.3.2信号分子探针孵育时间的优化本研究主要针对信号分子探针与半胱胺修饰的Au-PDMS膜孵育时间进行优化，优-1化结果如图3-12所示。利用拉曼光谱记录4-MBA在1592cm位移处的拉曼强度作为纵坐标，在孵育前60min，拉曼强度随着孵育时间逐渐增加；当孵育时间超过60min后，拉曼强度趋于稳定；当孵育时间较短时，信号分子探针未有充足的时间与Au-PDMS膜吸附，得到的拉曼强度较小；当孵育时间达到一定值时，信号分子探针吸附在Au-PDMS膜表面的量达到饱和状态，拉曼强度趋于稳定。因此，选择信号分子探针与Au-PDMS膜孵育时间为60min作为最优孵育时间并用于后续实验。图3-12适配体与Au-PDMS膜孵育时间的优化Fig.3-12OptimizationforthetimeofaptamersmodifyingAu-PDMSfilm3.2.4线性范围与检测限根据设计的实验原理，当体系中存在副溶血性弧菌时，吸附在Au-PDMS膜表面的-1信号分子探针中的适配体与靶标特异性结合并从膜表面脱落，导致4-MBA在1592cm位移处的拉曼强度减少。随着副溶血性弧菌浓度的增加，更多的信号分子探针捕获副溶29 3结果与讨论血性弧菌，从而更多的信号分子探针从膜表面脱落，引起拉曼强度减少。在最优的实验条件下，对不同浓度的副溶血性弧菌进行SERS检测。拉曼光谱结果如图3-13（A）所-1示，随着副溶血性弧菌浓度的增加，4-MBA在1592cm位移处的拉曼强度逐渐减少。26线性结果如图3-13（B）所示，副溶血性弧菌菌落数的对数值在3.3×10cfu/mL~3.3×10-1cfu/mL范围内与信号分子探针在1592cm位移处的相对拉曼强度呈现良好的线性关系2（y=650.78x-1063.2，R=0.9913），最低检测限为33cfu/mL。AB图3-13不同浓度副溶血性弧菌的拉曼光谱图（A）副溶血性弧菌菌落数的对数值与拉曼强度之间的线性关系（B）Fig.3-13TheSERSresponsespectraofthismethodinthepresenceofdifferentconcentrationofVibrioparahaemolyticus(A)CprrelationbetweenRamanintensityandconcentrationsofVibrioparahaemolyticus(B)3.2.5特异性实验对该检测方法进行特异性实验，在最优条件下选择四种细菌（鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌）同时与副溶血性弧菌进行平行对照实验。为6了最佳实验效果，选择10cfu/mL菌液浓度，特异性结果如图3-14所示。鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌的相对SERS强度与副溶血性弧菌相比极小，证明本检测方法对副溶血性弧菌具有很好的特异性，这是由于适配体有着高特异性和高亲和性的特点。30 江南大学硕士学位论文图3-14本方法的特异性分析，（a）副溶血性弧菌；（b）鼠伤寒沙门氏菌；（c）大肠杆菌；（d）单增李斯特菌；（e）金黄色葡萄球菌Fig.3-14Thespecificityevaluationoftheproposedmethod,(a)Vibrioparahemolyticus;(b)Salmonellatyphimurium;(c)Escherichiacoli;(d)Listeriamonocytogenes;(e)Staphylococcusaureus3.2.6虾肉样品中副溶血性弧菌的空白加标回收将本实验所建立的基于适配体免固定化Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌法用于虾肉样品的空白加标回收实验。用传统的平板计数法与此方法分别对不同浓度的副溶血性弧菌进行检测，进行结果对比，计算出回收率。结果如表3-2所示。此方法检测结果相较于平板培养法十分接近（回收率在95.45%~104.3%之间），表明此方法有良好的准确度，对于实际样品中副溶血性弧菌的检测有适用性。