羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究

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分类海军军医大学密级硕士学位论文羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究ＡｍｎｉｏｔｉｃＭｅｍｂｒａｎｅＥｐｉｔｈｅｌｉａｌＣｅｌｌｓＰｒｏｍｏｔｅｓＷｏｕｎｄＨｅａｌｉｎｉｎＤｉａｂｅｔｅｓａｎｄＩｔｓＰｒｅｌｉｍｉｎａｒＭｅｃｈａｎｉｓｍｇｙ研究生姓名：郑仕清学号：２０１５１１４３指导教师：肖仕初教授长海医院学科、专业：外科学（烧伤外科）学位类型：学术学位培养单位：２０１长海医院＇二〇一八年五月、 海军军医大学硕士学位论文羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究AmnioticMembraneEpithelialCellsPromotesWoundHealinginDiabetesandItsPreliminaryMechanism研究生姓名：郑仕清导师：肖仕初教授专业：外科学（烧伤外科）培养单位：长海医院二〇一八年五月 独创性声明本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果一。与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。本人承担本声明的法律责任。学位论文作者签名：日期年（月ｉＯ日学位论文版权使用授权声明本人完全了解海军军医大学有关保留、使用学位论文的规定，海军军医大学有权倮留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权海军军医大学可以将学位论文全文或部分内容编入《中国学位论文全文数据库》、《中国优秀博硕士学位论文全文数据库》等数据库进行检索。可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。（保密的学位论文在解密后适用本授权书）学位论文作者签名：仅导师签名：日期：別客年Ｙ月＾日日期：只丨客年ｏｒ月＞日 目录摘要...................................................-1-ABSTRACT.................................................-4-缩略词表.................................................-8-前言...................................................-9-第一部分：人羊膜上皮细胞体外分离培养鉴定及生物学特性检测-11-一、前言..........................................-11-二、材料与方法....................................-11-三、实验结果......................................-17-四、讨论..........................................-20-第二部分：羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合研究............-22-一、前言..........................................-22-二、材料与方法....................................-22-三、结果..........................................-28-四、讨论..........................................-31- 第三部分：羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合机制的初步探讨..-34-一、前言..........................................-34-二、材料与方法....................................-34-三、结果..........................................-38-四、讨论..........................................-41-全文总结................................................-44-综述：人羊膜上皮细胞在组织修复中的......................-45-应用及进展..............................................-45-参考文献................................................-52-在读期间论文发表及获奖情况..............................-60-致谢..................................................-61- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究摘要在过去的三十年中，糖尿病在全世界范围内已成为一种新型“流行病”，目前我国的糖尿病患者已超过1亿，居全球第一位。对于糖尿病患者而言，任何创面均有可能发展形成严重感染的慢性创面，甚至造成截肢，严重影响愈合及患者生存质量。在控制血糖的前提下，对于创面彻底清创、避免感染，促进创面愈合是糖尿病创面主要的治疗方式。但是传统方法存在治疗时间长、次数多、复发率高的问题，临床对于新型有效的治疗方法需求极大。羊膜位于胎盘最内层，厚度约为8-12um，不含神经及血管。研究表明羊膜具有促进细胞迁移及扩增、免疫源性低、减轻炎症、含有大量的生长因子和细胞因子等特点。自1910年羊膜首次作为敷料用以创面治疗以来，随着保存技术的发展，使羊膜在眼科疾病、烧伤救治、整形修复、口腔疾病及神经外科等领域都有广泛的应用。羊膜上皮层是由单层立方上皮细胞构成，称之为羊膜上皮细胞。多项研究表明，人羊膜上皮细胞表达多种干细胞标志物，并具有向三个胚层分化的能力，而且能够分泌多种生长因子。同时因其来源广泛和便于分离，无免疫源性和致瘤性，使羊膜上皮细胞成为移植和再生医学潜在的细胞来源。羊膜上皮细胞在组织修复中的应用已有诸多报道，目前羊膜上皮细胞已在肝、神经、肺、心肌甚至肿瘤治疗中都有一定的优势，但是尚少有羊膜上皮细胞应用于糖尿病创面的研究。因此在本课题中，我们通过提取培养羊膜上皮细胞，应用于糖尿病创面中以观察其对于创面愈合的作用并对其机制进行初步探索。第一部分人羊膜上皮细胞体外分离培养鉴定及生物学特性检测目的：分离培养人原代羊膜上皮细胞并检测鉴定。方法：收集剖宫产胎盘分离羊膜，通过酶消化法提取羊膜上皮细胞体外培养。流式细胞计数检测羊膜上皮细胞表型，免疫荧光法及RT-PCR法检测羊膜上皮细胞干性标志物，最后对其进行三胚层诱导检测其分化潜能。结果：体外人羊膜上皮细胞镜下观察可见细胞成鹅卵石样成团生长，核圆，居中，细胞呈多边形，边界清楚，轮廓分明。通过流式细胞仪检测显示培养细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，但是不表达CD45、CD34。通过免疫荧光检测发现，羊膜上皮细胞表达SSEA-3、SSEA-4、OCT4。RT-PCR结果显示羊膜上皮细胞表达OCT-4、Sox-2、NANOG等干性基因。诱导分化实验证明羊膜上皮细胞具有向三胚层分化潜能。结论：采用酶消化法成功分离培养羊膜上皮细胞，其可以表达多种干细胞标志物，并能够向三胚层分化，在组织修复中具有很大的潜力。-1- 海军军医大学硕士学位论文第二部分羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合作用的研究目的：研究羊膜上皮细胞对于糖尿病创面愈合的作用。方法：将原代提取的羊膜上皮细胞局部注射糖尿病创面，观察创面愈合情况。收集创面标本行病理学以观察创面愈合情况；行CD31免疫组化检测创面血管化；行CD68、iNOS、CD206免疫荧光检测巨噬细胞极化；行促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和促进愈合因子（VEGF、TGF-β1、IGF-1）的ELISA检测炎症反应的改变。通过标记羊膜上皮细胞，观察羊膜上皮细胞在创面的转归情况。结果：（1）与空白组相比，羊膜上皮细胞组在创面第10、14天创面愈合率明显升高（P＜0.01）。（2）通过病理检测显示创面第10天羊膜上皮细胞组新生肉芽组织厚度较PBS组明显增加（P＜0.01）；CD31免疫组化显示创面羊膜上皮细胞组创面新生毛细血管密度较PBS组明显增多（P<0.01）；羊膜上皮细胞组创面M1型巨噬细胞密度明显低于PBS组（P＜0.01），M2型巨噬细胞密度明显增对高（P＜0.05），M1/M2比例也明显降低（P＜0.01）；羊膜上皮细胞组创面组织中VEGF、TGF-β1、IGF-1的表达量明显高于PBS组的表达量（P＜0.01），而IL-1β、IL-6、TNF-α表达量明显较空白组低（P＜0.01）。（3）羊膜上皮细胞植入创面第5天，可观察到创面有大量羊膜上皮细胞存活；在创面第10天，可观察到创面少量羊膜上皮细胞存活。结论：羊膜上皮细胞通过调控巨噬细胞极化、减轻创面炎症反应、促进创面血管新生以促进糖尿病创面愈合；同时其在创面存留时间较短，旁分泌作用可能在促进糖尿病创面愈合过程中起主要作用。第三部分羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合机制的初步探讨目的：探索羊膜上皮细胞对于糖尿病创面愈合作用的机制方法：（1）体外分离培养巨噬细胞，通过IFN-γ、TNF-α刺激模拟创面M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化情况，观察羊膜上皮细胞条件培养基对于巨噬细胞极化的作用，同时收集细胞行RT-PCR检测其基因表达，实验分组为：含10%胎牛血清的DMEM培养基+IFN-γTNF-α阳性对照组，含10%胎牛血清的DMEM培养基+羊膜上皮细胞条件培养基+IFN-γTNF-α组，含10%胎牛血清的DMEM培养基空白对照组。（2）体外培养人脐静脉内皮细胞，通过CCK-8试剂盒、Transwell小室以及成管试验来观察羊膜上皮细胞条件培养对于人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力的影响，实验设计分为3组：含10%胎牛血清的DMEM培养基阳性对照组，羊膜上皮细胞条件培养基组，高糖DMEM阴性对照组。结果：（1）应用羊膜上皮细胞条件培养基对于TNF-α和IFN-γ刺激的巨噬细胞可以减少细胞周围的细短树突状突起；羊膜上皮细胞条件培养基处理组巨噬细胞-2- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究CD206（M2型巨噬细胞标志物）的表达量较空白对照组（P＜0.01）和阳性对照组明显升高（P＜0.01）；而iNOS（M1型巨噬细胞标志物）的表达量较空白组（P＜0.05）和阳性对照组明显降低（P＜0.01）。（2）CCK-8试剂盒检测人脐静脉内皮细胞的增殖活性显示，应用羊膜上皮细胞条件培养基处理组较阴性对照组能够明显促进人脐静脉内皮细胞的增殖（P＜0.01）；Transwell小室检测迁移能力结果表明羊膜上皮细胞条件培养基处理组细胞个数较阴性对照组明显增多（P＜0.01）；通过成管实验检测细胞成管能力，结果显示羊膜上皮细胞条件培养基处理组成管个数较阴性对照组明显增多（P＜0.01）。结论：羊膜上皮细胞可以明显提高人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力，还可以逆转巨噬细胞向M1型转化，同时可以促进M1型巨噬细胞向M2型细胞转化，并以此促进糖尿病创面的愈合。关键词：人羊膜上皮细胞，糖尿病，创面愈合，巨噬细胞，血管化-3- 海军军医大学硕士学位论文AbstractInthepastthirtyyears,diabeteshasgraduallybecomeanepidemicthroughouttheworld.Therearemorethan100milliondiabeticpatientsinChina,rankingthefirstovertheworld.Diabeticpatientsmayexperienceskindamageduringtheirlifetime,andmostwillturntochronic.Thereisnospecialeffectivemethodforthetreatmentofdiabeticwoundscurrently.Underthepremiseofcontrollingbloodglucose,themaintreatmentsfordiabeticwoundsincludethoroughlydebridementofthewound,protectionfrominfection,promotionofwoundhealingandetiologicaltreatment.Duetotheexistenceoftreatmentforalongtime,thefrequencyofrecurrencerateishigh,theclinicaldemandforanewandeffectivetreatmentgreatly.Amnioticmembraneisalayerwithathicknessofabout8-12uminthemostinnerlayeroftheplacenta,withoutnervesandbloodvessels.Theamnioticmembraneiscomposedoftheepitheliallayerandconnectivetissueouterlayer.Theepitheliallayerisconnectedtotheamnioticfluid,andconnectivetissueouterlayerisconnectedtothechorionicmembrane.Theamnioticmembranewasfirstlyusedasadressingforthetreatmentofwoundsurfacein1910.Sincethen,withthecharacteristicsofcellmigrationandproliferationability,lowimmunogenicity,relieveofwoundpainbyreducinginflammationandscartissues,thecontainingofmanygrowthfactorsandcytokines,ithasbeenwidelyusedinclinical.Withthedevelopmentofamnioticmembranepreservationtechnology,amnioticmembranehasalsobeenwidelyappliedinophthalmicdiseases,burntreatment,plasticrepair,oraldiseasesandneurosurgery.Theamnioticepitheliallayeriscomposedofmonolayerhomogeneouscubicepithelialcells,whichiscalledamnioticepithelialcells.Multiplestudieshaveshownthathumanamnioticepithelialcellsexpressstemcellmarkersandalsohavetheabilitytodifferentiateintoallthreeembryonicgermlayers,capableofsecretingavarietyofgrowthfactors.Meanwhile,withtheadvantagesofwidesource,convenientseparation,noimmunogenicandtumorigenicity,amnioticepithelialcellshavebecomeapotentiallyusefulandnon-controversialcellsourcefortransplantationandregenerativemedicine.Theapplicationofamnioticepithelialcellsintissuerepairhasbeenwidelyreported.Nowadays,amnioticepithelialcellsexhibitacertainadvantageinthetreatmentofliver,nerve,lung,myocardiumandeventumor.However,fewresearcheshaveexploredtheroleofamnioticepithelialcellsindiabeticwounds.Therefore,weaimtoextractand-4- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究cultureamnioticepithelialcellsandapplythemtodiabeticwoundssoastoobserveitseffectonwoundhealing,andtoexploreitsmechanism.PartⅠ:IsolationandIdentificationofHumanAmnioticEpithelialCellsinVitroandDetectionofBiologicalCharacteristicsObjective:Isolationandcultureofhumanprimaryamnioticepithelialcellsandidentification.Methods:Amnioticmembraneswerecollectedfromcesareansectionplacentaandamnioticepithelialcellswereextractedbyenzymaticdigestion.Thephenotypesofamnioticepithelialcellsweredetectedbyflowcytometry.Meanwhile,immunofluorescenceandRT-PCRwereusedtodetecttheantigenofamnioticmembraneepithelialcells.Finally,thedifferentiationpotentialoftheamnioticepithelialcellswasdetectedbythreegermlayer.Results:Invitrohumanamnioticepithelialcellsmicroscopicallyobservedcellsintopebble-likegrowth,nuclearround,centered,cellswerepolygons,clearboundary,clearoutline.FlowcytometryshowedthatculturedcellshighlyexpressedCD29,CD44,CD73,CD90,CD105,butdidnotexpressCD45,CD34.ImmunofluorescenceshowedthatamnionepithelialcellshighlyexpressedSSEA-3,SSEA-4andOCT4.RT-PCRresultsshowedthatamnionepithelialcellsexpressedgenessuchasOCT4,Sox-2andNANOG.Inductionofdifferentiationexperimentsdemonstratedthatamnioticepithelialcellsdifferentiateintothreegermlayers.Conclusion:Successfulisolationandcultureofamnioticepithelialcells,whichcanexpressavarietyofstemcellmarkers,andcandifferentiateintothethreegermlayers,hasgreatpotentialintissuerepair.PartII:StudyonamnioticepithelialcellspromotethehealingofdiabeticwoundsObjective:Tostudytheeffectofamnioticepithelialcellsondiabeticwoundhealing.Methods:Theprimaryculturedamnioticepithelialcellswereinjectedlocallywithdiabeticwoundstoobservewoundhealing.Inordertoevaluatethewoundvascularization,macrophagepolarizationanddegreeofinflammatoryresponse.Thewoundspecimenswerecollectedforpathology,immunohistochemistryandthedetectionofIL-1β,IL-6andTNF-αandthepromotionofhealingfactors(IGF-1,IGF-1,VEGF)conditionbyELISA,Results:(1)ComparedwithPBSgroup,woundhealingrateofamnioticepithelial-5- 海军军医大学硕士学位论文cellgroupwassignificantlyincreasedonthe10thand14thpostoperativedays(P<0.01).(2)Pathologicalexaminationshowedthatthethicknessofnascentgranulationtissueinamnioticepithelialcellgrouponday10wassignificantlyincreasedcomparedwithPBSgroup(P<0.01).CD31immunohistochemistryshowedthatthedensityofnascentcapillariesinthewoundsurfaceofamnioticepithelialcellgroupwassignificantlyhigherthanthatinPBSgroup(P<0.01).ThedensityofM1macrophagesinamnioticepithelialcellgroupwassignificantlylowerthanthatinPBSgroup(P<0.01).ThedensityofM2macrophageswashigher(P<0.05)andtheratioofM1/M2wasalsosignificantlylower(P<0.01).TheexpressionofVEGF,TGF-β1andIGF-1inamnioticepithelialcellgroupwassignificantlyhigherthanthatinPBSgroup,whiletheexpressionofIL-1β,IL-6andTNF-αwassignificantlylowerthanthoseinPBS.(3)Amnioticepithelialcellswereimplantedintowoundsonday5,andalargenumberofamnioticepithelialcellscouldbeobservedonthewoundsurface.Onthe10thdayofwounding,asmallamountofamnioticepithelialcellscouldbeobservedinthewoundsurface.Conclusion:Amnioticepithelialcellspromotehealingofdiabeticwoundsbyregulatingmacrophagepolarization,reducingwoundinflammatoryresponse,andpromotingwoundangiogenesis;Amnioticepithelialcellsremainonthewoundforashortperiodoftime,andtheirparacrineeffectsmayplayamajorroleinpromotingwoundhealingindiabeticpatients.PartIII:StudyonthemechanismofamnioticepithelialcellstopromotethehealingofdiabeticwoundObjective:ApreliminarystudyonthemechanismofamnioticepithelialcellspromotingwoundhealingindiabeticpatientsMethods:(1)Themacrophageswereisolatedandculturedinvitro.TheeffectsofconditionedmediumofamnioticepithelialcellsonthepolarizationofmacrophageswereobservedbystimulationwithIFN-γandTNF-α.CellswerecollectedforRT-PCRdetectionofthegeneexpression.Wedesignedthreegroups:10%fetalbovineserumDMEMmedium+IFN-γandTNF-αpositivecontrolgroup,amnioticepithelialcellconditionedmedium+IFN-γandTNF-αgroup,withoutIFN-γandTNF-αblankcontrolgroup.(2)Humanumbilicalveinendothelialcellswereculturedinvitro.Theeffectsofamnioticepithelialcellcultureontheproliferation,migrationandtubeformationofhumanumbilicalveinendothelialcellswereobservedbyCCK-8kit,Transwellchamberandtubeformationtest.Wedesignedthreegroups:10%fetalbovineserumDMEM-6- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究mediumpositivecontrolgroup,amnioticepithelialcellconditionedmediumgroup，DMEMwithoutIFN-γandTNF-αastheblankcontrolgroup.Results:(1)ApplicationofamnioticepithelialcellsculturedforTNF-αandIFN-γstimulatedmacrophagescanreducefinedendriticprotrusionsaroundcells.MacrophagesinamnioticepithelialcellcultureconditionsgroupshowedthattheexpressionofCD206（M2groupmacrophagesmarker）wassignificantlyhigherthanthatinthecontrolgroup(P＜0.01)andpositivecontrolgroup(P＜0.01);andtheexpressionofiNOS(M1groupmacrophagemarkerwassignificantlylowerthanthatinthecontrolgroup(P＜0.05)andpositivecontrolgroup(P＜0.01).