hvegfa基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究

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1、hVEGFA基因重组腺病毒载体的构建及其转染效率的研究：李慧勇，袁志诚，陈波，陆培松，李巧玉，曹侃【摘要】目的：应用AdEasy复制缺陷型腺病毒载体系统构建携带hVEGFA基因的重组腺病毒载体。方法：采用分子克隆技术，从PCR2.1hVEGFA质粒中克隆出hVEGFA基因的编码序列，酶切、连接后，插入腺病毒系统中的穿梭载体pAdTrackCMV，获得重组质粒pAdTrackCMVhVEGFA，将其转化含有腺病毒骨架载体pAdeasy1的大肠埃希菌BJ5183，进行同源重组，获得重组子pAdeasy1hVEGFA。鉴定后

2、,将pAdeasy1hVEGFA转染人胚肾细胞(HEK293A细胞)，获得含hVEGFA基因的重组腺病毒(rAdhVEGFA)。反复感染HEK293A细胞扩增腺病毒，50%组织培养感染量法(TCID50)检测病毒滴度，荧光显微镜观测绿色荧光蛋白(GFP)的表达。结果：成功构建出含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA，转染HEK293A细胞后出现绿色荧光蛋白表达，证明腺病毒载体rAdhVEGFA转染成功，通过反复感染HEK293A细胞获得大量病毒。结论：成功构建含有hVEGFA基因的腺病毒载体rAdhVEGFA

3、，可为缺血性脑血管疾病的基因治疗提供基因载体。【关键词】hVEGFA基因;腺病毒载体;转染;缺血性脑血管疾病　[Abstract]Objective:ToconstructtherebinantadenovirusvectorcontaininghVEGFAgene.Methods:ThehVEGFAgenecodingsequenceidtogetpAdTrackCMVhVEGFA,edintopetentE.coliBJ5183carriedbackboneplasmidpAdeasy1already.Thehomolog

4、ousrebinantadenoviralplasmidplifiedinHEK293Acells.ViralparticleconcentrationinedbyTCID50.Results:Therebinantadenovirusvectoriccerebrovasculardisease′sgenetherapy.　　[Keyiccerebrovasculardisease(ICVD)　　血管内皮生长因子(vascularendothelialgroeⅠ、PacⅠ(NEB公司)，质粒大、小量制备试剂盒(AxyPrep公司);

5、Lipofectamin2000(Invirogen公司)。　　1.2方法　　1.2.1目的基因hVEGFA的克隆　　上海生工生物技术有限公司合成引物，P1:5′CGCAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCTTGG3′;P2:5′AAGCTCGAGTCACCGCCTCGGCTTGTCACA3′。以PCR2.1hVEGFA质粒为模板行PCR，退火温度为60℃，PCR产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳，于长波紫外线透视仪下，切下大小为576bp的hVEGFA的cDNA条带，胶回收hVEGFA的cDNA片段。用普通DNA聚合

6、酶进行加碱基A尾延伸反应后，再用T4DNA连接酶将hVEGFAcDNA与pMDTM18T载体连接，将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂在氨苄青霉素抗性(终浓度为50mg/ml)的LB平板上，置37℃恒温箱培养过夜。从每个培养皿上各挑取2个单克隆菌落分别接种于3ml含氨苄青霉素抗性(终浓度为50mg/ml)的LB培养液中，置37℃恒温摇床(250r/min)培养过夜。试剂盒提取质粒,同时送至上海生物工程公司测序分析。从上、下游两端进行核苷酸全序列分析，其结果经生物信息学分析及BLAST软件分析，以验证重组质粒的正确性。　　1.2.2

7、穿梭质粒pAdTrackCMVhVEGFA的构建　　将pMDTM18T载体hVEGFA用BglⅡ和XhoⅠ双酶切，酶切产物于1.2%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶回收试剂盒回收576bp的酶切产物，溶于蒸馏水备用。同时将穿梭质粒pAdTrackCMV用BglⅡ和XhoⅠ双酶切，酶切产物于0.8%琼脂糖凝胶中电泳，用凝胶回收试剂盒回收10kb的酶切产物，溶于蒸馏水备用。用T4DNA连接酶将以上获得的两个酶切产物进行连接反应。将连接产物转化DH5α感受态细菌，涂在卡那霉素抗性(终浓度为50mg/ml)的LB平板上37℃恒温箱培养过夜

8、。从每个培养皿上各挑取3个单克隆菌落接种于3ml含卡那霉素抗性(终浓度为50mg/ml)的LB培养液中，37℃恒温摇床(250r/min)培养过夜。试剂盒提取质粒,BglⅡ、XhoⅠ双酶切鉴定阳性克隆,同时送至上海生物工程公司测序分析