白斑狗鱼致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定

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1、第35卷第5期渔业科学进展Vol.35,No.52014年10月PROGRESSINFISHERYSCIENCESOct.,2014DOI:10.11758/yykxjz.20140506http://www.yykxjz.cn/白斑狗鱼(Esoxlucius)致病性嗜水气单胞菌*的分离与鉴定①秦莉殷建国张薇贾舒安岳城(新疆农业大学动物医学学院乌鲁木齐830052)摘要近些年来，新疆许多养殖场发生白斑狗鱼暴发性疾病而死亡。为鉴定病因，本研究对乌鲁木齐周边地区的自然患病白斑狗鱼(Esoxlucius)的肝脏、肾脏等组织进行分离，经形态

2、观察、生理生化试验、16SrDNA序列分析进行细菌鉴定。并通过人工回归感染白斑狗鱼和鲫，来验证分离菌株的致病性。结果表明，分离出的9株优势菌为致病性嗜水气单胞菌，命名为PK001−PK009。经PCR特异性检测发现，所得的9个菌株分别含有丝氨酸蛋白酶基因(ahpA)、溶血素基因(hlyA)和气溶素基因(aerA)中的0−3个，从而导致了菌株间致病性的差异。通过人工回归感染实验发现，白斑狗鱼患病症状与自然病例相似，并重新分离得到原感染菌，经细菌学鉴定，其性状与原菌株一致，为嗜水气单胞菌。关键词白斑狗鱼；嗜水气单胞菌；毒力基因；致病性中

3、图分类号S965文献标识码A文章编号1000-7075(2014)05-0040-06白斑狗鱼(Esoxlucius)属鲑形目(Salmoniformes)、的分离和鉴定，寻找合适的治疗措施，保障该特色产狗鱼亚目(Esocoidei)、狗鱼科(Esocidae)、狗鱼属业的健康发展。(Esox)，分布于亚洲、欧洲和北美(任慕莲等，2002)。嗜水气单胞菌广泛分布于自然界的各种水体(张在我国，白斑狗鱼主要分布在新疆阿勒泰地区的额尔文青等，2012)，是多种水生动物的原发性致病菌，齐斯河流域，在乌伦古湖和博斯腾湖均有产量。白斑也为条件致

4、病菌(吕爱军等，2000;郭闯等，2003；狗鱼因生长快速、捕食范围广、适宜生长水温广邰光富等，2013)，是典型的人兽鱼共患病病原菌(6−26℃)、肉质坚韧少刺、味道鲜美、营养价值高等(杨守明等，2006；陆承平，1992)。本研究从患病白特点，逐渐成为各地广泛开展的特色养殖新品种。自斑狗鱼组织中分离和鉴定病原菌，检测其毒力，扩增2000年人工繁殖取得成功以来，白斑狗鱼的池塘流致病基因，探讨其致病机理，研究结果将为白斑狗鱼水养殖和网箱养殖日益成熟，其产品已占领了新疆渔养殖业的健康可持续发展提供重要的理论指导和技业的主要市场(郭

5、焱等，2012)。然而，生产者为了追术支持，同时为相关行业标准的制定积累基础资料。求更高经济效益，人工养殖过程养殖中，密度不断加大、饲喂高蛋白饲料，导致养殖水体水质恶化、细菌1材料与方法大量繁殖，造成鱼体患病，严重时大量死亡，损失惨1.1实验材料重，给整个白斑狗鱼养殖业的发展带来了隐患(王高学等，2006)。因此，很有必要进行白斑狗鱼病原菌1.1.1白斑狗鱼及嗜水气单胞菌阳性菌株患病*科技支疆项目(20101230760)和“新疆维吾尔自治区普通高校重点学科基础兽医学”共同资助。秦莉，E-mail:lilyjackson99@163

6、.com①通讯作者：岳城，教授，E-mail:yuechengxnd@yahoo.com.cn收稿日期:2013-12-09,收修改稿日期:2014-03-04第5期秦莉等:白斑狗鱼(Esoxlucius)致病性嗜水气单胞菌的分离与鉴定41白斑狗鱼于2012年和2013年分别采自新疆呼图壁、1.5.216SrDNA基因PCR扩增根据已报道的嗜水昌吉及五家渠、米泉地区的人工养殖池塘；健康白斑气单胞菌的16SrDNA序列(储卫华等，2005；萨姆布狗鱼购自新疆昌吉白斑狗鱼养殖基地，体长(35±5)cm，鲁克等,1999)，通过Prime

7、rPremier5.0软件设计1对体质量(145.0±2.5)g。健康鲫购自水产批发市场，体特异性引物，P1：5′-GAGGAGGAAAGGTTGATGCC-3，长(13.5±1.5)cm，体质量(115.0±4.5)g。P2：5′-CTTGAGTTCCCACCATTACG-3。PCR反应致病性嗜水气单胞菌阳性菌株由中国科学院水条件：94℃预变性10min；94℃30s、60℃30s、生生物研究所提供。72℃lmin，30个循环；72℃延伸10min。PCR产物1.1.2试剂普通营养琼脂购自北京奥博星生物用胶回收试剂盒回收纯化后

8、，送上海生物工程有限公技术有限责任公司，TSB液体培养基购自美国BD公司测序。将测序所得序列用Blast(http://www.司，健康无菌绵羊血采自新疆医科大学医学院实验动ncbi.nlm.nih.gov/Blast/)进行序列同源