(2)CCK-8kitdetectionofhumanumbilicalveinendothelialcellproliferationactivity,theapplicationofamnioticepithelialconditionedmediumtreatmentgroupcansignificantlypromotetheproliferationofhumanumbilicalveinendothelialcellsthanthenegativecontrolgroup(P<0.01).TheresultsofTranswellassayshowedthatthenumberofcellsintheconditionedmediumofamnioticepithelialcellsincreasedsignificantlycomparedwiththenegativecontrolgroup(P<0.01).Theresultsoftubeformationassayshowedthatthenumberoftubesinconditionedmediumofamnioticepithelialcellsincreasedsignificantlycomparedwiththatinthenegativecontrolgroup(P<0.01).Conclusion:Amnioticepithelialcellscansignificantlyincreasetheproliferation,migrationandtubeformationofhumanumbilicalveinendothelialcells.ItcanalsoreversetheconversionofmacrophagestoM1andpromotethetransformationofM1macrophagesintoM2,andthuspromotethediabeticwoundshealing.KEYWORDS：Humanamnioticepithelialcells,Diabetes,Woundhealing,Macrophages,Vascularization-7- 海军军医大学硕士学位论文缩略词表英文缩写英文全称中文译名MHCmajorhistocompatibilitycomplex主要组织相容性复合体DMEMDulbecco’smodifiedEagle’smediumDMEM培养基bFGFbasicfibroblastgrowthfactor碱性成纤维细胞生长因子SSEAstage-specificembryonicantigen阶段特异表达的胚胎抗原OCToctamer-bindingtranscriptionfactor4八聚体结合转录因子PBSphosphatebufferedsolution磷酸盐缓冲液iNOSinduciblenitricoxidesynthase诱导型一氧化氮合酶DAPI4',6-diamidino-2-phenylindole4',6-二脒基-2-苯基吲哚ILinterleukin白细胞介素VEGFvascularendothelialgrowthfactor血管内皮生长因子HEHematoxylinandeosin苏木素和伊红TGFtransforminggrowthfactor转化生长因子IGFinsulin-likegrowthfactor胰岛素样生长因子RT-PCRQuantitativereal-timepolymerasechain实时荧光定量聚合酶链式reaction反应mRNAMessengerRNA信使RNAcDNAcomplementaryDNA互补脱氧核糖核酸CDClusterofdifferentiation（抗原）分化群HLAhumanleukocyteantigen人类白细胞抗原Hpfhigh-powerfield高倍镜视野IFNInterferon干扰素M-CSFmacrophagecolony-stimulatingfactor巨噬细胞集落刺激因子ECMEndothelialCellMedium内皮细胞培养基-8- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究前言糖尿病是一个世界性的健康问题，其被世界卫生组织认定为20世纪的流行病之一[1]。据国际糖尿病联合会统计，全球约有4.15亿成年人患有糖尿病，到2040年预计将增加到6.42亿[2]。目前我国糖尿病病人已超1亿，居世界首位[3]。对于糖尿病患者而言，任何小的创面均有可能形成严重感染的慢性创面，甚至造成截肢或者死亡[4]。糖尿病慢性溃疡多见于下肢，特别是足部[5]。糖尿病足部慢性溃疡在糖尿病人中发病率约为15%，且14-24％的足部溃疡病人需要下肢截肢，而截肢患者的5年死亡率接近50-59％[6]。目前对于糖尿病慢性创面没有特别有效的方法，在控制血糖的前提下，对于创面彻底清创、避免感染，促进创面愈合，同时辅以病因治疗的治疗方法是其主要的治疗方式[7]。但是传统的治疗方法存在着治疗时间长、次数多、复发率高的问题，给患者造成巨大的痛苦，对于公共医疗资源也是巨大的负担[8]。探索糖尿病创面形成机制，促进创面快速愈合，降低糖尿病创面复发率成为目前临床治疗的当务之急。羊膜位于胎盘最内层，由上皮层、基底膜层，致密层，间充质细胞层和海绵层构成。羊膜应用于医疗已有100多年的历史[9]，随着保存技术的提高，目前羊膜已经在眼科疾病[10]、烧伤救治[11-13]、整形修复[14]、口腔疾病[15]及神经外科[16]等领域都有广泛的应用。羊膜上皮细胞位于羊膜上皮层，其能够表达多种胚胎干细胞标志物[17]，同时可以向三胚层分化[18]，能够分泌多种生长因子[19]，使其在组织修复中有一定的潜能。同时由于羊膜上皮细胞不表达MHCII类抗原等免疫源性标志物[20]，使其具有极低的免疫源性；羊膜上皮细胞自身缺少端粒酶使其在不能无限增殖，使其无致瘤性[17]。因其具有众多优势，羊膜上皮细胞在组织修复中有着巨大的潜能。糖尿病创面的治疗方式众多，干细胞移植用以糖尿病创面已有一些报道，Hou等应用骨髓间充质干细胞治疗糖尿病创面证明其可以明显促进创面愈合并加速创面血管化[21]，Maharlooei等也应用脂肪间充质干细胞治疗糖尿病创面获得相同的结果[22]，同时也有应用间充质干细胞治疗糖尿病足部溃疡及下肢静脉性型溃疡的临床研究报道[23]。目前主要应用的还是以骨髓及脂肪间充质干细胞为主，但是骨髓来源间充质干细胞提取过程中存在对于供体损伤以及细胞得率低的问题，而脂肪来源的间充质干细胞也存在提取复杂以及致瘤性的问题[23]。羊膜上皮细胞在组织修复中的作用已有诸多报道，羊膜上皮细胞在肝肺纤维化，神经、心肌损伤，胰腺功能修复甚至肿瘤治疗都有应用[24]。目前对于羊膜上皮细胞在组织中修复的研究发现，其可以通过调节巨噬细胞及炎症反应发挥其免疫调节作用。不仅如此，羊膜上皮细胞还可以通过旁分泌作用调控创面环境以促进组织修复。鉴于目前少有羊膜上皮细胞对于-9- 海军军医大学硕士学位论文糖尿病创面作用的研究，在本研究中，我们通过提取培养人羊膜上皮细胞，并应用于糖尿病创面中以观察其对于创面愈合的作用并对其机制进行初步探索。-10- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究第一部分：人羊膜上皮细胞体外分离培养鉴定及生物学特性检测一、前言羊膜是胎盘最内层的一层薄膜，不含神经及血管。羊膜由上皮层与结缔组织外层构成，上皮层与羊水相接，结缔组织外层与绒毛膜相连。羊膜上皮细胞是一层位于羊膜上皮层的单层柱状上皮细胞，其具有来源广泛、临床获取容易、无免疫源性、无致瘤性等特点。羊膜上皮细胞可以表达多种胚胎干细胞表面标志物，同时可以向三个胚层分化。由于羊膜上皮细胞具有以上特点，使其具有成为一种新的组织工程种子细胞的潜力，在临床应用中有着巨大的前景。二、材料与方法（一）实验材料1．主要仪器与设备Delta320电子PH计电热恒温水槽（MettlerToledoLtd，美国）超速离心机（ThermoFisherScientificLtd，美国）生物安全柜（青岛海尔特种仪器公司，中国）DK-8A型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司，中国）CO2细胞培养箱（ThermoFisherScientificLtd，美国）200目滤网（Invitrogen公司，美国）100mm培养皿（BDFalcon公司，美国）流式细胞仪（BeckmanCoulter，美国）水平离心机（Eppendorf，美国）除酶EP管（KIRGEN公司，美国）8孔腔室载玻片（ibidi公司，德国）恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司，中国）6孔培养板（BDFalcon公司，美国）Milli-Q去离子水制备仪（MilliporeLtd公司，德国）15mL离心管（BDFalcon公司，美国）StepOne实时定量PCR仪（AppliedBiosystemsbylifetechnology，美国）-11- 海军军医大学硕士学位论文眼科剪、眼科镊（上海金钟医疗器械公司，中国）荧光倒置显微镜（徕卡公司，德国）2．实验试剂胎牛血清（GIBCO公司，美国）0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）重组人EGF因子（PeproTech公司，美国）盘尼西林/链霉素双抗（上海博光生物技术公司，中国）甲醛溶液（中国医药上海化学试剂公司，中国）牛血清白蛋白（上海博光生物技术公司，中国）SSEA-3antibody（proteintech公司，中国）SSEA-4antibody（proteintech公司，中国）高糖DMEM培养基（GIBCO公司，美国）TRIzol试剂盒（ThermoFisherScientificLtd，美国）OCT-4antibody（proteintech公司，中国）成脂分化培养基（CyagenBiosciences公司，中国）成骨分化培养基（CyagenBiosciences公司，中国）成软骨分化培养基（CyagenBiosciences公司，中国）无水乙醇(分析纯)（中国医药上海化学试剂公司，中国）油红O染液（CyagenBiosciences公司，中国）茜素红染液（CyagenBiosciences公司，中国）阿利辛蓝染液（CyagenBiosciences公司，中国）PBS粉末（中国医药上海化学试剂公司，中国）3．常用试剂配制1×PBS溶液：取PBS粉末，用去离子水完全溶解后，定容到2000mL，高压蒸汽消毒后4℃保存。10%福尔马林溶液：850mL1×PBS溶液与100mL40%甲醛混合，待完全混合后PBS溶液定容至1L备用。（二）实验方法-12- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究经过海军军医大学附属长海医院伦理委员会批准及产妇签署知情同意书后，本课题收集HIV、HBV、HCV及梅毒等传染病检测阴性的剖宫产妇胎盘以收集羊膜。1.羊膜上皮细胞体外分离培养在无菌条件下，从胎盘上分离羊膜。获得的羊膜应用含青霉素和链霉素的无菌PBS清洗，多次清洗直至羊膜变为半透明。分离羊膜上附着的绒毛膜后，将获得的羊膜剪成1mm大小左右的微粒。加入50ml事先预热的0.05%胰酶/EDTA以100g离心20分钟后弃上清。再加入100ml0.05%胰酶/EDTA于37℃下150rmp震荡消化60分钟，应用含10%胎牛血清的培养基中和胰酶。应用200目滤网过滤细胞悬液，置于离心机上以1000g离心10分钟。滤网过滤后的未完全消化的羊膜可以用胰酶进行二次消化后再过滤收集细胞。离心后弃上清，应用高糖DMEM重悬并再次以1000g离心10分钟。重复两次后，应用含10%胎牛血清高糖DMEM重悬后进行细胞计数，以1x105/cm2的密度将细胞接种于培养皿，并记为P1代。加入含1%青链霉素，10ug/ml的EGF和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基，隔天换液，同时应用相差倒置显微镜每天观察细胞形态及生长情况，并拍照记录。在37℃、5%CO2培养箱中培养至细胞约90%融合后，进行消化传代，以1:2比例进行传代。传代所得细胞隔日换液一次，待细胞约90%融合后重复以上步骤，传代培养记为P2代，依次类推。2.流式细胞仪鉴定细胞表型采用流式细胞的方法检测所培养细胞的表型，具体步骤如下：①取上述培养了5d的P1代羊膜上皮细胞应用胰酶消化后，1000rmp离心5分钟，然后应用PBS重悬细胞再次1000rmp离心5分钟；②应用PBS重悬细胞并计数，将细胞以105个/mL分装到除酶1.5mlEP管中，每管100ul；③将EP管以1000rmp离心5分钟后弃上清，将事先配好的0.3%BSA液以每管200ul加入EP管，室温封闭30分钟；④将封闭完的EP管以1000rmp离心5分钟后弃上清，分别加入下列直标鼠抗人单克隆抗体：CD29-APC、CD34-APC、CD44-APC、CD45-APC、CD73-PE、CD90-PE、CD105-APC及其同型对照（eBioscince公司，美国），所用抗体按照说明书稀释，在室温下避光孵育1小时；⑤孵育结束后，EP管以1000rmp离心5分钟后弃上清，加入200μLPBS重悬细胞后1000rmp离心5分钟。重复2次，所有操作在避光条件下进行；⑥每管加200ulPBS重悬细胞，混匀，上机检测。-13- 海军军医大学硕士学位论文3.免疫荧光鉴定细胞表型采用免疫荧光的方法检测所培养细胞的表型，具体步骤如下：①取培养了5d的P1代羊膜上皮细胞应用胰酶消化，使用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中和，800rmp离心5分钟，弃上清用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基重悬细胞并计数；②取细胞接种至8孔腔室载玻片上，每孔300ul，接种密度为5×104/mL，于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时；③吸去载玻片中的培养基，PBS洗涤细胞碎片，重复3次，每次5分钟，应用福尔马林室温固定30分钟；④吸去福尔马林，PBS洗涤3次，每次5分钟，应用事先配好的0.1%BSA溶液封闭1小时；⑤弃BSA溶液，分别加入如下鼠抗人单克隆抗体：SSEA-3、SSEA-4、OCT-4，根据抗体说明书进行抗体稀释，每孔加入100ul抗体，同时设置阴性对照组加入等量的PBS而不加抗体，于4℃过夜；⑥抗体孵育结束后，PBS洗涤3次，每次5分钟，加入FITC荧光二抗室温避光孵育1小时；⑦吸去二抗，加入DAPI避光孵育5分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟，将载玻片置于荧光倒置显微镜下观察细胞并拍照。4.RT-PCR检测羊膜上皮细胞干性基因检测4.1RNA的提取①将人羊膜上皮细胞接种至6孔板中，待细胞融合至80%-90%时吸出培养基，PBS洗涤两次去除细胞碎片，每孔以10cm2/ml的体积加入Trizol室温裂解细胞5分钟；②将细胞裂解液吸入1.5ml除酶EP管中，以12000rmp离心5分钟后弃沉淀；③加入Trizol体积1/5的氯仿，用力震荡摇晃EP管，混匀后室温静置10分钟；④EP管置于4℃下12000g离心15分钟，小心吸取上层水相400ul，避免吸取中间液面，转移至新的除酶EP管中；⑤加入Trizol体积1/2的异丙醇，混匀后室温静置10分钟；⑥EP管置于4℃下12000g离心10分钟，弃上清，加入与Trizol等体积的预冷75%乙醇，混匀；⑦4℃下7500g离心5分钟，尽量去除上清，室温晾干，加入30ulDEPC水55℃-14- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究溶解10分钟。4.2mRNA逆转录为cDNA①测定提取的mRNA浓度，计算各样本1ugmRNA所需的体积。②将4uLPrimeScriptBuffer(5X)(含有PrimeScriptRTase、RNaseInhibitor、Random6mers、OligodTPrimer、dNTPMixture、反应Buffer)与提取的1ug模板mRNA混匀，并用DEPC水补足为20uL并充分混匀。③将混匀的反应混合液置于PCR扩增仪中，设置反应条件为：37℃15min—85℃5sec—4℃5sec，反应结束后-20℃保存。4.3实时定量PCR扩增①每孔加入SYBRPremixExTaq(2X)5uL、扩增基因上游引物0.2uL、扩增基因下游引物0.2uL、Rox反应液0.2uL、样品cDNA2uL、DEPC水2.4uL共10ul的反应体系，充分混匀，重复3次；②将混匀的反应混合液置于实时定量PCR仪中，设置反应条件为：95℃15sec—95℃5sec—60℃30sec—72℃30sec，扩增40个循环；③反应结束后将数据导出到Excel表中，采用ΔΔCt法进行相对定量分析，检测目的基因的表达变化。