表3-2利用该方法与经典平板培养法对虾肉样品空白加标回收结果对比表Table3-2RecoverytestofVibrioparahaemolyticusinthespikedprawnsamplesbythemethod.虾肉样品添加浓度(cfu/mL)检出浓度(cfu/mL)回收率33NO13.3×10(3.36±0.25)×10101.8%44NO23.3×10(3.15±0.16)×1095.45%55NO33.3×10(3.23±0.34)×1097.88%66NO43.3×10(3.43±0.32)×10103.9%3.3基于适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌方法的研究本方法以两种适配体功能化PDMS膜作为固态捕获基底。用4-MBA、NBA分别标记适配体修饰的纳米金颗粒作为信号分子探针，建立一种基于固态基底同时检测副溶血性弧菌和鼠伤寒沙门氏菌的SERS方法。3.3.1Au-PDMS膜的表征Au-PDMS膜的表征如3.1.2所述。3.3.2两种适配体功能化PDMS膜的表征为了验证两种巯基化适配体是否成功固定于Au-PDMS膜表面，利用紫外-可见分光31 3结果与讨论光度仪进行表征。紫外-可见光谱图结果如图3-15所示，与Au-PDMS膜孵育后两种巯基化适配体混合液在260nm处的吸光值相较于孵育前，有着明显减少。由于巯基化适配体修饰了巯基，在缓冲液体系中活化后，能够通过金硫键与Au-PDMS膜表面的纳米金结合，从而将适配体固定在膜表面，导致了吸光度的减少，证明了两种巯基化适配体与Au-PDMS膜的成功结合。图3-15两种适配体混合液（a）和Au-PDMS膜反应后上清液（b）适配体的紫外-可见吸收光谱Fig.3-15UV-visibleabsorptionspectrumofinitialdouble-aptamerssolution(a)andsupernatantliquorafteraptamersconjugationtoAu-PDMSfilm(b)3.3.3两种信号分子探针适配体的表征副溶血性弧菌适配体信号分子探针的表征如3.1.4所述。为了验证双重拉曼信号分子同时检测的可行性，利用拉曼光谱进行表征，拉曼光谱如图3-16所示。与4-MBA修-1饰的纳米金颗粒的拉曼光谱相比，NBA修饰的纳米金颗粒在592cm拉曼位移处具有-1十分显著的特征峰，这是NBA带有正电的氮独有的拉曼特征峰。4-MBA在1592cm-1位移处的拉曼峰不与NBA的拉曼光谱重叠，因此将592cm位移处的SERS强度作为-1鼠伤寒沙门氏菌的识别特征峰，1592cm位移处的SERS强度作为副溶血性弧菌的识别特征峰。证明了利用双重拉曼信号分子同时检测的可行性。32 江南大学硕士学位论文图3-164-MBA、NBA修饰的纳米金颗粒的拉曼光谱图Fig.3-16Ramanscatteringspectraof4-MBA-AuNPsandNBA-AuNPs为了验证鼠伤寒沙门氏菌信号分子探针的制备是否成功，利用紫外-可见吸收光谱和拉曼光谱进行表征，紫外-可见光谱图结果如图3-17（A）所示，适配体结合纳米金颗粒前，在260nm处（a）前的吸光度较强。当与纳米金颗粒孵育后，上清液的吸光度在260nm处（b）较弱，这是由于巯基化鼠伤寒沙门氏菌适配体通过金硫键与纳米金颗粒结合。证明了适配体成功修饰到纳米金颗粒上并可用于后续实验；拉曼光谱如图3-17（B）所示，相对于NBA（b）和适配体修饰的纳米金颗粒（c），NBA与适配体修饰的纳米金-1颗粒孵育后（a），在592cm位移处出现特征峰，是由NBA中带正电的氮产生的。表明了NBA成功连接到适配体修饰的纳米金颗粒上，证明了鼠伤寒沙门氏菌信号分子探针的成功制备可用于后续实验。