致敏树突状细胞抗乳腺癌作用的实验研究的论文

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1、致敏树突状细胞抗乳腺癌作用的实验研究的论文作者：黄宏思，黄卫彤，秦静英，黄衍强【摘要】目的探讨负载肿瘤抗原dc诱导的ctls对乳腺癌细胞的杀伤作用。方法以负载肿瘤细胞抗原的dcs体外诱导ctls，用elisa法检测ifn-γ和il-12的表达水平，用ldh法检测ctl对乳腺癌细胞的杀伤作用。结果负载肿瘤抗原dc组ifn-γ和il-12的浓度高于未致敏dc组、抗原组及单核细胞对照组(p＜0.05)，且负载抗原dc组所刺激的ctls的杀伤作用也强于未致敏dc组、抗原组及单个核细胞组(p＜0.01)及对照的ht-29组

2、(p＜0.01)。结论采用乳腺癌细胞冻融抗原体外致敏dc，诱导产生肿瘤抗原特异性ctls具有显著的抑瘤效应，实验证明致敏dc治疗乳腺癌是一种有效的方法，有望成为乳腺癌免疫治疗的新疗法。【关键词】乳腺癌；树突状细胞；细胞毒性t细胞乳腺癌是危害妇女健康的主要恶性肿瘤，全世界每年约有120万妇女新发乳腺癌，占女性所有肿瘤的18%。乳腺癌总的5年生存率约50%～60%，近50%患者治疗后出现复发转移。晚期乳腺癌患者平均生存时间仅18～30个月。.人们一直在努力发展新的治疗策略以降低乳腺癌的复发和转移，提高患者生活质量并尽

3、可能延长乳腺癌患者的生存期［1］。生物治疗是近年来发展迅猛的又一重要治疗手段。目前的研究表明，树突状细胞（dc）激活的细胞毒性t淋巴细胞（ctls）介导的免疫反应在机体抗肿瘤免疫反应中发挥重要作用［2，3］。本研究应用冻融法获取乳腺癌细胞抗原致敏dc，观察其诱导的ctls对乳腺癌细胞的杀伤作用，探讨dc疫苗用于乳腺癌患者免疫治疗的可行性。　　1材料　　人乳腺癌细胞株mcf-7、人结肠癌细胞株ht-29购自中国医学科学院肿瘤医院。rhgm-csf、rhil-4、rhtnf-a为美国biosouce公司产品。人il-

4、12、ifn-γelisa试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司。ficoll-hypaque淋巴细胞分离液购自天津灏扬生物公司。乳酸脱氢酶测试盒为美国sigma公司产品。　　2方法　　2.1mcf-7人乳腺癌细胞冻融抗原的制备常规培养mcf-7人乳腺癌细胞，收集并调整浓度为3×107个/ml快冻慢溶反复4次，5000r/min离心20min后取上清液经微孔滤膜过滤作为肿瘤抗原，4℃保存备用。　　2.2树突状细胞的培养从健康者外周血中分离单个核细胞（pbmc），培养获得贴壁的dc前体细胞，接种于96孔细胞培养板中培养

5、，分为a、b、c3组，其中a、b组均加入rhgm-csf800u/ml，rhil-4的1000u/ml和tnf-α10ng/ml，c组不加任何细胞因子。至第3天只在a组中加入冻融法获取的肿瘤抗原50μl/ml。继续培养，第9天消化，分别收集3组细胞并计数。　　2.3细胞毒性t淋巴细胞（ctl）的体外诱导ficoll-hypaque密度梯度离心获得健康者外周血pbmc，用自制的尼龙毛柱进行分离获取t淋巴细胞，用完全培养基调整细胞浓度为2×105/ml。置于96孔培养板中，每孔1ml。分为a、b、c、d4组:前3组分

6、别加入上述收集的a、b、c组细胞（效应细胞与刺激细胞比为40：1），第4组（d组）加入冻融抗原50μl，每组8个复孔。共同孵育4d后，部分复孔进行杀伤活性的测定。剩余复孔细胞继续培养至第6天进行ifn-γ，il-12的检测。　　2.4ctls对乳腺癌细胞的杀伤作用将mcf-7，ht-29细胞接种于96孔板中，均分为4组，分别加入以上a、b、c、d组ctl（效靶比40∶1），每组3个复孔，同时设立与实验组对应的同浓度的效应细胞和靶细胞为对照，于培养箱中培养。24h后离心，取上清液100μl于4mleppen-dor

7、f管中，按照试剂盒所示方法用乳酸脱氢酶释放法检测细胞毒活性。　　2.5ifn-γ，il-12的检测取上述体外诱导至第6天的ctls细胞上清液每孔100μl，按晶美公司elisa检测试剂盒所示方法测定ifn-γ和il-12含量。　　2.6统计学方法实验数据用±s表示，应用spss12.0统计软件统计分析。组间比较采用t检验，p＜0.05为差异有统计学意义。　　3结果　　3.1细胞因子ifn-γ和il-12的检测乳腺癌细胞裂解物致敏后的dc与淋巴细胞一起培养，细胞因子ifn-γ和il-12的含量比未致敏dc组、单纯乳

8、腺癌细胞裂解物组和单个核细胞对照组高（p＜0.05）。表1细胞因子ifn-γ和il-12的检测结果（略）　　3.2ctls杀伤活性的检测肿瘤抗原致敏dc组诱导的ctls对靶细胞的杀伤活性优于未致敏dc组及单核细胞组、单纯抗原组（p＜0.01）。且其对乳腺癌肿瘤细胞（mcf-7）的杀伤活性也明显优于对非乳腺癌肿瘤细胞（ht-29）的杀伤活性(p＜0.01)，见表2。说明肿瘤