抗ptdbcr-abl单克隆抗体的制备及鉴定

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1、抗PTDbcr/abl单克隆抗体的制备及鉴定【关键词】PTDbcrabl融合蛋白单克隆抗体制备PTDbcr/abl是一种利用基因工程合成的融合蛋白［1,2］。其中PTD（蛋白转导结构域）是人类免疫缺陷病毒（HIV）1所编码的反式激活蛋白TAT的一段多肽片段,具有独特的跨膜转运方式,其特点是转导速度快,效率高。SchAb特异性强,效价高,可用于PTDcr/abl融合蛋白的进一步研究。　　1材料和方法　　1.1材料　　大肠杆菌BL21购自Navagene公司。表达PTDbcr/abl融合蛋白的质粒p

2、ET16bPTDbcr/abl、HL60、K562细胞株由本室构建保存;BALB/c小鼠由第四军医大学实验动物中心提供;免疫组化试剂盒(链亲和素抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化超敏试剂盒)购自迈新公司;小鼠IgG亚类快速定性试纸购于法国Argen公司;HRP标记山羊抗小鼠IgG抗体(由华美生物提供);免疫球蛋白标准亚类试剂购自Sigma公司。　　1.2方法　　1.2.1PTDbcr/abl融合蛋白的表达与纯化　　质粒pET16bPTD与质粒pET16bPTDbcr/abl的制备按照文献［1

3、］进行。用pET16bPTDbcr/abl转化大肠杆菌BL21,取阳性克隆培养扩增,用IPTG进行诱导表达后收集菌体,PBS悬浮,超声裂菌,并用8mol/L脲溶解蛋白,用8mol/L脲（pH值分别是8.0、6.3、5.9、4.5）在NiNTAagarose柱上对蛋白进行亲和层析。收集pH为4.5及5.9的洗脱液,用4mol/L脲、2mol/L脲、1×PBS/1mol/LNaCl、1×PBS/0.5mol/LNaCl、1×PBS进行透析后冻干。从中取10mg干粉溶于2mL三蒸水中,取20μL,加入20

4、μLloadingbuffer,100℃煮沸10min,进行120g/LSDSPAGE电泳,成为蛋白胶。　　1.2.2小鼠免疫　　按参考文献［4］进行。取蛋白胶（含蛋白1‰）40mg与125μL完全福氏佐剂,125μLPBS充分研磨后,背部皮下多点注射免疫BALB/c小鼠。2周后用蛋白胶（含蛋白1‰）40mg与125μL不完全福氏佐剂,125μLPBS充分研磨后,皮下多点注射,连续3次,每次间隔2周,第3次免疫后14d,用PTDbcr/abl纯化蛋白50μg/500μL小鼠腹腔注射,加强免疫1次,3d后

5、取小鼠脾脏待用。　　1.2.3细胞融合　　取免疫小鼠脾细胞与Sp2/0细胞按10∶1的比例,在500g/L(L/LCO2孵箱培养,7d后改用HT培养基培养。　　1.2.4阳性克隆筛选及克隆化培养　　采用间接ELISA法做交叉筛选。将PTDbcr/abl融合蛋白和HisTaxreb107(另一带有His标签的蛋白,文章另发)(对照孔)稀释为10mg/L,包被96孔酶标板,100μL/每孔,4℃包被过夜,次日用10g/LBSA120μL/孔封闭后,分别取待测杂交瘤上清液100μL加入PTDbcr/abl融

6、合蛋白和HisTaxreb107包被板中,4℃过夜;用PBSTol/LH2SO4终止反应。置酶标仪450nm波长测量A值,A450值大于阴性对照孔2.1倍以上为阳性,选取PTDbcr/abl融合蛋白阳性而HisTaxreb107阴性的孔细胞,采用有限稀释法进行亚克隆,至所有杂交瘤上清液均呈阳性为建株标准。　　1.2.5mAb的制备及纯化　　每只BALB/c小鼠腹腔内注入0.5mL液体石蜡,1周后将阳性杂交瘤细胞注入小鼠腹腔内,5×106杂交瘤细胞/只。大约7～10d后收集腹水,按常规经饱和硫酸铵盐析

7、、ProteinG亲和层析进行纯化。用紫外分光光度法测定其浓度,加入终浓度为0.1g/L叠氮钠防腐,直接分装,-20℃保存。　　1.2.6mAb的效价测定　　以PTDbcr/abl融合蛋白为包被抗原,包板方法同上,将纯化抗体作4倍比稀释,按ELISA法常规测定其A450值,以测定孔A450值≥阴性孔A450值2.1倍为阳性,计算其效价。　　1.2.7mAb亚类鉴定　　1.2.9细胞免疫组织化学染色检测　　制备含PTDbcr/abl融合蛋白的HL60、K562细胞方法见参考文献［1］。取细胞HL60、K

8、562及含PTDbcr/abl融合蛋白的HL60、K562各5×105甩至用APES处理过的玻片,依次用过氧化物酶阻断液,1/500mAb,生物素标记的羊抗鼠抗体,链亲合素-过氧化物酶相作用,加入显色液,镜下显色10min。　　2结果　　2.1PTDbcr/abl融合蛋白的诱导表达及纯化　　用pET16bbcr/abl表达质粒转化大肠杆菌BL21,培养后用IPTG进行诱导,SDSPAGE分析表明,用pET