AB图3-17紫外-可见吸收光谱（A）以及拉曼光谱散射光谱（B）对信号分子探针的表征适配体原液（a）和与纳米金颗粒反应后上清液（b）;NBA与修饰了适配体的纳米金颗粒连接后溶液（a），NBA（b），纳米金颗粒（c）的拉曼光谱比较Fig.3-17TheUV-visspectrum(A)andtheSERSresponsespectra(B)ofself-assembledRamansignalmoleculesaptamersolutionbefore(a)andafter(b)incubatingwithAuNPs;ThecomparisonofSERSintensitiesobtainedfromAuNPswithNBAsolutionincubatedovernight(a),NBAsolution(b)andAuNPs(c)33 3结果与讨论3.3.4实验条件的优化3.3.4.1Au-PDMS膜与两种适配体连接条件的优化本研究主要针对Au-PDMS膜与两种适配体连接时适配体溶液终浓度进行优化，优化结果如图3-18所示。利用紫外-可见吸收光谱记录两种适配体混合液与纳米金颗粒孵育前后在260nm处的相对吸光度作为纵坐标，随着终浓度在60nM~80nM范围逐渐增加，260nm相对吸光度逐渐增加；当终浓度超过80nM后，260nm相对吸光度略微减少并趋于稳定；当终浓度达到80nM，相对吸光度达到最大值。这可能是随着终浓度的增加，适配体依靠金硫键连接在Au-PDMS膜表面时达到饱和状态。因此，选择两种适配体混合液终浓度为80nM作为最优适配体终浓度并用于后续实验。图3-18连接Au-PDMS膜的双重适配体溶液终浓度的优化Fig.3-18OptimizationfortheconcentrationofdoubleaptamersmodifyingAu-PDMSfilm3.3.4.2鼠伤寒沙门氏菌信号分子探针适配体的优化本研究主要针对鼠伤寒沙门氏菌适配体在信号分子探针制备过程中的终浓度进行优化，优化结果如图3-19所示。利用紫外-可见吸收光谱记录适配体与纳米金颗粒孵育前后在260nm处的相对吸光度作为纵坐标，随着终浓度在200nM~500nM范围逐渐增加，260nm相对吸光度逐渐增加；当终浓度达到600nM时，260nm相对吸光度略微增加趋于平缓；这可能是由于纳米金颗粒的表面积有限，当适配体依靠金硫键连接到纳米金表面时会达到一个饱和的状态，随着适配体的终浓度继续增加，结合的适配体的量并不会再继续增加。因此，选择鼠伤寒沙门氏菌适配体的终浓度为500nM作为最优适配体终浓度并用于后续实验。34 江南大学硕士学位论文图3-19连接纳米金颗粒的适配体终浓度优化Fig.3-19Optimizationfortheconcentrationsofaptamersinself-assembledRamansignalmolecules3.3.5线性范围与检测限根据设计的实验原理，当体系中存在两种靶标时，捕获基底与两种信号分子探针与两种靶标特异性结合形成双重“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构，通过SERS-1-1在592cm以及1592cm位移处检测到拉曼信号。随着副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌浓度的增加，更多的适配体捕获到副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌，从而更多的信号分子探针被固定到基底上，引起拉曼强度增强。在最优的实验条件下，对不同浓度的副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌进行SERS检测。拉曼光谱结果如图3-20（A）所示，随-1着副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌浓度的增加，4-MBA在1592cm位移处以及NBA-1在592cm位移处的拉曼强度逐渐增加。副溶血性弧菌线性结果如图3-20（B）所示，26副溶血性弧菌菌落数的对数值在10cfu/mL~10cfu/mL范围内与信号分子探针在1592-12cm位移处的相对拉曼强度呈现良好的线性关系（y=567.24x-485.86，R=0.9883），最低检测限为25cfu/mL。