猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5截短蛋白的表达及其elisa抗体检测方法的初步建立

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1、河南农业大学硕士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5截短蛋白的表达及其ELISA抗体检测方法的初步建立姓名：王寅彪申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：张改平201205中文摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus，PRRSV)是有囊膜的单股正链RNA病毒；分为欧洲型和美洲型，分别以Lelystadvirus(LV)株和VR．2332株为代表。1991年，PRRSV首次在欧洲从患病猪的肺泡巨噬细胞中被分离出来，1年后在美国被分离出来。1996年，哈尔滨兽医研究所在国内首次分离到PRRSV；200

2、6年，我国十几个省流行一种严重的生殖道疾病，称为无名高热，被证实是一种由新型毒力更强的PRRSV毒株引发的。PRRSV编码的主要结构蛋白有GP5蛋白、M蛋白和N蛋白：GP5蛋白位于病毒粒子表面，参与PRRSV对靶细胞的粘附。GP5在体内和体外，对病毒中和都具有重要作用，是良好的疫苗和诊断试剂侯选靶标。本研究采用OE．P(永将PRRSV-ORF5的跨膜区基因去除，构建了缺失跨膜区的重组质粒pET-GP5。在370C，以IPTG终浓度为0．6mM诱导6h，PRRSV-GP5截短蛋白在火肠杆菌BL21(DE3)qb以包涵黼；式实现了高效表达。采用Ni-N1’A亲和柱纯化，获得了16kD

3、a的变性PRRSv-GP5截短蛋白。Westernblot表明GP5截短蛋白能与PRRSV猪阳性血清及抗His单抗发生特异性反应；采用尿素梯度透析复性后，ELISA实验表明GP5截短蛋白能与PRRSVHN07一l株阳性血清和经典的BJ．4株阳性血清发生特异性反应，且HN07．1株阳性血清可检测到的最低蛋白含量达O．1251xg／mL；免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)和间接免疫荧光实验(IFA)证实GP5截短蛋白免疫后的小鼠血清能识别天然的PRRSV病毒，证明了表达的GP5截短蛋白具有良好抗原性。以截短的PRRSV-GP5截短蛋白作为检测原建立了PRRSV血清抗体间接ELIS

4、A检测方法。优化了ELISA的工作条件，确定抗原包被浓度为2．5p4；／mL，5％脱脂奶为最佳封闭液，待检血清l：400稀释，其最佳反应时间为45min，酶标二抗最佳稀释度为1：2000，其最佳反应时间为30min，最佳显色时间为5min，以X+3SD=0．26作为阴阳性判定的临界值。该方法与IDEXXHerdChek*P褂遇2XRELISA商品化试剂盒的符合率为77．1％。特异性实验表明：建立的ELISA方法不与PCV、CSFV等阳性血清发生交叉反应。此方法的建立对PRRSV的临床监测、疫苗效力、仔猪母源抗体检测及免疫保护力的评价具有重要意义。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；G

5、P5截短蛋白；间接ELISAVlAbs订actAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isasingle-stranded，non．segmented，positive—senseandenvelopedRNAvirus，possessingtwodistinctgenotypes：European(typeI)andNorthAmerican(typeII)，representedbyLelystadvirusfLV)andVR．2332respectively．Itwasisolatedandc

6、haracterizedforthefirsttimeinEuropeinl991and1yearlaterintheUnitedStates．InChina,PRRSVwasfirstedisolatedin1996；2006haswitnessedanovelandhighvirulentPRRSVspreadingacrossseveralprovincesinChina，causinghugeeconomiclosses．Inthisstudy,transmembranesequenceslocatedinthemiddleofGP5proteinwassuccessfu

7、llydeletedthroughOE-PCR．TheremainedGP5geneswereligatedtogetherthroughaflexiblelinker,andtheninsertedintopET28a(+)andexpressedinEcoli．RecombinanttruncatedGP5proteinwasabout16kDaandexistedmainlyasinclusionbodies．Westernblotindicatedthetruncated