金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的序列特性分析

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1、金龟子绿僵菌酸性海藻糖酶基因的序列特性分析【摘要】　　目的获得酸性海藻糖酶基因(ATM1)并对其序列进行分析。方法根据已知序列设计引物，PCR扩增出金龟子绿僵菌ATM1的cDNA和DNA序列,对其推导的氨基酸序列基于多序列局部比对和结构的序列比对进行分析。结果ATM1cDNA序列包含开放阅读框(ORF)3219bp,3’端非翻译区(3’UTR)175bp和5’端非翻译区(5’UTR)498bp。结论成功获得ATM1基因，通过序列分析确定出4组保守性功能序列。ATM1基因在CQMal02基因组中为单拷贝。【关键词】真菌；海藻糖酶；序列比对　　海藻糖是一种非还原性二

2、糖，占昆虫血淋巴中糖类80%～90%，在昆虫血液生理中起着重要作用，其耗竭可能对昆虫产生致命性的作用[1]。金龟子绿僵菌（metarhiziumanisopliae，M.a）是一类应用广泛的昆虫病原真菌，在昆虫防治中起着重要作用。M.a侵染进入昆虫血淋巴后，海藻糖成为其生长的主要营养物质，绿僵菌能分泌酸性海藻糖酶，有效降解昆虫血淋巴中的海藻糖。因此酸性海藻糖酶在真菌对昆虫的致病过程中起着重要作用[2]。目前对真菌酸性海藻糖酶的研究只有少数几个物种的酸性海藻糖酶基因被克隆并测定序列[35]。本试验分离克隆M.aCQMal02的酸性海藻糖酶ATM1基因，并进行全序

3、列分析，为构建M.aCQMal02ATM1基因高效表达载体和干扰载体、对酸性海藻糖酶功能的进一步研究和采用基因工程手段改造绿僵菌菌株、提高其杀虫毒力提供理论基础和技术储备。　　1材料和方法　　1.1材料　　1.1.1菌株和质粒M.a菌株CQMa102由重庆大学基因工程中心自罹病竹蝗僵虫体内分离培养纯化获得，中国微生物所菌种保存中心保存（保存编号0877）；质粒pMD18T（日本Takara公司）。　　1.1.2主要试剂PrimeSTARTMDNAPolymerase、3’FullRACECoreSet，SmartTMPCRcDNASynthesisKit（日

4、本Takara公司）；限制性内切酶、牛小肠碱性磷酸酶(CIAP)、T4多核苷酸激酶(T4PNK)、mRNA提取试剂盒和PrimeaGeneLabelingSystem标记试剂盒（美国Promega公司）；HybondN尼龙膜（瑞典Phamarcia公司）；同位素aP32dCTP（北京福瑞生物工程公司）。　　1.2方法　　1.2.1引物设计为获得ATM1基因cDNA的3’端和5’端序列，采用了3'RACE和SMART5'RACE法(rapidamplificationofcDNAends)法，根据本实验室已获得的M.a酸性海藻糖酶部分肽段测序结果，设计引

5、物如下：　　AT631F　　上游：5’AATGTGGACAGCATCTCGGTTTGGAV3’　　AT948F　　上游：5’TATCGTTTGTCAACCAACTCGTCGCG3’　　　　反转录引物　　S3：5’CAGTTCTGGTGATCC3’　　S4（下游）：5’TGGCGCTGCAAAGACCGAGAG3’　　S5（下游）：5’TTGATGGGCTCGCGAGTT3’　　为获得ATM1基因DNA序列，根据ATM1基因全长cDNA序列设计一对特异引物E1、E2，PCR扩增出ATM1DNA序列。　　E1(上游)：5’GTTGTCCCGGTG

6、GCATTTGCTT3’　　E2(下游)：5’CATGTGATGGCCACTCCT3’　　1.2.2总DNA和mRNA的提取将M.a孢子106接种于20mL1／4SDA(1／4StrengthSabouraudsDextroseAgar)培养液，180r／min离心，26～28℃培养60h，10000r／min离心5min，沉淀菌丝，无菌水冲洗2次，提取M.aCQMal02总DNA。　　将M.aCQMa102孢子106接种于酸性海藻糖酶产酶诱导培养液中[可溶性淀粉10g/L,海藻糖10g/L,硫酸铵2g/L,氯化钾1g/L,五水硫酸镁0.5g/L,磷酸二

7、氢钾1g/L,2（N吗啉）乙基磺酸10g/L,微量元素（0.1%七水硫酸亚铁，0.3%五水硫酸锌）10mL/L,pH调至6.0～6.1]培养60h后，收集M.aCQMa102新鲜菌丝，无菌水冲洗2次，加入液氮研磨成粉末，称取约50mg菌丝粉末，用试剂盒提取mRNA。提取过程参照试剂盒说明书进行。　　1.2.3克隆ATM1基因5’端和3’端cDNA序列根据M.aCQMal02酸性海藻糖酶已知的肽段测序结果，设计一条反转录引物S3和2条嵌套式PCR引物S4及S5，以M.aCQMal02mRNA500ng为模板，按照5’FullRACECoreSet描述的操作

8、程序进行,首先以S3为反