鼠伤寒沙门氏菌结果如图3-20（C）所示，鼠伤寒沙门氏菌菌落26-1数的对数值在10cfu/mL~10cfu/mL范围内与信号分子探针在592cm位移处的相对拉2曼强度呈现良好的线性关系（y=324.57x-514.03，R=0.9892），最低检测限为45cfu/mL。利用两种适配体功能化PDMS膜同时检测致病菌，其线性相较单一检测副溶血性弧菌的方案有所不足。这可能是Au-PDMS膜表面有两种适配体，产生了一定的空间位阻作用，使得结果出现了一定的误差。35 3结果与讨论ABC-1图3-20不同浓度副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌的拉曼光谱图（A）;1592cm（B）处拉曼强度-1与副溶血性弧菌对数值的拟合；592cm（C）处拉曼强度与鼠伤寒沙门氏菌对数值的拟合Fig.3-20TheSERSresponsespectraofthismethodinthepresenceofdifferentconcentrationofVibrioparahaemolyticusandSalmonellatyphimurium(A)CalibrationcurveoftherelativeSERSintensityvalue-1at1592cmversustheconcentrationofVibrioparahaemolyticus(B)Calibrationcurveoftherelative-1SERSintensityvalueat592cmversustheconcentrationofSalmonellatyphimurium(C)3.3.6特异性实验对该检测方法进行特异性实验，选择了五种致病菌（鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌，志贺痢疾杆菌）同时与副溶血性弧菌进行平行对照实6验。为了最佳实验效果，选择10cfu/mL菌液浓度。副溶血性弧菌特异性结果如图3-21所示。副溶血性弧菌与鼠伤寒沙门氏菌，大肠杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡萄球菌，-1志贺痢疾杆菌相比，1592cm位移处的有相对应的拉曼特征峰。并且鼠伤寒沙门氏菌，36 江南大学硕士学位论文-1-1在1592cm位移处无对应明显拉曼信号。1592cm位移处拉曼强度的高特异性是副溶血性弧菌与鼠伤寒沙门氏菌能完成同时检测的保证，为实验方法的可行性与适用性打下了基础。鼠伤寒沙门氏菌特异性结果如图3-22所示，大肠杆菌，单增李斯特菌，金黄色葡-1萄球菌，志贺痢疾杆菌，副溶血性弧菌这五种菌在592cm位移处没有明显拉曼信号的-1产生，而鼠伤寒沙门氏菌的拉曼信号十分明显。并且副溶血性弧菌在592cm位移处没有产生明显的拉曼特征峰。表面了该方法对同时检测副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌具有良好的特异性，这是基于适配体有着高特异性和高亲和性的特点。-1图3-211592cm拉曼位移处的拉曼峰值强度，（a）副溶血性弧菌；（b）志贺痢疾杆菌；（c）鼠伤寒沙门氏菌；（d）大肠杆菌；（e）单增李斯特菌；（f）金黄色葡萄球菌-1Fig.3-21Ramanintensityat1592cmRamanshift,(a)Vibrioparahemolyticus;(b)Shigellaflexneri;(c)Salmonellatyphimurium;(d)Escherichiacoli;(e)Listeriamonocytogenes;(f)Staphylococcusaureus-1图3-22592cm拉曼位移处的拉曼峰值强度，（a）鼠伤寒沙门氏菌；（b）志贺痢疾杆菌；（c）副溶血性弧菌；（d）大肠杆菌；（e）单增李斯特菌；（f）金黄色葡萄球菌-1Fig.3-22Ramanintensityat592cmRamanshift,(a)Vibrioparahemolyticus;(b)Shigellaflexneri;(c)Salmonellatyphimurium;(d)Escherichiacoli;(e)Listeriamonocytogenes;(f)Staphylococcusaureus37 