各引物序列如下：β-Actin：forward5’-CATGTACGTTGCTATCCAGGC-3’，reverse5’-CTCCTTAATGTCACGCACGAT-3’;OCT4：forward5’-CTGGGTTGATCCTCGGACCT-3’,reverse5’-CCATCGGAGTTGCTCTCCA-3’;Sox-2：forward5’-GCCGAGTGGAAACTTTTGTCG-3’,reverse5’-GGCAGCGTGTACTTATCCTTCT-3’;NANOG：forward5’-TTTGTGGGCCTGAAGAAAACT-3’,reverse5’-AGGGCTGTCCTGAATAAGCAG-3’.5、羊膜上皮细胞分化潜能的检测（1）羊膜上皮细胞成脂诱导①将刚分离的羊膜上皮细胞以2×104个/ml的密度接种至事先由IV胶原包被的6孔板中，用含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37%，5%CO2的培养箱中培养；②待细胞完全融合后吸去培养基，加入成脂诱导培养基持续诱导4周，隔天换液；-15- 海军军医大学硕士学位论文③成脂诱导结束后吸去诱导培养基，应用PBS洗涤2次，每次5分钟，应用10%福尔马林室温固定30分钟；④吸去固定液，PBS洗涤2次，每次5分钟，每孔加入1ml油红O工作液（油红O贮存液与蒸馏水按3:2的体积比例混合，中性滤纸过滤）室温染色30分钟；⑤吸去染液，PBS洗涤2次，将6孔板置于镜下观察细胞成脂染色效果。（2）羊膜上皮细胞成骨诱导①将刚分离的羊膜上皮细胞以2×104个/ml的密度接种至事先由明胶包被的6孔板中，用含10%胎牛血清的DMEM/F12培养基于37%，5%CO2的培养箱中培养；②待细胞约60%-70%融合后吸去培养基，加入成骨诱导培养基持续诱导4周，隔天换液；③成骨诱导结束后吸去诱导培养基，应用PBS洗涤2次，每次5分钟，应用10%福尔马林室温固定30分钟；④吸去固定液，PBS洗涤2次，每次5分钟，每孔加入1ml茜素红染液室温染色5分钟；⑥吸去染液，PBS洗涤2次，将培养板置于显微镜下观察成骨染色效果。（3）羊膜上皮细胞成软骨诱导①将刚分离的羊膜上皮细胞以3×105个/ml的密度接种至15ml离心管中，室温下250g离心5分钟；②吸去上清，加入0.5ml条件成软管诱导培养基重悬洗涤细胞，室温下150g离心5分钟，重复2次；③吸去上清，加入0.5ml完全成软骨诱导培养基重悬细胞，室温下150g离心5分钟；④将离心管置于37℃，5%CO2培养箱中培养并松开离心管盖，隔天换液；⑤48小时后细胞团聚拢，轻弹管底将软骨球脱离管底悬浮在培养液中，换液时注意不要吹散软骨球；⑥诱导30天以后，取出软骨球进行冰冻切片，阿利辛蓝染色后显微镜下观察切片情况。（三）统计方法本部分数据采用SPSS20.0进行分析，采用Shapiro-Wilk和Levene法检查数据是否符合正态分布和方差齐性。如果符合，则数据表示为均数±标准差。两组间数-16- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究据比较采用t检验，P<0.05视为差异有统计学意义。三、实验结果（一）人羊膜上皮细胞体外培养的形态P1代人羊膜上皮细胞接种后8小时基本完成贴壁，镜下观察可见细胞成鹅卵石样成团生长，核圆，居中，细胞呈多边形，边界清楚，轮廓分明。细胞量较少时，细胞形态较为细长，细胞色泽明亮，随着培养时间延长细胞逐渐变大变圆，细胞变暗，细胞整体增殖速度较慢，大概培养到第7d可长满（如图一所示）。传代之后，细胞增殖速度变慢，同时细胞核逐渐变小，胞质逐渐增多，P3代细胞不再增殖。图一：P1代羊膜上皮细胞生长大体观（二）细胞表型分析取培养了5d的P1代羊膜上皮细胞细化分离，通过流式细胞仪检测，结果显示培养细胞高表达CD29、CD44、CD73、CD90、CD105，但是不表达CD45、CD34（如图二所示）。-17- 海军军医大学硕士学位论文图二：羊膜上皮细胞各种表型的流式图通过免疫荧光检测发现，羊膜上皮细胞表达SSEA-3、SSEA-4、OCT4（如图三所示）。图三：羊膜上皮细胞OCT-4、SSEA-4、SSEA-3免疫荧光代表性图片-18- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究（三）RT-PCR对于羊膜上皮细胞干性基因的检测如图四所示，通过与内参β-Actin比较，羊膜上皮细胞表达OCT-4、Sox-2、NANOG等干性基因。图四：羊膜上皮细胞各基因表达结果（四）羊膜上皮细胞分化潜能的检测1、成脂诱导分化诱导过程中细胞形态逐渐变大，胞质中逐渐产生一些小的脂滴，在培养4周后脂滴完成融合稳定，油红O染液染色呈阳性（如图五A所示），证明羊膜上皮细胞有向脂肪细胞分化的潜能。2、成骨诱导分化诱导过程中细胞连接变少，细胞生长变缓慢，茜素红染液染色可见钙结节形成（如图五B所示），证明羊膜上皮细胞有向成骨细胞分化的潜能。3、成软骨诱导分化诱导过程中软骨球十分稳定，未见变小或者变大，诱导4周后取软骨球制成石蜡切片后阿利辛蓝染色呈阳性（如图五C所示），证明羊膜上皮细胞有向成软骨细胞分化的潜能。-19- 海军军医大学硕士学位论文图五：A为成脂诱导代表性图片；B为成骨诱导代表性图片C为成软骨诱导代表性图片四、讨论羊膜是胎盘最内层的一层薄膜，厚度约为8-12um，不含神经及血管。羊膜由上皮层与结缔组织外层构成，上皮层与羊水相接，结缔组织外层与绒毛膜相连。羊膜上皮细胞是一层位于羊膜上皮层的单层柱状上皮细胞，研究表明其易被分离培养[25]。但是羊膜上皮细胞在体外不能无限增殖，原代培养往往几代之后就失去增殖特性，Parolini等研究表明羊膜上皮细胞一般传代数在2-6代左右[25]。在本研究中，我们应用临床剖宫产废置胎盘提取羊膜上皮细胞，通过对于羊膜上皮细胞形态及生长的观察发现其生长缓慢，同时不能长期传代，一般在P3代就不能继续传代，这与Parolini等的研究也相符。同时通过流式细胞术检测发现，羊膜上皮细胞表达CD29、CD44、CD73、CD90和CD105，但并不表达CD34、CD45，此结果与Miki等研究相符[26]。同时研究表明羊膜上皮细胞还表达CD13,CD10,CD166,CD49e等表面抗原[27]，但是并不是所有细胞表达一致，提示羊膜上皮细胞的表型存在一定异质性[25]。通过表面抗原检测及大体形态的判断，可以表明本研究中提取的为羊膜上皮细胞，同时成功的分离培养细胞为下一步进行在体及体外实验做了基础工作。同时Parolini等研究还表明，羊膜上皮细胞不表达MHCII类抗原以及共刺激分子CD80，CD86，CD40和CD40配体[18]。而Ilancheran等发现，羊膜上皮细胞可以表达HLA-G[28]，在生理条件下，组成型HLA-G表达存在于免疫特异性器官中，并且通过与抑制性受体的相互作用与致耐受性性质相关联[29]。以上均表明羊膜上皮细胞免疫源性较低，可以躲避受体免疫系统的排异，便于在受体内存活。通过RT-PCR检测羊膜上皮细胞干性基因的表达情况，显示羊膜上皮细胞表达OCT-4、Sox-2、NANOG等干性基因，此结果与Miki等的研究相符[26]，同时免疫荧光染色显示羊膜表达SSEA-3、SSEA-4、OCT-4等胚胎细胞标志物，此结果与Portmannlanz等的研究相符[30]。此外Portmannlanz等的研究发现，羊膜上皮细胞还-20- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究可以表达TRA1-60,TRA1-81等胚胎细胞标志物，不表达SSEA-1等[30]。羊膜上皮细胞不仅表达多种胚胎干细胞基因及标志物外，而且还能够分泌多种生长因子。Steed等研究表明羊膜上皮细胞浸提液含有血小板衍生生长因子，血管内皮生长因子，血管生成素，转化生长因子β2，金属蛋白酶组织抑制因子-1和金属蛋白酶-2的组织抑制剂等多种组织修复相关生长因子[31]。Alcaraz等研究表明羊膜上皮细胞可以自分泌TGF-β以促进自身从从上皮细胞向间质细胞转化[32]，此过程一般常见于发育过程，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程。同时本研究中对于羊膜上皮细胞的诱导发现，其可以分化为成骨、成脂、成软骨细胞。多项研究还表明羊膜上皮细胞还可以分化为骨骼肌[30]、心肌[17]、胰腺[17]及肝细胞[33]等。通过本实验及多项研究报道均可证明羊膜上皮细胞具有一定的多能性，同时还有向三胚层分化的能力。羊膜上皮细胞具有来源广泛、获得容易、免疫源性低、无致瘤性等特性，同时研究表明其具有一定的多能性，同时还可以向三胚层分化，使其有望成为组织工程的种子细胞，在临床应用中有着巨大的前景。结合下一步实验中羊膜上皮细胞在糖尿病创面中的作用，使其在糖尿病创面等慢性创面的治疗中显示出巨大的潜力。-21- 海军军医大学硕士学位论文第二部分：羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合研究一、前言糖尿病创面由于外周动脉疾病，周围神经病变，炎症和免疫细胞功能受损，从而导致创面愈合缓慢甚至迁延不愈。糖尿病创面常因迁延不愈或者反复发作而严重影响患者生活质量，给社会公共医疗资源造成巨大负担。干细胞移植用以糖尿病创面已有一些报道，但是临床应用存在获取困难及致瘤性等问题。羊膜上皮细胞因其具有来源广泛、获得容易、免疫源性低等特性，同时其还具有一定的多能性和三胚层分化能力，使其具有在糖尿病创面应用的潜能。羊膜上皮细胞在组织修复中的应用已有诸多报道，故本部分中探讨羊膜上皮细胞对于糖尿病创面的作用。二、材料与方法（一）实验材料1．主要仪器与设备Delta320电子PH计电热恒温水槽（MettlerToledoLtd，美国）荧光倒置显微镜（徕卡公司，德国）恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司，中国）超速离心机（ThermoFisherScientificLtd，美国）DK-8A型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司，中国）CO2细胞培养箱（ThermoFisherScientificLtd，美国）100mm培养皿（BDFalcon公司，美国）200目滤网（Invitrogen公司，美国）水平离心机（Eppendorf，美国）除酶EP管（KIRGEN公司，美国）96孔培养板（BDFalcon公司，美国）Milli-Q去离子水制备仪（MilliporeLtd公司，德国）15mL离心管（BDFalcon公司，美国）眼科剪、眼科镊（第二军医大学，中国）5-0缝合线（强生公司，美国）-22- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究ELX800酶标仪（BioTek公司，美国）眼科剪、眼科镊（上海金钟医疗器械公司，中国）显微镜（徕卡公司，德国）Elx50型ELISA清洗机（Biotek公司，美国）冰冻切片机（珊顿公司英国）2．实验试剂胎牛血清（GIBCO公司，美国）0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）重组人EGF因子（PeproTech公司，美国）甲醛溶液（中国医药上海化学试剂公司，中国）牛血清白蛋白（上海博光生物技术公司，中国）CD31antibody（Abcam公司，美国）CD206antibody（Abcam公司，美国）iNOSantibody（Abcam公司，美国）IL-1βELISA试剂盒（R&DSystems，美国）IL-6ELISA试剂盒（R&DSystems，美国）高糖DMEM培养基（GIBCO公司，美国）VEGFELISA试剂盒（R&DSystems，美国）TGF-β1ELISA试剂盒（R&DSystems，美国）TNF-αELISA试剂盒（R&DSystems，美国）IGF-1ELISA试剂盒（R&DSystems，美国）无水乙醇(分析纯)（中国医药上海化学试剂公司，中国）TritonX-100（中国医药上海化学试剂公司，美国）盘尼西林/链霉素双抗（上海博光生物技术公司，中国）PBS粉末（中国医药上海化学试剂公司，中国）DAB显色试剂盒（ThermoFisherScientificLtd，美国）CM-dil细胞追踪染料（ThermoFisherScientificLtd，美国）DMSO（Amresco公司，美国）3．常用试剂配制1×PBS溶液：取PBS粉末，用去离子水完全溶解后，定容到2000mL，高压蒸汽消毒后4℃-23- 海军军医大学硕士学位论文保存。10%福尔马林溶液：850mL1×PBS溶液与100mL40%甲醛混合，待完全混合后PBS溶液定容至1L。Harris苏木精染料：1g苏木精溶解于10mL无水酒精，以1:20比例加入20％钾矾水溶液中。搅拌并加热至煮沸，1分钟后退热时逐渐加入0.5g氧化汞，继续搅拌并加热煮沸约一分钟后冷却。CM-dil母液：避光条件下，DMSO溶解CM-dil，最终浓度为1mg/mL，-20℃保存待用。3.实验动物8-12周龄雄性糖尿病小鼠于中科院上海实验动物中心。实验遵循动物伦理，尽可能减少动物在实验时的痛苦，未虐待动物。（二）实验方法1.羊膜上皮细胞的分离培养具体方法同第一部分。2.羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合2.1糖尿病创面的建立将实验用糖尿病小鼠（db/db小鼠）适应性喂养1周，通过测量血糖选出血糖浓度＞300mg/dL的小鼠，按照随机数表法将糖尿病小鼠分为羊膜上皮细胞注射组和空白对照组。在注射前一天，应用1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，注射剂量为30mg/kg体重，剃毛备皮，避免对皮肤造成额外损伤。24小时后，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，消毒皮肤，在距小鼠背部中线约为7mm的左右两侧分别制作直径为1cm的圆形全层皮肤缺损。2.2羊膜上皮细胞注射及后续处理将之前培养的P1代羊膜上皮细胞消化并应用PBS洗涤2次后再次应用PBS重悬。将重悬的细胞悬液注射在实验组小鼠创面的周围皮下，每个创面50μL（细胞密度为5×105个/mL），空白对照组注射等量的PBS溶液。创面应用无菌凡士林纱布覆盖，并用5-0带针缝合线将无菌凡士林纱布与周围皮肤固定。于创面第0、10、14-24- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究天观察创面愈合情况并拍照，图形软件Image-Pro计算创面愈合率。3.创面皮肤病理学检测取创面第10天空白组及羊膜细胞组糖尿病小鼠，1%戊巴比妥钠腹腔注射麻醉，取下创面及创周的皮肤后处死小鼠。获得的皮肤标本应用10%福尔马林固定1-2天，自来水冲水12小时，梯度酒精脱水（75%乙醇24小时、85%乙醇2小时、95%乙醇1小时、100%乙醇0.5小时），二甲苯透明约20-30分钟，石蜡包埋，切片，进行HE染色，普通光镜下拍照观察组织愈合情况。