ev71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定

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1、EV71病毒特异性单克隆抗体的筛选及鉴定：李静,蔡芳,高强,王宾【摘要】目的:筛选高亲和力和高中和活性的抗EV71病毒的单克隆抗体(mAb),并对其特异性和抗原表位进行鉴定。方法:采用葡萄球菌A蛋白亲和层析法纯化mAb,并进行抗体的中和效价、交叉反应性以及表位进行分析。结果:筛选出1株抗EV71病毒的mAb,纯度大于95%,抗体滴度达到10-7,对EV71病毒具有广谱中和特性,与CA16无交叉反应,为VP1特异性,并识别EV71的构象型表位。结论:筛选出1株具有高亲和力和中和活性的EV71病毒的mA

2、b,为研制EV71病毒感染性疾病的诊断试剂提供了重要工具,并为研制治疗性mAb提供了条件。【关键词】EV71;单克隆抗体;中和活性肠道病毒71型（EV71）是人肠道病毒的一种,其感染性强且致病率高,对中枢神经系统的侵害尤其严重［1］。EV71与A组柯萨奇病毒（CoxAl6型,CA16）是引起手足口病的主要病原体。手足口病是全球性传染病,近年来手足口病已经成为越来越威胁国内外儿童健康的广泛流行性疾病之一。为指导全国各地做好手足口病的预防控制,2008年卫生部发布《手足口病预防控制指南》;规定自2008

3、年5月2日起,手足口病纳入丙类传染病管理。EV71病毒为小RNA病毒科、肠道病毒属。引起的手足口病预防控制难度大,目前针对EV71引起疾病的疫苗、特异性治疗药物等防控手段尚在研制中。高质量的EV71单克隆抗体（mAb）有可能用于研制治疗性mAb、EV71患者血清学诊断以及EV71病毒疫苗的抗原含量的检测,因此具有重要的应用价值。我们在本实验中筛选了多批EV71mAb,并对其生物学特性进行了比对研究。1材料和方法1.1材料抗EV71病毒mAb腹水由北京科兴生物制品有限公司提供,共12个克隆,编号No.

4、1-No.12。PEG2000购自Sigma公司。MicroBCATMProtein购自PIERCE公司,HRPGAMIgG购自JacksonImmuNoresearch。其他试剂由北京科兴生物制品有限公司提供。Gel200凝胶成像仪购自Kodak公司。1.2方法1.2.1mAb的腹水效价测定采用间接ELISA法［2］。纯化后的EV71病毒抗原用0.01mol/LPBS1∶100稀释,包被于酶标板,4℃过夜;以含100mL/L小牛血清、10g/L酪蛋白、100g/L蔗糖(北京科兴生物制品有限公司提

5、供)的0.01mol/LPBS溶液封闭。mAb腹水用0.01mol/LPBS溶液10倍系列稀释后加入酶标板反应,酶标二抗为HRPGAMIgG,用TMB显色,读取A450值。BALB/c小鼠阴性血清作为阴性对照。以阴性对照A值的2.1倍作为阈值,来判定mAb腹水的效价。1.2.2mAb腹水的纯化将mAb腹水采用葡萄球菌A蛋白（SPA）亲和层析法纯化［3］,并用PEG2000浓缩纯化后mAb;采用MicroBCATMProteinAssayKit检测纯化抗体蛋白浓度;常规还原型SDSPAGE分析纯度

6、,分离胶浓度120g/L,浓缩胶浓度50g/L,Gel200凝胶成像仪扫描电泳胶分析纯度。1.2.3mAb的中和效价测定采用细胞培养法。将mAb腹水10倍系列稀释,与A、B、C3种基因型的EV71病毒混和37℃2h后,接种于Vero细胞,培养7d,观察细胞病变,计算mAb腹水对EV713种基因型病毒的中和效价。1.2.4交叉反应采用点杂交法（Dotblot法）。mAb腹水用50g/L脱脂奶粉1∶1000稀释后,分别与EV71病毒液、CoxAl6型病毒液进行dotblot试验。抗原（2μL/点）点

7、样于硝酸纤维膜,风干后将膜于50g/L脱脂奶粉中室温封闭2h,将膜转移到稀释mAb中室温摇动反应2h,洗膜3遍,将膜转移到1∶2000稀释的APGAM中,室温摇动反应1.5h;洗膜,碱性磷酸酶底物显色。1.2.5mAb的表位分析采用Dotblot法。EV71No.6底物mAb腹水稀释后,分别与EV71病毒液、基因重组EV71病毒VP1、VP2和VP3蛋白进行Dotblot试验。阴性对照采用无关mAb腹水。2.3中和试验结果表1显示了3株mAb对于EV71病毒的中和活性,No.2、No.3对EV

8、71病毒无中和活性。No.6mAb对EV71病毒A、B和C3种基因型均有中和效果,说明其具有广谱性;No.6mAb对EV71病毒A、B和C3种基因型的中和效价≥5120。2.4交叉反应结果采用点杂交法对No.6mAb进行交叉反应,结果表明No.6mAb与CoxA16型病毒液无交叉反应,仅与EV71病毒液反应,说明No.6mAb是针对EV71,特异性好。2.5mAb识别的表位分析采用点杂交法对No.6mAb进行表位分析。识别No.6mAb仅与未变性的重组EV71VP1蛋