3结果与讨论3.3.7虾肉样品中副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌的空白加标回收将本实验所建立的适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌方法用于虾肉样品的空白加标回收实验。用此方法与传统的平板培养法分别对不同浓度的副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌进行检测，然后对比得到的结果，计算出回收率。结果如表3所示。此方法检测结果与平板培养法无明显差异，副溶血性弧菌回收率在98.70%~103.8%之间，鼠伤寒沙门氏菌回收率在97.52%~106.9%之间，能够适用于实际样品中同时检测副溶血性弧菌、鼠伤寒沙门氏菌。表3-3利用此方法与经典平板培养法对虾肉样品空白加标回收结果对比表Table3-3RecoverytestofVibrioparahaemolyticusandSalmonellatyphimuriuminthespikedprawnsamplesbythemethod.添加浓度(cfu/mL)检出浓度(cfu/mL)回收率虾肉样品副溶鼠伤寒副溶鼠伤寒副溶鼠伤寒3333NO12.5×104.5×10(2.47±0.33)×10(4.42±0.18)×1098.70%98.33%4444NO22.5×104.5×10(2.60±0.82)×10(4.38±0.25)×10103.8%97.52%5555NO32.5×104.5×10(2.53±0.47)×10(4.81±0.49)×10101.3%106.9%6666NO42.5×104.5×10(2.48±0.38)×10(4.75±0.25)×1099.12%105.6%38 主要结论与展望主要结论与展望主要结论本研究利用适配体功能化PDMS膜作为固态基底，成功构建了基于适配体功能化PDMS膜-SERS检测食源性致病菌的方法。首先通过化学改性以及直接还原法制备了Au-PDMS膜与作为固态基底。接着以适配体作为识别探针，以4-MBA、NBA作为拉曼信号分子，成功制备两种致病菌的信号分子探针，构建了三种基于固态基底的高特异性、经济便捷、灵敏度好的检测方法，为食源性致病菌现场快速检测提供了新的想法和思路，主要研究结果如下：1.构建了一种基于适配体功能化PDMS膜“夹心式”检测副溶血性弧菌的方法。首先制备适配体功能化PDMS膜形成捕获基底，然后制备副溶血性弧菌信号分子探针。通过适配体与靶标的特异性结合形成“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构。该方法-1灵敏度高，特异性好，以4-MBA在1592cm位移处的拉曼强度为纵坐标，副溶血性弧菌菌落数对数值为横坐标进行线性拟合，呈现良好的线性关系（y=544.68x-944.13，2R=0.9948），最低检测限为12cfu/mL。用该方法对实际虾肉样品进行检测，结果与平板计数法检测的结果相比无显著差异，表明该方法可以应用于实际样品检测。2.构建了一种基于适配体免固定化Au-PDMS膜检测副溶血性弧菌的方法。首先制备了Au-PDMS膜并用半胱胺修饰作为捕获基底，然后制备副溶血性弧菌信号分子探针静电吸附在其表面。通过适配体与靶标的特异性结合使信号分子探针脱落形成信号差达到-1检测目的。该方法操作便捷，耗时短，以4-MBA在1592cm位移处的相对拉曼强度为纵坐标，副溶血性弧菌菌落数对数值为横坐标进行线性拟合，呈现良好的线性关系（y2=650.78x-1063.2，R=0.9913），最低检测限为33cfu/mL。