HE染色步骤具体如下：①脱蜡至水：将石蜡切片置入二甲苯溶液（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）中各5分钟，然后依次置入无水乙醇（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）各5分钟、95%酒精5分钟、85%酒精5分钟、75%酒精5分钟，最后用蒸馏水洗5分钟；②染色：石蜡切片放入苏木精染液（事先用中性滤纸过滤）10分钟，自来水冲洗30分钟，放入1%盐酸酒精分化液分化数秒（根据镜下苏木精染色情况确定时间），75%酒精5分钟、85%酒精5分钟，放入伊红染液中8秒；③透明至水：将石蜡切片依次置入95%酒精（Ⅰ、Ⅱ）各5分钟、无水乙醇（Ⅰ、Ⅱ）各5分钟、二甲苯（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）中各5分钟；④封片镜检：中性树胶封片；显微镜下观察组织大体情况。4.创面皮肤组织免疫组化和免疫荧光检测应用免疫组化检测创面标本：CD31抗体染色检测创面组织血管化情况，CD68抗体染色检测创面巨噬细胞的量，iNOS抗体染色检测创面M1型巨噬细胞的量，CD206抗体染色检测创面M2型巨噬细胞的量。具体步骤如下：①脱蜡至水：将石蜡切片置入二甲苯溶液（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）中各5分钟，然后依次置入无水乙醇（Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ）各5分钟、95%酒精5分钟、85%酒精5分钟、75%酒精5分钟，最后用蒸馏水洗5分钟；②柠檬酸修复液浸泡石蜡切片，密闭染色盒，等待高压锅开始冒气后3分钟放入染色盒，121℃修复抗原10分钟，自然冷却；③PBS洗涤修复后的石蜡切片3次，每次5分钟，将洗涤后的切片置于3%过氧化氢室温孵育30分钟除去内源性过氧化物酶；④先后应用去离子水、PH7.4的PBS各洗涤石蜡切片2次，每次5分钟，应用含200μLTritonX-100的5%BSA封闭液4℃封闭过夜。-25- 海军军医大学硕士学位论文CD31免疫组化染色步骤：①按1:50稀释比例一抗，滴加完全覆盖标本，将标本小心放入湿盒于4℃孵育过夜；②取出湿盒复温30分钟，PBS洗涤切片3次，每次5分钟，用1%BSAPBS溶液稀释相应二抗，滴加完全覆盖标本后37℃孵育1小时；③PBS洗涤孵育后的切片3次，每次5分钟，CD31染色切片应用DAB显色3-10分钟后将切片放入蒸馏水中终止反应，应用PBS洗涤2次，每次5分钟；④苏木精（滤纸过滤）复染核3分钟，盐酸乙醇分化液分化1-2次，镜下观察颜色明显变淡为棕红色为宜；⑤自来水冲洗20-30分钟反蓝，烘干，中性树脂封片置于显微镜下观察并拍照。CD68、iNOS、CD206免疫荧光染色步骤：①按如下比例稀释一抗：CD68抗体（1:200）、CD206抗体（1:50）、iNOS抗体（1:50），滴加覆盖切片将标本小心放入湿盒于4℃孵育过夜；②取出湿盒复温30分钟，PBS洗涤切片3次，每次5分钟，用1%BSAPBS溶液稀释相应荧光二抗，滴加完全覆盖标本后37℃孵育1小时；③PBS洗涤孵育后的切片3次，每次5分钟，滴加DAPI染核5分钟；④PBS洗涤切片3次，每次5分钟，抗荧光猝灭剂封片置于镜下观察并拍照。5.羊膜上皮细胞在创面的转归情况检测①取P1代羊膜上皮细胞吸去培养液，加入含1μg/mLCM-dil的10%胎牛血清的高糖DMEM培养基于37℃、5%CO2培养箱中孵育30分钟；②将标记细胞置于荧光相差显微镜下观察标记情况并拍照；③待确定完全标记后，按照步骤2制备糖尿病创面并注射荧光标记的羊膜上皮细胞；④于创面第5、10天分别取下创面及创周的皮肤后处死小鼠，避免让标本碰水并快速处理后，将标本置于冰冻切片机中；⑤将标本置于组织支承器中，加入包埋剂于-20℃包埋20分钟，应用冰冻切片机制成冰冻切片，于-20℃保存；⑥将冰冻切片取出蒸馏水洗涤3次，每次5分钟，DAPI染液完全覆盖标本，避光孵育5分钟；⑦应用PBS洗涤3次，每次5分钟，防荧光猝灭剂封片，于相差倒置荧光显微镜下观察并拍照。-26- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究6.ELISA法检测创面炎症相关因子应用ELISA法（酶联免疫法）检测创面组织各种炎性促进因子（如IL-1β、IL-6、TNF-α）和促进愈合因子（VEGF、TGF-β1、IGF-1）的表达情况。6.1样品制备①糖尿病创面模型及细胞注射具体见步骤1；②创面第10天应用真皮组织活检穿刺器取下创面及部分周围组织，应用预冷PBS及蛋白抑制剂洗涤组织血液并用眼科剪剪碎后，按1:1的比例将组织标本及预冷PBS及蛋白抑制剂置于生物组织粉碎机中粉碎匀浆；③将所得匀浆液置于4℃，10000rmp离心20分钟后收集上清液，于4℃保存待用；④将120ng/ml的标准品原液按说明书中的稀释比例稀释成1000、500、250、125、62.5、31.3和15.6pg/ml的浓度梯度后备用。6.2酶联免疫吸附板制备①将捕获抗体以每孔100μL的量加入96孔板，室温密闭包被过夜；②吸出液体，在自动洗涤机中应用清洗缓冲液清洗，每孔400μL，重复3次，最后一次清洗后，倒置96孔板并用干净的纸巾将其吸干，尽量吸去所用清洗缓冲液；③每孔加入300μL试剂稀释液，在室温下孵育1小时；④吸出液体，在自动洗涤机中应用清洗缓冲液清洗，每孔400μL，重复3次，最后一次清洗后，倒置96孔板并用干净的纸巾将其吸干，尽量吸去所用清洗缓冲液后备用。6.3样品检测①在96孔板中加入稀释后的标准品体系及待测样品，每孔100μL，应用粘合带密闭室温孵育2小时；②吸出液体，在自动洗涤机中应用清洗缓冲液清洗，每孔400μL，重复3次，最后一次清洗后，倒置96孔板并用干净的纸巾将其吸干，尽量吸去所用清洗缓冲液；③每孔加入100μL检测抗体，应用粘合带密闭室温孵育2小时；④吸出液体，在自动洗涤机中应用清洗缓冲液清洗，每孔400μL，重复3次，最后一次清洗后，倒置96孔板并用干净的纸巾将其吸干，尽量吸去所用清洗缓冲液；⑤加入100μL辣根过氧化物酶，室温密封避光孵育20分钟；⑥吸出液体，在自动洗涤机中应用清洗缓冲液清洗，每孔400μL，重复3次，-27- 海军军医大学硕士学位论文最后一次清洗后，倒置96孔板并用干净的纸巾将其吸干，尽量吸去所用清洗缓冲液；⑦每孔加入100μL反应底物，室温密封避光孵育20分钟；⑧每孔加入50μL反应终止液，同时轻轻敲击震荡以完全混合溶液，确保反应完全停止；⑨立即将96孔板置于酶标仪上于450mm确定吸光度（OD）值，重复3个复孔。以标准品的OD值绘制标准曲线，并应用标准曲线计算所测蛋白浓度。（三）统计方法本部分数据采用SPSS20.0进行分析，采用Shapiro-Wilk和Levene法检查数据是否符合正态分布和方差齐性。如果符合，则数据表示为均数±标准差。两组间数据比较采用t检验，多组数据比较应用方差分析，P<0.05视为差异有统计学意义。三、结果（一）羊膜上皮细胞促进糖尿病鼠创面愈合情况应用羊膜上皮细胞或者PBS处理糖尿病创面，比较创面第0天、10天、14天的创面愈合情况。在创面第10天，羊膜上皮细胞组创面愈合率（52.16±6.80%）明显高于PBS组（35.76±6.19%,P<0.01），创面第14天羊膜上皮细胞组创面愈合率（81.11±5.57%）较PBS组（58.88±4.92%）明显提高（P＜0.01）（如图六所示）。在第10天创面HE染色显示羊膜上皮细胞组创面新生肉芽组织厚度（0.73±0.10mm）较PBS组（0.53±0.10mm）明显增加（P＜0.05）（如图七所示）。以上结果表明羊膜上皮细胞可以明显提高糖尿病创面愈合率，增加创面新生肉芽组织厚度。图六：A图表示不同处理方法糖尿病创面愈合大体观；B图表示创面愈合率的统计学比较-28- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究图七：A图为羊膜上皮细胞组标本HE染色代表图片，B图为PBS组标本HE染色代表图片，C图表示新生肉芽组织厚度统计学比较（二）羊膜上皮细胞促进糖尿病创面血管的新生通过对于创面标本CD31的免疫组化染色显示：在创面第10天，羊膜上皮细胞组创面CD31阳性新生血管较PBS组明显增多，通过计数发现羊膜上皮细胞组创面新生毛细血管密度（53.8±11.8/hpf）较PBS组（29.7±7.3/hpf）明显增多（P<0.01）（如图八所示）。以上结果表明羊膜上皮细胞能够促进糖尿病创面血管新生。图八：A图为羊膜上皮细胞组标本免疫组织代表图片，B图为PBS组标本免疫组化代表图片，C图表示创面新生血管数统计学比较比较（三）羊膜上皮细胞调控糖尿病创面巨噬细胞极化通过CD68标记所有巨噬细胞，iNOS标记M1型巨噬细胞，CD206标记M2型巨噬细胞，DAPI标记细胞核，对于创面标本免疫组化显示结果如下：在图九A上侧图片中，CD68+iNOS+的M1型巨噬细胞显示为黄色；在图九A下侧图片中，CD68+CD208+的M2型巨噬细胞显示为黄色。在创面第10天，通过计数结果显示羊膜上皮细胞组创面M1型巨噬细胞的密度（43.21±9.53/mm2）明显低于PBS组（100.41±14.72/mm2，P＜0.01）（如图九B所示）；羊膜上皮细胞组创面M2型巨噬细胞密度（176.54±18.66/mm2）较PBS组高（151.03±16.88/mm2）（P＜0.05）（如图九C所示）；羊膜上皮细胞组M1/M2的比例（25.16±6.12%）较PBS组也明显降低-29- 海军军医大学硕士学位论文（67.43±13.92%）（P＜0.01）（如图九D所示）。以上结果表明羊膜上皮细胞可以促进糖尿病创面巨噬细胞向M2型转化。图九：A表示不同组创面标本巨噬细胞表型免疫荧光代表性图片，B表示不同组间M1型巨噬细胞密度统计学比较，C表示不同组间M2型巨噬细胞密度统计学比较，D表示不同组间M1/M2比例统计学比较（四）羊膜上皮细胞对于糖尿病创面炎症反应的调控作用通过ELISA检测创面促炎因子（IL-1β、IL-6、TNF-α）和促愈和因子（IGF-1、TNF-β、VEGF）的表达情况。在创面第10天，羊膜上皮细胞组创面组织中VEGF、TGF-β1、IGF-1的表达量明显高于PBS组的表达量（P＜0.01），而IL-1β、IL-6、TNF-β表达量明显较PBS低（P＜0.01）（如图十所示）。以上结果表明羊膜上皮细胞对于糖尿病创面具有促进糖尿病创面由促炎环境向促愈合环境转化的作用。-30- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究图十：不同组间各种炎症因子及促愈合因子在创面中表达的统计学比较（五）羊膜上皮细胞在创面的转归情况通过细胞追踪剂CM-dil标记细胞，观察细胞在创面的转归情况。在创面第5天，可观察到创面有大量羊膜上皮细胞存活；在创面第10天，可观察到创面少量羊膜上皮细胞存活（如图十一所示）。以上结果表明羊膜上皮细胞在创面存活时间较短，未见大量增殖，推测旁分泌作用而非转分化作用在羊膜上皮细胞在促糖尿病创面愈合中起主要作用。图十一：羊膜上皮细胞在糖尿病创面存留代表性图片四、讨论目前对于糖尿病创面没有特别有效的方法，在控制血糖的前提下，对于创面彻-31- 海军军医大学硕士学位论文底清创、避免感染，促进创面愈合，同时辅以病因治疗的治疗方法是糖尿病创面主要的治疗方式[7]。但是目前存在治疗时间长、次数多、复发率高的问题。干细胞移植用以组织修复已有一些报道，目前有报道用以糖尿病治疗的干细胞主要以骨髓来源和脂肪来源的间充质干细胞[23]。但是骨髓来源间充质干细胞提取过程中存在对于供体损伤以及细胞得率低的问题，而脂肪来源的间充质干细胞存在提取复杂和致瘤性的问题[13]。寻找一种新的方便可靠的干细胞来源日渐成为临床治疗的迫切需求。羊膜上皮细胞因其具有来源广泛、获得容易、免疫源性低等特性，同时其还具有一定的多能性和三胚层分化能力，使其具有在糖尿病创面应用的潜能。羊膜上皮细胞在组织修复中的应用已有诸多报道，目前羊膜上皮细胞已在肝、神经、肺、心肌甚至肿瘤治疗中都有一定的优势[25]。但是目前羊膜上皮细胞应用于糖尿病创面治疗的研究仍旧较少，故在本部分的研究中探讨将羊膜上皮细胞治疗糖尿病创面作用有一定的意义。糖尿病创面愈合条件复杂，创面愈合时间较长，甚至创面迁延不愈形成慢性创面。通过将羊膜上皮细胞局部注射，在第10天可以观察到羊膜上皮细胞组较PBS组创面愈合率明显升高，而在14天时创面愈合率差距继续扩大，同时对于创面组织病理学检测结果也显示羊膜上皮细胞可以促进新生肉芽组织的形成。由此证明了羊膜上皮细胞有助于糖尿病创面的愈合。研究表明糖尿病创面的创面微环境复杂，免疫细胞功能及创面血管化能力的受损影响创面愈合[34]。血管生成不足导致血管及毛细血管密度降低是导致糖尿病创面迁延不愈形成慢性创面的一个重要因素[5]。本研究中通过分析创面标本中CD31的表达，发现羊膜上皮细胞组创面新生毛细血管密度较PBS组明显增多。以上结果表明羊膜上皮细胞能够促进糖尿病创面血管新生。巨噬细胞是一种创面修复中的重要细胞，在正常创面愈合过程中，巨噬细胞由促炎形态（M1型）向前修复形态（M2型）转化，而M2型可以有效促进创面的愈合[35]。研究表面在糖尿病创面愈合过程中，巨噬细胞的形态也发生了一定的改变，而Khanna等通过对糖尿病小鼠的研究表明，在糖尿病创面中巨噬细胞显示出降低的胞吞作用，增加了伤口中的凋亡负荷和炎症分布[36]。通过在局部注射羊膜上皮细胞以后，羊膜上皮细胞组创面M1型巨噬细胞的密度明显低于PBS组；羊膜上皮细胞组创面M2型巨噬细胞密度较PBS组密度高；羊膜上皮细胞组M1/M2的比例较PBS组也明显降低。同时通过对于创面各种炎性因子的分析，结果显示羊膜上皮细胞组创面组织中VEGF、TGF-β1、IGF-1的表达量明显高于PBS组的表达量，而IL-1β、IL-6、TNF-β表达量明显较PBS低。由此可以表明羊膜上皮细胞可以促进糖尿病创面巨噬细胞向M2型转化，明显减轻糖尿病创面的炎症反应，并促使创面环境向促愈合微环境转化。-32- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究致瘤性是干细胞移植临床应用的一个潜在危险因素，间充质干细胞因在临床应用已有诸多报道，但是其存在一定致瘤性限制其广泛应用[23]。羊膜上皮细胞因其无致瘤性而在组织修复中得到广泛应用，同时研究表明其还有一定的抑制肿瘤生长的能力[37]。在本研究中我们发现在糖尿病创面局部注射羊膜上皮细胞10天后仅有少量细胞存留，未见大量增殖。此与Miki等的研究结果相似[17]。同时Miki等研究还证明了羊膜上皮细胞不表达端粒酶，不能大量增殖形成肿瘤[17]，故此可能是羊膜上皮细胞在创面消失的原因。由此亦可以推断羊膜上皮细胞旁分泌作用在促进糖尿病创面愈合中起主要作用。-33- 海军军医大学硕士学位论文第三部分：羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合机制的初步探讨一、前言创面愈合是一个复杂的过程，包括止血，炎症，增殖和重塑。在正常愈合过程中，M1型巨噬细胞分泌促炎因子以促进初期炎症反应，而M2型则在增殖期促进血管生成和肉芽组织形成以促进创面的愈合[38]。糖尿病创面由于炎症反应失调，早期创面周围的炎性细胞量较少不能引起急性炎症反应，而后期却明显增加形成慢性炎性反应。研究表明糖尿病创面常常表现为创面持续的炎症反应，同时伴随着M1型巨噬细胞的的聚集以及各种促炎因子的增多和促愈因子的减少[39]。在创面愈合过程中，血管化可以有效促进创面的增殖活动和修复重塑[40]，而糖尿病创面中血管化过程受到抑制。课题组发现羊膜上皮细胞可以有效促进糖尿病创面的愈合，同时对于创面巨噬细胞极化及血管化程度有一定作用，故在本部分中我们对羊膜上皮细胞于糖尿病创面愈合促进作用的进行初步探索。二、材料与方法（一）实验材料1．主要仪器与设备荧光倒置显微镜（徕卡公司，德国）恒温振荡器（上海一恒科学仪器有限公司，中国）生物安全柜（青岛海尔特种仪器公司，中国）超速离心机（ThermoFisherScientificLtd，美国）CO2细胞培养箱（ThermoFisherScientificLtd，美国）200目滤网（Invitrogen公司，美国）DK-8A型电热恒温水槽（上海精宏实验设备有限公司，中国）100mm培养皿（BDFalcon公司，美国）Delta320电子PH计（MettlerToledoLtd，美国）水平离心机（Eppendorf，美国）显微镜（徕卡公司，德国）除酶EP管（KIRGEN公司，美国）-34- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究96孔培养板（BDFalcon公司，美国）Milli-Q去离子水制备仪（MilliporeLtd公司，德国）15mL离心管（BDFalcon公司，美国）眼科剪、眼科镊（上海金钟医疗器械公司，中国）Transwell小室（Corning公司，美国）ELX800酶标仪（BioTek公司，美国）血细胞计数板（上海医用光学仪器公司，中国）StepOne实时定量PCR仪（AppliedBiosystemsbylifetechnology，美国）2．实验试剂高糖DMEM培养基（GIBCO公司，美国）胎牛血清（GIBCO公司，美国）PRMI-1640培养基（GIBCO公司，美国）0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司，美国）重组人EGF因子（PeproTech公司，美国）甲醛溶液（中国医药上海化学试剂公司，中国）牛血清白蛋白（上海博光生物技术公司，中国）中性酶（sigma公司，美国）盘尼西林/链霉素双抗（上海博光生物技术公司，中国）重组人TNF-α因子（sigma公司，美国）TritonX-100（中国医药上海化学试剂公司，中国）重组人IFN-γ因子（sigma公司，美国）无水乙醇(分析纯)（中国医药上海化学试剂公司，中国）PBS粉末（中国医药上海化学试剂公司，中国）CCK-8试剂盒（碧云天生物技术公司，中国）Matrigel基质胶（BDSystems，美国）3．常用试剂配制1×PBS溶液：取PBS粉末，用去离子水完全溶解后，定容到2000mL，高压蒸汽消毒后4℃保存。（二）实验方法-35- 海军军医大学硕士学位论文1.羊膜上皮细胞的分离培养具体方法同第一部分。2.羊膜上皮细胞条件培养基的制备将提取的P1代羊膜上皮细胞以2×106个/ml的密度接种至10cm培养皿中，24小时细胞完全贴壁以后将含10%胎牛血清的高糖DMEM培养基更换为无血清的高糖DMEM培养基，并继续培养24小时。收集上清，室温下300g离心5分钟去除残留细胞等杂质，收集上清应用离心超滤管浓缩，最终收集的浓度为羊膜上皮细胞条件培养基的10倍。将获得的培养基于-80℃保存备用。3.细胞分离培养3.1原代巨噬细胞的分离培养及鉴定①腹腔注射0.1%戊巴比妥钠麻醉C57BL/6小鼠（麻药剂量为30mg/Kg体重），脱颈法处死小鼠；②应用75%酒精消毒皮肤，无菌条件下分离皮下组织，游离股骨及胫骨；③打开骨髓腔，应用低糖DMEM培养基冲洗2-3次，收集上清，1200rmp室温下离心5分钟，重复2次，收集沉淀应用含20ng/mlM-CSF的PRMI-1640培养基重悬后，接种至培养皿中，于37℃、5%CO2培养箱中培养；④72小时后换液，直至分离的原始细胞完全分化成熟；⑤应用流式细胞术检测巨噬细胞的F4/80阳性表达情况，具体操作步骤同第一部分，选择F4/80阳性比例在95%以上的细胞继续培养进行下一步实验。3.2人脐静脉内皮细胞培养人脐静脉内皮细胞购买于ScienCell公司，采用含10％FBS的内皮细胞基础培养基ECM(Gibco,LifeTechnologies)培养。4.人脐静脉内皮细胞增殖活性检测本实验采用CCK-8方法检测羊膜上皮细胞条件培养基对于人脐静脉内皮细胞增殖的作用。分组为：10%胎牛血清的DMEM培养基阳性对照组，羊膜上皮细胞条件培养基组，高糖DMEM阴性对照组。具体步骤如下：①将步骤3中分离的细胞消化为细胞悬液，计数细胞量，调整浓度为5×104个/mL，以每孔5000个细胞的量接种于96孔板；-36- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究②应用10%胎牛血清高糖DMEM培养基培养细胞24小时，吸去培养基，加入200μL羊膜上皮细胞条件培养基，同时加入等量的阳性及阴性对照组，培养72小时；③每孔加入20μLCCK-8溶液，轻轻拍打混匀后置于37℃、5%CO2继续培养，3小时后吸取上清液转移至新的96孔板中；④将96孔板置于酶标仪上于450mm确定吸光度（OD）值，重复3个复孔，比较各组值的差异。5.人脐静脉内皮细胞迁移能力检测本实验分组为：10%胎牛血清的DMEM培养基阳性对照组，羊膜上皮细胞条件培养基组，高糖DMEM阴性对照组。具体步骤如下：①将人脐静脉内皮细胞消化为细胞悬液，应用无血清高糖DMEM培养基重悬细胞并计数，调整细胞浓度为105个/mL，以每孔100μL的量加入Transwell小室的上室；②在Transwell下室加入羊膜上皮细胞条件培养基或阳性或阴性对照组，每孔600μL，保持上下室液平面一致，于37℃、5%CO2培养箱中培养24小时；③取下小室，取出滤膜应用1×PBS洗涤两次，应用4%中性甲醛固定30分钟，0.5%TritonX-100穿膜5-10分钟；④0.1%结晶紫染液染色滤膜10分钟，PBS洗涤3次，每次5分钟后于相差倒置显微镜下观察细胞迁移情况并拍照。6.血管内皮细胞成管实验应用人脐静脉血管内皮细胞成管实验检测不同培养基对于血管形成的作用，分组为：含10%胎牛血清的DMEM培养基阳性对照组，羊膜上皮细胞条件培养基组，高糖DMEM阴性对照组。具体步骤如下：①将Matrigel基质胶于4℃过夜，在冰上将基质胶与内皮细胞基础培养基按1:3的比例混合，在96孔板中每孔加入50μL混合液，于37℃中孵育30分钟，待液体完全成胶；②将人脐静脉内皮细胞消化，应用羊膜上皮细胞条件培养基或阳性或阴性对照组重悬细胞，调整细胞浓度为4×105个/mL，以每孔100μL加入基质胶包被的96孔板；③37℃、5%CO2培养箱中培养6小时后，取出96孔板，置于相差倒置显微镜下计数比较各组形成血管数并拍照。-37- 海军军医大学硕士学位论文7.羊膜上皮细胞条件培养基对于巨噬细胞转化影响IFN-γ和TNF-α联合刺激模拟创面M0型巨噬细胞向M1型巨噬细胞转化情况，以检测不同培养基对于巨噬细胞转化的影响，分组为：10%胎牛血清的DMEM培养基+IFN-γ和TNF-α阳性对照组，10%胎牛血清的DMEM培养基+羊膜上皮细胞条件培养基+IFN-γ和TNF-α组，10%胎牛血清的DMEM培养基空白对照组。具体步骤如下：①将巨噬细胞消化后重悬，以每孔105个的密度接种于6孔板；②37℃、5%CO2培养至细胞约70%融合后，吸出培养基，每组各自更换对应培养基继续培养24小时；③每组均加入IFN-γ(20ng/ml)和TNF-α(20ng/ml)继续培养24小时，置于镜下观察细胞形态的改变并拍照；④收集细胞行RT-PCR检测巨噬细胞表型改变，具体步骤见第一部分。各引物序列如下：GAPDH：forward5’-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3’，reverse5’-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3’；INOS：forward5’-ACATCGACCCGTCCACAGTAT-3’，reverse5’-CAGAGGGGTAGGCTTGTCTC-3’，CD206：forward5’-CTACAAGGGATCGGGTTTATGGA-3’；reverse5’-TTGGCATTGCCTAGTAGCGTA-3’。（三）统计方法本部分数据采用SPSS20.0进行分析，采用Shapiro-Wilk和Levene法检查数据是否符合正态分布和方差齐性。如果符合，则数据表示为均数±标准差。两组间数据比较采用t检验，多组数据比较应用方差分析，P<0.05视为差异有统计学意义。三、结果（一）羊膜上皮细胞条件培养基对于巨噬细胞的调控作用通过原代提取巨噬细胞培养后，观察正常培养的巨噬细胞可见胞核较小，卵圆形，着色深，更换培养基以后细胞扩增缓慢。应用TNF-α和IFN-γ刺激后，发现巨噬细胞向M1型转变，细胞周围形成许多细短的突起。羊膜上皮细胞条件培养基可以减轻由TNF-α和IFN-γ引起的细胞周围的细短树突状突起（如图十一A所示）。通过RT-PCR检测相关基因结果显示，羊膜上皮细胞条件培养基处理组巨噬细胞-38- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究CD206（M2型巨噬细胞标志物）的表达量较空白对照组（P＜0.01）和阳性对照组明显升高（P＜0.01）；而iNOS（M1型巨噬细胞标志物）的表达量较空白组（P＜0.05）和阳性对照组明显降低（P＜0.01）（如图十二B所示）。以上结果提示羊膜上皮细胞培养基在形态和表型上具有促进巨噬细胞向M2型转化的能力。图十二：A表示不同处理方式下巨噬细胞不同表型的大体观；B表示不同处理方法下各型巨噬细胞标志物RT-PCR结果的统计学比较（二）羊膜上皮细胞条件培养基对于人脐静脉内皮细胞的调控作用通过CCK-8试剂盒检测人脐静脉内皮细胞的增殖活性，根据所得OD计算比较不同处理组的结果。应用羊膜上皮细胞条件培养基处理组较阴性对照组能够明显促进人脐静脉内皮细胞的增殖（P＜0.01）（如图十二所示）。以上结果表明羊膜上皮细胞条件培养基有一定促进内皮细胞增殖的作用。-39- 海军军医大学硕士学位论文图十三：不同处理方法组CCK-8检测OD值统计学比较通过Transwell小室检测迁移能力，结果表明羊膜上皮细胞条件培养基处理组细胞个数（368.17±33.22）较阴性对照组（99.00±24.58）明显增多（P＜0.01）（如图十三所示）。结果表明羊膜上皮细胞条件培养基具有促进内皮细胞迁移作用。图十四：不同处理方法组HUVEC迁移情况代表性图片及统计学比较通过成管实验检测不同处理对于细胞成管能力的影响，结果显示羊膜上皮细胞条件培养基处理组成管个数（56.83±5.56）较阴性对照组（20.00±5.62）明显增多（P-40- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究＜0.01）（如图十四所示）。结果表明羊膜上皮细胞可以提高内皮细胞成管能力。图十五：不同处理方法组HUVEC成管情况代表性图片及统计学比较四、讨论创面愈合是一个复杂的过程，包括止血，炎症，增殖和重塑。正常创面愈合过程中，炎症反应具有清除异物、吞噬细胞碎片以及控制感染等作用，同时在整个炎症反应过程过程中炎性细胞分泌的各种生长因子对于组织修复有着十分重要的作用[39]。在创面形成的初期，在损伤的血管内皮细胞分泌的细胞粘附因子介导下，白细胞由外周血游入受损组织中，引起炎症反应[41]。在创面的炎症反应的早期，中性粒细胞首先游出。中性粒细胞具有较强的吞噬作用，能在早期清除异物及控制感染，同时还可以分泌促炎因子增强炎症反应[42]。中性粒细胞寿命较短，大约3天后受损组织的主要炎症细胞转为巨噬细胞[43]。巨噬细胞可在不同的条件下转化为不同形态，在创面急性炎症期，由IFN-γ等Th1细胞因子激活的巨噬细胞表型一般为M1型，而由IL-4或IL-13等Th2细胞因子激活的则为M2型[44]。在炎症反应过程中，M1型巨噬细胞分泌促炎因子以促进急性炎症反应[45]，而M2型则在增殖期促进血管生成和肉芽组织形成以促进创面的愈合[46]。由此可见巨噬细胞在创面愈合过程中起着十分重要的作用。糖尿病创面由于炎症反应失调，早期创面周围的炎性细胞量较少不能引起急性炎症反应，而后期却明显增加形成慢性炎性反应[47]。研究表明难-41- 海军军医大学硕士学位论文糖尿病慢性创面常常表现为创面持续的炎症反应，同时伴随着M1型巨噬细胞的的聚集以及各种促炎因子的增多和促愈因子的减少[47]。不仅如此，Khanna等研究发现在糖尿病创面巨噬细胞的吞噬能力减弱，以致在创面周围凋亡细胞长期存在使创面的炎症反应增强并长期存在[36]。在糖尿病创面中，M1/M2巨噬细胞的比例较正常创面明显升高[48]，而M1型巨噬细胞长期存在并持续促炎因子IL-1β、IL-6和TNF-α等，促炎因子又可以正反馈作用于巨噬细胞使其向M1型转化[49]，从而造成创面炎症反应不断加重，此也与第二部分研究的结果相符。Mirza等研究表明，通过将M1表型的巨噬细胞极化为M2表型是促进糖尿病伤口愈合的有效方式[49]。羊膜上皮细胞可以调节巨噬细胞的极化已有诸多报道，Tan等应用羊膜上皮细胞来治疗博来霉素诱导特发性肺纤维化，结果表明其可以有效减轻巨噬细胞向M1型转化，同时可以增强其吞噬能力[50]。Alhomrani等收集羊膜上皮细胞条件培养基静脉注射治疗CCL4诱导的肝纤维化小鼠，结果显示肝巨噬细胞显着减少，其中观察到主要的M2表型[51]。羊膜上皮细胞应用于组织修复治疗已有诸多报道，Vosdoganes等研究发现羊膜上皮细胞在损伤组织中植入较少[52]。不仅如此，羊膜上皮细胞一般在创面存活时间较短，无法长期存在或者转化为其他细胞[37]，而对于羊膜上皮细胞外泌体研究发现其可以有效促进组织修复[53]。在第二部分的研究中我们发现羊膜上皮细胞可以促进糖尿病创面的修复，同时通过标记羊膜上皮细胞观察到其在创面存活时间较短且并未大量增殖，考虑到其可能通过旁分泌作用于受损组织。为证明我们的猜想，在本部分研究中，通过在IFN-γ和TNF-α作用下体外培养巨噬细胞，诱导M1型巨噬细胞转化。在TNF-α和IFN-γ刺激后，发现巨噬细胞向M1型转变，细胞周围形成许多细短的突起。应用羊膜上皮细胞条件培养基对于TNF-α和IFN-γ刺激的巨噬细胞可以减少细胞周围的细短树突状突起。通过RT-PCR检测相关基因结果显示，羊膜上皮细胞条件培养基处理组巨噬细胞CD206（M2型巨噬细胞标志物）的表达量较空白对照组和TNF-α和IFN-γ联合刺激组明显升高；而iNOS（M1型巨噬细胞标志物）的表达量较空白组合TNF-α和IFN-γ联合刺激组明显降低。以上结果提示羊膜上皮细胞培养基在形态和表型上具有促进巨噬细胞向M2型转化的能力。综上羊膜上皮细胞通过旁分泌作用减轻创面周围的炎症反应，增加创面周围M2型巨噬细胞的量，促进糖尿病伤口从促炎状态转换为促愈合状态，最终提供促进愈合的环境并随后促进糖尿病小鼠中的伤口愈合。