用该方法对实际虾肉样品进行检测，结果与平板计数法检测的结果相比无显著差异，表明该方法可以应用于实际样品检测。3.构建了一种基于适配体功能化PDMS膜同时检测两种致病菌的方法。首先制备两种适配体功能化PDMS膜形成捕获基底，然后制备两种靶标的信号分子探针。通过适配体与靶标的特异性结合形成双重“捕获基底-靶标-信号分子探针”的夹心结构。该方法灵-1敏度高，特异性好，以4-MBA在1592cm位移处的拉曼强度为纵坐标，副溶血性弧2菌菌落数对数值为横坐标进行线性拟合，呈现良好的线性关系（y=567.24x-485.86，R=-10.9883），最低检测限为25cfu/mL以NBA在592cm位移处的拉曼强度为纵坐标，鼠伤寒沙门氏菌菌落数对数值为横坐标进行线性拟合，呈现良好的线性关系（y=324.572x-514.03，R=0.9892），最低检测限为45cfu/mL。展望本文利用适配体功能化PDMS膜作为固态支撑材料，成功构建了基于适配体功能化PDMS膜-SERS检测食源性致病菌的方法。该方法具有高灵敏度、高特异性、操作便捷39 主要结论与展望等特点。但由于研究时间问题，本工作还有待进一步完善和深入研究：1.PDMS膜的制备方法较为粗糙，批量样品合成稳定性不高，对于食源性致病菌实际快速检测应用还有一定局限性。后续可尝试寻找新方法大批量，精确可控的进行功能化PDMS膜的制备。2.近年来，随着纳米技术的不断发展，各类纳米材料合成以及应用机制逐步成熟，可将本方法制备的Au-PDMS膜推广至其他纳米材料如纳米银、纳米金棒、纳米金银合金等，制备出新的PDMS-纳米材料复合物，提高SERS检测灵敏度应用于食源性致病菌的检测，从而更好的保障我国的食品安全。40 致谢致谢时光如梭，还记得三年前的一个早上，我在食品学院侧门准备自我介绍来回踱步，忐忑的等待复试。三年后的另一个早上，我在同样的位置，身穿学士服，不舍的等待毕业合照。江大的三年研究生生涯，从疑惑到坚定，从痛苦到坚持，从失落到坚强，一路走完，是坚实的脚步。首先衷心感谢我的导师王周平教授，王老师在学业上的无私指导使我受益匪浅，严谨的专业态度以及随和的行事风格使我十分庆幸能作为王老师的学生。王老师为我指出了课题选择的方向。研究中碰到实际问题难以解决，王老师总是为我指出解决思路与方向，鞭策我继续努力。王老师在学业上以身作则，经常与我们分享查阅文献的经验，并指导我们如何进行高效的阅读。我会一直记得王老师亲自为我们修改论文至深夜，拖着疲惫的身影离开食品学院。其次我还要非常感谢一直以来指导我实验的段诺副教授，从最初的实验原理到文献调研再到具体实验的展开，段老师一直给予我最悉心的指导。无论我遇到什么难题，段老师总是及时与我探讨、把自己所学倾囊相授。在撰写论文时，段老师也在百忙中抽出时间教导我们写作方法与技巧，特别是对逻辑思维方法的锻炼使我提高了很多。除了学业上的悉心指导，段老师在生活上也给予了我很大的帮助，让我知道了不同阶段对待研究生生活的态度与方式。除此之外，还要感谢组里的吴世嘉老师、马小媛老师、乐琳老师和夏雨老师对我的指导和帮助。感谢国重陆可钰老师，平台陈晨老师，化工朱海燕老师对我的实验提供帮助和支持。感谢实验室的师兄师姐师弟师妹们，多亏大家的帮助和指点，才使得我能够顺利完成很多实验研究。感谢与我一届的实验室小伙伴们，曾经的室友马鹏飞师兄，认真负责的孙新，优秀积极的刘丽红，端庄斯文的韦丽婷，老王的“四大护法”房佩佩、贺莉莉、徐绪敏、赵旭，新加入的两位小伙伴邵宝仪、吕艳。多亏了大家在实验室生活中的相互扶持与帮助，我们才能顺利毕业。愿各位前程似锦，不负美好年华。特别感谢邹颖同学三年来对我的巨大帮助，与我一起探讨实验问题，指导我仪器的使用，悉心修改我的论文。祝你初心不忘，事业有成。最后要特别感谢我的父母，一如既往的支持我的每一个选择，给予我充分的理解与信任，教会了我很多很多。千言万语也不能表达我对你们的感情，汇成一句话：愿你们身体健康，不徒添烦恼。人生白驹过隙，只有行动才能表达。沈默斐2018年6月8日于江南大学41 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