正常伤口愈合中的血管生成依赖于促进血管生长和增殖以及促进血管成熟和静止之间的微妙平衡。但是在糖尿病创面中，这种平衡被打破。Seitz等研究发现在糖尿病创面周围VEGF及其mRNA的表达量明显降低[54]，Galiano等应用VEGF局部处理糖尿病创面后可加速创面愈合速度加快[55]。VEGF可促进新生血管形成和使血-42- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究管通透性增加，是创面愈合过程中一种促进愈合的生长因子[43]。除了促血管生成刺激的减少之外，研究表明糖尿病创面中抗血管生成因子和毛细血管成熟因子的变化[5]。羊膜上皮细胞对于组织修复中血管再生的促进作用有一定的争议，Zhang等应用羊膜上皮细胞促进由化疗引起的卵巢损伤修复，结果显示羊膜上皮细胞可以明显促进受损组织血管化[56]。Zhu等则证明了羊膜上皮细胞可以抑制由博来霉素诱导的肺纤维化组织血管生成，但是却可以增加高氧诱导的肺损伤的组织血管生成[56]。第二部分研究表明羊膜上皮细胞可能是通过旁分泌的方式促进糖尿病创面的血管化。故在本部分研究中，通过体外培养HUVEC，应用羊膜上皮细胞条件培养基培养细胞并检测其增殖、迁移及成管能力，结果均表明羊膜上皮细胞条件培养基可以提高HUVEC的增殖、迁移及成管能力。由此可以表明羊膜上皮细胞是通过旁分泌作用促进糖尿病创面血管内皮细胞增殖并促使其完成血管化。同时前文所述羊膜上皮细胞可以增加创面M2型巨噬细胞的量，而M2型巨噬细胞是创伤中VEGF和其他促血管生成介质的重要来源，羊膜上皮细胞通过提高M2巨噬细胞的量间接促进创面血管化的程度。综上所述，羊膜上皮细胞主要是通过旁分泌作用于糖尿病创面的巨噬细胞及血管内皮细胞，使创面从促炎状态转换为促愈合状态，促进创面血管程度，最终提供促进愈合的环境并随后促进糖尿病小鼠中的伤口愈合。-43- 海军军医大学硕士学位论文全文总结糖尿病创面的治疗方式众多，干细胞移植用以组织修复已有一些报道，目前主要应用的还是以骨髓及脂肪间充质干细胞，但是骨髓来源间充质干细胞提取过程中存在对于供体损伤以及细胞得率低的问题，而脂肪来源的间充质干细胞却存在提取复杂以及存在一定的致瘤性的问题。羊膜上皮细胞在组织修复中的作用已有诸多报道，羊膜上皮细胞在肝肺纤维化，神经、心肌损伤，胰腺功能修复甚至肿瘤治疗都有应用。但是目前少有羊膜上皮细胞对于糖尿病创面作用的研究，故在本研究中，我们通过提取培养羊膜上皮细胞，并应用于糖尿病创面中以观察其对于创面愈合的作用并对其机制进行初步探索。在本研究中，我们收集剖宫产胎盘分离羊膜，应用酶消化法分离培养羊膜上皮细胞并传代，检测细胞表面抗原以鉴定其为羊膜上皮细胞。同时检测发现羊膜上皮细胞表达多种胚胎干细胞干性基因及蛋白，同时还具有向三胚层分化潜能，为下一步羊膜上皮细胞用于糖尿病创面提供基础。通过应用羊膜上皮细胞治疗糖尿病创面，发现羊膜上皮细胞可以明显促进糖尿病创面的愈合。检测创面巨噬细胞极化、新生血管形成及创面炎症反应的结果显示，羊膜上皮细胞可以调控巨噬细胞极化、促进创面血管化及减轻创面炎症反应的作用。鉴于羊膜上皮细胞可以促进糖尿病创面愈合，我们进一步探索羊膜上皮细胞对于巨噬细胞极化及血管化的作用。通过应用羊膜上皮细胞条件培养基作用于巨噬细胞极化，结果显示羊膜上皮具有逆转巨噬细胞向M1型转化，促进巨噬细胞由M1型向M2型转化的能力。通过羊膜上皮细胞作用于人脐静脉内皮细胞，应用CCK-8检测其增殖能力、Transwell检测其迁移能力、成管试验检测成管能力，结果显示羊膜上皮细胞可以促进人脐静脉内皮细胞增殖、迁移及成管能力，并以此促进糖尿病创面的愈合。以上结果显示羊膜上皮细胞可以通过调节巨噬细胞极化以及促进创面血管化以促进糖尿病创面的愈合，有效调节创面微环境，减轻创面炎症反应。由此可见羊膜上皮细胞移植可以有望成为一种新型有效的糖尿病创面的治疗方式。-44- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究综述：人羊膜上皮细胞在组织修复中的应用及进展羊膜是胎盘最内层的一层薄膜，厚度约为8-12um，不含神经及血管。羊膜由上皮层与结缔组织外层构成，上皮层与羊水相接，结缔组织外层与绒毛膜相连。自1910年羊膜首次作为敷料用以创面治疗以来[9]，因其具有细胞迁移及扩增、免疫原性低、减少炎症和疤痕组织减轻创面疼痛、含有大量的生长因子和细胞因子等特点，使其在临床上得到了广泛的应用[57-59]。随着羊膜保存技术的发展[60]，使羊膜在眼科疾病[10]、烧伤救治[61]、整形修复[14]、口腔疾病[62]及神经外科[16]等领域都有广泛的应用。近年来，羊膜越来越多地应用于慢性创面[8,63-65]，使其成为一种新型的治疗手段。人羊膜上皮层是由单层均匀立方上皮细胞构成，称之为人羊膜上皮细胞（hAEC）。多项研究表明，HAEC表达干细胞标志物，并具有向全部三个胚层分化的能力。同时因其来源广泛简便和便于分离，使HAEC成为移植和再生医学的潜在有用且无争议的细胞来源。一、羊膜上皮细胞的来源及生物学特征目前hAEC获取的主要方式是通过钝性分离羊膜与绒毛膜后，应用消化酶（如胰蛋白酶）消化后获得原代细胞，大约1.2亿个活的hAEC可以从单张羊膜中分离[66]。分离获得的原代细胞容易附着到塑料或基底膜涂布的培养皿上，通常在可以简单的培养基中培养，如含5-10%胎牛血清的和表皮生长因子（EGF）的DMEM培养基[67]。新鲜分离的hAEC是中等大小的细胞，形状为圆形，具有中央或偏心核，一个或两个核仁，以及丰富的细胞质。hAEC呈现成团生长，增殖速度较快并具有典型的鹅卵石上皮形态，但在较低的细胞浓度下生长缓慢。通过体外培养还发现，羊膜上皮细胞可以通过自分泌转化生长因子β（TGF-β）来诱导其从上皮细胞向间质细胞转化[32]，此过程一般常见于发育过程，而且还参与组织愈合、器官纤维化和癌症发生等过程。羊膜含有具有不同表面标志的上皮细胞，提示表型具有一定的异质性。hAEC细胞表面抗原包括ATP-结合盒转运蛋白G2（ABCG2/BCRP），CD9，CD24，CD104,CD49e,CD49f,CD49d,CD44，E-钙粘蛋白，整联蛋白α6和β1，c-met（肝细胞生长因子受体）等参与细胞间相互作用和细胞粘附的分子，阶段特异性胚胎抗原（SSEAs）3和4以及肿瘤排斥抗原（TRA）1-60和1-81[17]。hAEC不表达SSEA-1，CD34和CD133等表面抗原，而如CC趋化因子受体（CCR4）和CD117等有目前认为其不表达或者在部分细胞上表达[68]。除表面标记外，hAEC还表达包括八聚体结合蛋白4（OCT-4），SRY相关-45- 海军军医大学硕士学位论文HMG-box基因2（SOX-2）和Nanog在内的多能干细胞的分子标记[69]。Tamagawa等人通过在体外用小鼠胚胎干细胞建立了人类羊膜细胞的异种嵌合体的研究表明hAEC具有多能性[70]。此后众多研究表明hAEC可以被诱导分化[25]。Sakuragawa等人在体外培养的hAEC上发现了神经细胞和胶质细胞标志物[71]。多项研究表明，体外培养的hAEC合成并释放乙酰胆碱，儿茶酚胺[72]和多巴胺等神经递质[73]。Sakuragawa等人报道，体外培养的hAEC可以分泌白蛋白（Alb）和甲胎蛋白（AFP），在将hAEC移植入严重联合免疫缺陷（SCID）小鼠的肝脏后，可以鉴定出Alb-和AFP-阳性的肝细胞样细胞整合到肝实质中[74]。除Alb和AFP的产生外，其他肝功能的标志物，如糖原贮积和活性转录因子如肝细胞核因子（HNF）3γ的表达和HNF4α，CCAAT/增强子结合蛋白（CEBPα和β），以及几种药物代谢基因（细胞色素P450）均在hAEC上得到证实，以证明其可以在用以肝的细胞治疗[25]。鉴于在hAEC中发现的广泛的肝基因和功能表明hAEC具有很好的肝细胞分化潜力。hAEC还可以向另一个内胚层组织胰腺的分化。研究表明，在烟酰胺存在的情况下培养hAEC2-4周可以诱导向胰腺分化[75]。随后移植表达胰岛素的hAEC纠正了链脲佐菌素诱导的糖尿病小鼠的高血糖症。在同样的情况下，人羊膜间充质细胞（HAMSC）是无效的，这表明hAEC，而不是hAMSC，能够分化为胰岛B细胞[75]。上述研究表明，hAEC是具有许多干细胞特征的独特细胞。目前已有的研究表明，hAEC可以在体外和体内分化为神经，胰腺和肝脏细胞[24]。故可以推测出，hAEC可以被诱导向三个胚层的细胞分化。二、羊膜上皮细胞的免疫特性羊膜因其免疫源性较低在眼外科、烧伤整形修复等领域都有广泛的应用，羊膜上皮细胞作为羊膜一部分其免疫源性也很低。hAECs的免疫学特征的原因不仅是因为它们表达低水平的主要组织相容性复合体（MHC）I类表面抗原，而且在hAECs中MHC-I主要合成酶的水平也明显降低[76]。研究表明在炎性细胞因子干扰素γ（IFN-γ）存在或不存在的情况下，hAEC都不表达MHCII类抗原，共刺激分子CD80（B7-1），CD86（B7-2），CD40或CD40配体[77]。它们既不表达程序性死亡受体1（PD1）（通常在激活的T细胞和B细胞上表达的抑制性受体），也不表达它的两种配体：程序性死亡配体1和2（PD-L1和PD-L2）[78]。这两种通常通过用IFN-γ刺激而上调。关于肿瘤坏死因子相关凋亡诱导配体（TRAIL），肿瘤坏死因子α（TNF-α）和Fas配体（Fas-L），以及参与诱导细胞凋亡的TNF家族的所有成员的表达存在一些争议[77]。hAEC另外一个特征是其组成性表达组织限制的非经典人类白细胞抗原G-46- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究（HLA-G）[29]。在生理条件下，组成型HLA-G主要在免疫特异性器官（例如睾丸，卵巢和胎儿细胞）中表达，并且通过与抑制性受体的相互作用与耐受性特性相关联[79]。HLA-G已被证明具有重要的免疫调节功能。它主要被T淋巴细胞和B淋巴细胞表达的ILTR以及自然杀伤细胞和树突状细胞所识别，并且消除了由这些受体细胞[24]。通过应用IFN-γ，HLA-G在HAEC上的水平上调[20]。总之，这些特征表明HAEC是免疫特异性细胞，能够在免疫相容性不匹配的同种异体移植受体中存活。三、羊膜上皮细胞在临床中的应用由于羊膜上皮细胞具有较高的多能性可以向三个胚层的细胞分化，同时其免疫原性较低，使其在组织修复中的应用成为了可能。羊膜上皮细胞能够应用较简便的方法从废弃胎盘中获取，其来源广泛同时不存在相关伦理问题使其成为一种潜在的临床应用手段。1、羊膜上皮细胞在肝脏疾病中的应用肝细胞移植已成为治疗肝病的新方法。然而，该技术目前受限于移植手术缺乏合适的肝细胞。有关hAEC肝分化的临床前研究一直很有希望。在体外，分化程序已经产生了表达许多肝功能的细胞，包括转录因子HNF3α和C/EBPα，HNF1，HNF4β，孕烷x受体和包括白蛋白，α1-抗胰蛋白酶（A1AT），葡萄糖-6-磷酸酶，氨基甲酰磷酸合酶I（CPS-I），谷氨酰胺合酶，磷酸烯醇丙酮酸羧激酶，酪氨酸转氨酶，转甲状腺素蛋白和药物的分化的肝基因代谢基因CYP1A1,1A2,2A6,2B6,2C8,2C9,2D62E1,3A4,7和7A1[17,33,80]。hAEC中鉴定的肝脏基因还包括转运蛋白，包括P-糖蛋白，多药耐药蛋白1，ABCG2，胆盐输出泵，尿苷二磷酸葡萄糖醛酸转移酶1A1（UGT1A1）和鸟氨酸转氨甲酰酶（OTC）[25]。在hAEC中鉴定的大量肝脏基因和功能表明，如果开发了有效和有效的方法来诱导完全肝脏分化，则hAEC可以是用于移植程序的细胞的有用来源。溶酶体贮积症（LSDs）是因溶酶体中有关酸性水解酶缺陷导致溶酶体内细胞物质的积累。已知有50多种LSD，但目前的治疗标准主要是支持治疗和对症治疗。原代hAEC含有17种溶酶体酶，其中7种酶的活性高于造血细胞[81]。在20世纪80年代的几项临床试验中，外科医生皮下埋植了羊膜或hAECs进入LSD患者，临床结果与临床骨髓移植的近期发现一致[82-84]。羊膜移植或hAEC移植在治疗粘多糖病和尼曼-皮克病方面表现出一定的疗效[85]。最近，hAEC移植的治疗效果已在小鼠疾病模型中得到验证[86]。hAECs的肝分化潜能提示在先天性肝代谢疾病（CLMD）的细胞治疗中有用。大约有1,500名儿童出生时患有代谢紊乱，以及许多这些严重的-47- 海军军医大学硕士学位论文先天性代谢紊乱或合成过程主要涉及肝脏[81]。目前对CLMDs的治疗包括终生饮食限制，有或没有补充氨基酸。器官移植，肝细胞移植（HTx）的替代方法被认为是治疗这些疾病的合理方法。HTx是一种侵入性较小的手术，伴随发病率较低，并发症较少，恢复时间和成本显着降低[87]。研究表明，部分细胞替代可以弥补基因缺乏的酶功能。但是目前供者肝细胞短缺，阻碍了HTx的广泛临床应用，使得hAEC来源的肝细胞成为临床HTx的替代来源。最令人惊讶的临床前研究之一是在枫糖尿病小鼠模型中进行[88]。虽然所有对照组动物在28日龄之前死亡，但接受了原代hAEC移植的11只动物中有9只（82％）存活超过100天，表现出正常体重增加和活动，并且没有显示出该疾病的总体症状[89]。这项临床前研究表明，hAEC移植不一定需要在移植前进行体外细胞扩增或分化，这为未来临床转化减少了很多的应用前操作。炎症和纤维化的致病机制都可以通过hAECs的免疫调节（抗炎和抗纤维化）特性来解决。研究表明hAEC直接减弱淋巴细胞应答，而hAEC条件培养基能够抑制肝星状细胞活化[90]。几种使用化学或手术诱导的肝纤维化的肝硬化动物模型已经证实了hAEC的治疗功效。Parolini的研究小组将人羊膜作为一个补丁应用于胆管结扎模型大鼠的肝脏表面。尽管异种条件（人-鼠），人羊膜膜片仍能调节纤维化的严重程度和进展[91]。ManManpillai等的研究表明全身hAEC移植改善了四氯化碳诱导的小鼠肝纤维化。异种（人-鼠）细胞移植诱导宿主肝脏活化的肝星状细胞的显着还原。单核细胞趋化蛋白-1水平也下降，包括YM-1，IL-10和CD206在内的M2巨噬细胞相关基因在hAEC移植小鼠肝脏中上调[92]。观察表明，hAEC介导的抗脂肪作用可能是协同作用可溶性因子和细胞与细胞之间的相互作用。2、羊膜上皮细胞在神经疾病中的应用hAEC已经显示出治疗中枢神经系统疾病的特殊潜力。研究发现hAEC不仅表达神经和胶质细胞标志物以及神经特异性蛋白质，并且还具有产生和分泌神经递质的能力[17]，这些细胞的细胞疗法已经被认可。将hAEC移植如帕金森病大鼠模型中，可以逆转症状加重并阻止了神经元死亡[93]。当hAEC移植到缺血海马时，它们分化成“神经元样”细胞。在移植到横断的猴子脊髓后，hAEC辅助宿主轴突的强力再生，并防止脊髓横断的神经元死亡[94]。将hAEC移植到大鼠脊髓损伤挫伤模型的损伤区域，不进行免疫抑制，细胞存活达120天，没有炎症或排斥迹象。使用巴索（Basso），比蒂（Beattie）和布雷斯纳汗（Brensnahan）（BBB）运动评定量表，动物表现出逐渐的功能改善，最终达到19分，仅低于正常动物2分。在病变对照动物中也观察到改善;然而，在移植受者的急性和亚急性恢复阶段，改善更快[95]。hAEC分泌神经营养因子，而hAEC条件培养基已被证实对E18大鼠皮质细胞具有神经营养作用[96]。-48- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究hAEC条件培养基也支持依赖成纤维细胞生长因子-2（FGF-2）的E10鸡神经视网膜细胞的存活[97]。研究表明，在冷冻保存的hAEC中表达FGF-2和EGF基因和蛋白[98]。以上研究表明HAEC移植在脊髓损伤的动物模型中产生有益的结果，其在损伤的急性阶段表现出神经保护作用，并且通过行为评估测量，促进长期恢复期的长片段的再生。hAEC的促进恢复作用可能是通过分泌新的神经营养因子来介导的。在研究hAEC治疗中枢神经作用的同时，hAEC对周围神经损伤修复也有着令人振奋的结果。研究表明将羊膜上皮细胞悬液局部注入日本白兔受伤的臂丛神经周围，注射后24周，损伤臂丛神经的拉伸弹性极限应变，弹性极限应力，最大应力和最大应变显着增加，并且兔前爪的功能得以恢复[99]。中风是另一种神经系统疾病，其中炎症被认为是起始中风发作后继发性细胞死亡级联的主要原因。目前以有研究显示hAEC的移植在非免疫抑制的大鼠中风模型中发挥有益作用[100]。在急性期将hAEC移植到缺血半暗带，改善了行为功能障碍，减轻了运动和神经功能缺陷，并减少了与大脑中动脉阻塞相关的梗塞面积。同时在远期可以延长存活率及促进神经功能的恢复。3、羊膜上皮细胞在肺部组织修复中的作用呼吸系统疾病是发病率和死亡率的主要原因。呼吸系统疾病的原因是不同的，但最终的器官损伤与慢性炎症，纤维化和瘢痕形成相似，导致功能性肺组织的损失。羊膜上皮细胞显示出可用于治疗囊性纤维化，急性呼吸窘迫综合征，慢性阻塞性肺病，肺纤维化，肺水肿和肺动脉高压等疾病的潜力[66]。在肺部疾病的动物模型中，hAECs的移植已被证明可减少炎症和随后的纤维化，并改善肺功能[101]。给予博莱霉素诱导的肺部疾病的小鼠的hAECs导致促炎性细胞因子肿瘤坏死α因子，转化生长因子-β，干扰素-γ和白细胞介素-6，降低肺胶原沉积，α-平滑肌肌动蛋白表达和炎性细胞浸润。同时还证实了hAECs与宿主巨噬细胞发生相互作用，可能通过诱导巨噬细胞转化为活化的表型来进行修复[102]。最近的研究还发现hAECs表达肺特异性蛋白6，包括离子通道囊性纤维化跨膜电导调节因子hAECs治疗囊性纤维化的重要应用[66]。这些重要的研究强调了hAECs在肺病患者临床和生物工程应用中的潜力。4、羊膜上皮细胞在其他疾病的中的应用心肌梗塞导致心肌组织死亡，目前再生医学领域中的重要目标就是寻找新的组织以替代死去失活的组织。作为细胞治疗的细胞来源，具有各种优点的人羊膜上皮细胞已知在体外分化成心肌细胞，使其有望成为一种可以应用于心肌再生的可能细胞。Cheng等应用雄性裸鼠制造急性心肌梗死的模型，比较hAECs，脐带血间充质-49- 海军军医大学硕士学位论文干细胞和脂肪组织来源的间充质细胞在心肌修复中作用，结果表明hAECs可以分化成心肌细胞样细胞，减少梗死面积，改善心脏功能，hAEC的组织修复作用与脐带血和脂肪组织来源的间充质细胞相当[103]。Yi等的研究表明体外缺氧条件下hAEC释放更多的血管生成素（ANG），表皮生长因子（EGF），白细胞介素（IL）-6和单核细胞趋化蛋白（MCP）-1，在体实验中应用hAECs处理的大鼠心肌的梗塞区和边界区的人源细胞因子ANG，EGF，IL-6和MCP-1的表达水平高于用生理盐水处理的大鼠的组织，提示hAECs的旁分泌作用可以再生心肌组织并改善心脏功能[104]。Rajika等研究表明应用上皮向间质转化的hAEC可以促进心脏中梗塞面积较小，TUNEL阳性细胞减少，骨膜素上调，而血管密度增加。提示上皮向间质转化增强了hAECs的心脏保护作用[105]。多发性硬化症是中枢神经系统（CNS）的T细胞介导的自身免疫性炎性疾病。hAEC已经应用于多发性硬化的EAE（实验性自身免疫性脑脊髓炎）小鼠模型中。McDonald等报道腹腔注射hAECs可以抑制多发性硬化症模型小鼠的脊髓和脑的中枢神经系统炎症，脱髓鞘和轴突变性的症状，并且还可以减少T细胞的增殖，减少其分泌促炎细胞因子[106]。最近，刘等人报道静脉注射hAECs减少EAE小鼠CNS内的CD3+T细胞和F4/80（+）单核/巨噬细胞浸润和脱髓鞘.OHECs免疫抑制由PGE2和TGF-β介导，因为它通过在脾细胞增殖测定中TGF-β或PGE2的中和来证明，来自hAEC处理的小鼠的脾细胞显示Th2细胞因子移位，IL-5产生显着升高[107]。目前对糖尿病的治疗依赖于每日多次胰岛素注射或胰岛素泵置入，或者β细胞或全胰腺置换。移植材料的稀缺性和终身免疫抑制治疗的要求限制了胰岛的移植。另一种基于细胞的疗法将代表这一常见慢性疾病管理的重大突破。Wei和同事证实hAECs可以刺激表达胰岛素和GLUT-2的mRNA，他们研究了hAEC在糖尿病小鼠中恢复血糖水平的可能性，在接受hAECs的小鼠中，血糖在移植后下降到正常水平，与未接受细胞的小鼠相比，经hAEC处理的小鼠的体重也正常化[75]。四、前景与挑战2004年，《Translation》杂志发表了一篇题为“羊膜和绒毛膜细胞作为移植和组织再生的治疗剂：一个处于婴儿期的领域”的社论[108]。经过十几年的研究发现源自妊娠组织的人羊膜上皮细胞的移植具有治疗范围从糖尿病到神经变性的一系列病症的潜力。体外和来自临床前动物模型的结果表明，hAEC具有强烈抑制免疫应答的能力，潜在地诱导外周耐受性并逆转正在进行的炎症损伤。同时因其具有免疫源性低，多向分化能力，免疫调节作用和溶酶体特性等特点将会在未来能在更多领域得到应用。相信随着组织工程和保存技术的提高，人羊膜上皮细胞可能会有更简单的-50- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究商品化生产方式的出现，并且仍能保持其生物属性。最后，临床前研究报道强烈支持羊膜上皮细胞在不久的将来为临床应用开发基于细胞的疗法的前景。-51- 海军军医大学硕士学位论文参考文献1.Wild,S.,etal.,Globalprevalenceofdiabetes:estimatesfortheyear2000andprojectionsfor2030.DiabetesCare,2004.27(5):p.1047-1053.2.Rahelić,D.,[7THEDITIONOFIDFDIABETESATLAS--CALLFORIMMEDIATEACTION].LijecVjesn,2016.138(1-2):p.57-58.3.Xu,Y.,etal.,PrevalenceandcontrolofdiabetesinChineseadults.JamatheJournaloftheAmericanMedicalAssociation,2013.310(9):p.948-959.4.Pereira,S.G.,etal.,MicrobiotaofChronicDiabeticWounds:Ecology,Impact,andPotentialforInnovativeTreatmentStrategies.FrontMicrobiol,2017.8:p.1791.5.Okonkwo,U.A.andL.A.Dipietro,DiabetesandWoundAngiogenesis.InternationalJournalofMolecularSciences,2017.18(7):p.1419.6.Alavi,A.,etal.,Diabeticfootulcers:PartI.Pathophysiologyandprevention.JournaloftheAmericanAcademyofDermatology,2014.70(1):p.1.e1-1.e18.7.郑仕清,etal.,羊膜移植物的制备及临床应用研究进展.中华烧伤杂志,2017.33(8):p.514-516.8.Zelen,C.M.,etal.,Aprospectiverandomisedcomparativeparallelstudyofamnioticmembranewoundgraftinthemanagementofdiabeticfootulcers.InternationalWoundJournal,2013.10(5):p.502-7.9.Fetterolf,D.E.andR.J.Snyder,Scientificandclinicalsupportfortheuseofdehydratedamnioticmembraneinwoundmanagement.WoundsACompendiumofClinicalResearch&Practice,2012.24(10):p.299-307.10.Meller,D.,etal.,Amnioticmembranetransplantationinthehumaneye.DeutschesRzteblattInternational,2011.108(14):p.243-8.11.Branski,L.K.,etal.,Amnioninthetreatmentofpediatricpartial-thicknessfacialburns.Burns,2008.34(3):p.393-399.12.Mostaque,A.K.andK.B.Rahman,Comparisonsoftheeffectsofbiologicalmembrane(amnion)andsilversulfadiazineinthemanagementofburnwoundsinchildren.JournalofBurnCare&ResearchOfficialPublicationoftheAmericanBurnAssociation,2011.32(2):p.200.13.Mohammadi,A.A.,etal.,Effectoffreshhumanamnioticmembranedressingongrafttakeinpatientswithchronicburnwoundscomparedwithconventionalmethods.Burns,2013.39(2):p.349-53.14.Fairbairn,N.G.,M.A.Randolph,andR.W.Redmond,Theclinicalapplicationsofhumanamnion-52- 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海军军医大学硕士学位论文在读期间论文发表及获奖情况论文：1.郑仕清陈甜胜纪世召罗鹏飞肖仕初.羊膜移植物的制备及临床应用研究进展.中华烧伤杂志.2017,33(8):514-516.（综述）2.郑仕清洪旭东陈甜胜罗鹏飞肖仕初.半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶1抑制剂VX765对冷束缚诱导小鼠急性胃溃疡的作用.中华烧伤杂志.2017,33(11):688-693.3.XiaoYongqiang,SunYu,ZhuBanghui,WangKangan,ZhengShiqing,XiaoShichu,XiaZhaofan.Riskfactorsforhypertrophicburnscarpain,pruritus,andparesthesiadevelopment.WoundRepairRegen(IF=3.402).(accepted)4.YongjunZheng,ShiqingZheng,XiaomingFan,LiLi,PengfeiLuo,YingyingLiu,WangLi,ZhenciCui,FeiHe,YuhuanLiu,ShichuXiaoandZhaofanXia.Amnioticepithelialcellsacceleratediabeticwoundhealingbymodulatinginflammationandpromotingneovascularization.StemCellsInternational.（underreview）-60- 羊膜上皮细胞促进糖尿病创面愈合的作用及初步机制研究致谢时光飞逝，我三年的硕士研究生生涯即将结束。回首往昔，黄浦江畔镌刻着我太多美好的回忆，虬江两岸留下了我的求学足迹，医院每个角落见证我的求学步伐。即将离开母校踏上新的旅程，我发现自己对这一片土地埋下了深深的感情，那一排排的教学楼和住院大楼让我如此留恋，每一个熟悉认识的朋友都让我如此不舍。离别是为了下次更好的相聚，此时此刻，写下这份致谢，衷心地感谢在我这三年学习过程中给予我帮助、支持、鼓励我的人，很荣幸得到你们的教诲和鞭策，让我一步步的成长。首先我要特别感谢我的恩师肖仕初教授，从入学开始您就不断鞭策我砥砺前行，默默支持关心我。您每一次的耐心教导和细心指导，让我敢于面对每一次挫折和困难去攻克真理；您的孜孜不倦和兢兢业业的工作作风，让我明白成功并不是唾手可得的而是需要付出艰辛的努力的；您治学严谨的态度和敢于挑战各种医学难题的勇气，让我懂得做科学需要时刻保持着一颗向上攀登的毅力；您不耻下问、虚心学习的学习态度，让我看到一位大家如何身体力行的做到“三人行，必有我师”的求知欲望；您每一次对我的鼓励和支持，让我拥有刻意进取、不断向上的动力和源泉。三年的时光匆匆流逝，我在您身边的所学所得对我以后的生活、工作和学习有着极大的帮助。在此由衷对您说一声“谢谢”。最后祝恩师身体健康、桃李满天下。我还要真诚地感谢我三年硕士学习期间的导师组成员夏照帆院士、路卫教授、朱世辉教授、唐洪泰教授、贲道锋教授、王广庆副教授、王光毅副教授、程大胜副教授、马兵副教授、吕开阳副教授、孙喻副教授、朱峰副教授、胡晓燕副教授等，各位老师在我课题确定、实验设计及临床技能学习各个反面均提供了极大的帮助。感谢曹青老师、纪世召老师、郑兴峰老师、陈郑礼老师、周万芳护士长、冯萍护士长在我临床学习过程中给予的帮助和指导，你们为我打开了进入烧伤领域之门，你们的耐心帮助让我扎实地跨入这神圣之门。在实验思路、实验设计、实验技能、实验统计和论文查阅撰写方面，郑勇军老师和纪世召老师给予了我极其重要的帮助，他们严厉风格、刻苦专研作风和扎实的实验技能让我很快投入课题研究中去。还有感谢王丽老师、刘莹莹老师、李理老师、崔真慈老师、何飞老师在实验设计、实验操作、实验方法和实验技术上提供的全面的指导帮助，谢谢您们的辛勤付出和全力支持。感谢王俊杰师兄、伍国胜师兄、房贺师兄、王星童师兄、王亮师兄、肖永强师兄、陈甜胜师兄、张永存、金剑、李海航、范晓明在我所研究的基础实验操作设计给予的建议和帮助，没有你们无私奉献-61- 海军军医大学硕士学位论文出宝贵的实验知识积累和惨痛经验教训，我的实验研究不会完成的那么顺利，谢谢您们。还有特别感谢邓师傅、杨师傅为我们创造干净整洁的实验环境，让我能够每天怀着愉悦的心情完成实验操作。在这三年中，新认识很多朋友，师兄，同学，谢谢有你们的陪伴，让我不觉得自己是个身在异乡的游子。我要特别感谢我的家人，是你们的默默支持和积极鼓励让我每次遇到挫折时都能正确面对。不论是如何困难的环境，家人都给了我无私的关怀和支持，使我在面对困难和挫折时更加努力。非常感谢父母养育之恩和长久的陪伴，让我学会了宽容、忍让和独立，也让我变得勇敢、坚强和自信。我还要感谢我与我一同入科的各位研究生同学，是你们在我低落时给我支持，也衷心的希望我们的情意能够源远流长。同时还要感谢研究生期间的室友，三年的感情让我们一同继续前行再次感谢我生命旅途中遇到的每一位朋友，是你们让我知道自己是什么样的一个人和该成为一个什么样的人。你们给予我的不经意的关怀、失落时的支持、挫折后的鼓励、困难时的援助之手，都将在我成长学习道路上留下足迹，真心谢谢大家，也祝福你们心想事成。郑仕清2018年5月4日上海-62-