猪繁殖与呼吸综合征病毒gp5截短蛋白的表达及其elisa抗体检测方法的初步建立

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河南农业大学硕士学位论文猪繁殖与呼吸综合征病毒GP5截短蛋白的表达及其ELISA抗体检测方法的初步建立姓名：王寅彪申请学位级别：硕士专业：预防兽医学指导教师：张改平201205 中文摘要猪繁殖与呼吸综合征病毒(PorcineReproductiveandRespiratorySyndromevirus，PRRSV)是有囊膜的单股正链RNA病毒；分为欧洲型和美洲型，分别以Lelystadvirus(LV)株和VR．2332株为代表。1991年，PRRSV首次在欧洲从患病猪的肺泡巨噬细胞中被分离出来，1年后在美国被分离出来。1996年，哈尔滨兽医研究所在国内首次分离到PRRSV；2006年，我国十几个省流行一种严重的生殖道疾病，称为无名高热，被证实是一种由新型毒力更强的PRRSV毒株引发的。PRRSV编码的主要结构蛋白有GP5蛋白、M蛋白和N蛋白：GP5蛋白位于病毒粒子表面，参与PRRSV对靶细胞的粘附。GP5在体内和体外，对病毒中和都具有重要作用，是良好的疫苗和诊断试剂侯选靶标。本研究采用OE．P(永将PRRSV-ORF5的跨膜区基因去除，构建了缺失跨膜区的重组质粒pET-GP5。在370C，以IPTG终浓度为0．6mM诱导6h，PRRSV-GP5截短蛋白在火肠杆菌BL21(DE3)qb以包涵黼；式实现了高效表达。采用Ni-N1’A亲和柱纯化，获得了16kDa的变性PRRSv-GP5截短蛋白。Westernblot表明GP5截短蛋白能与PRRSV猪阳性血清及抗His单抗发生特异性反应；采用尿素梯度透析复性后，ELISA实验表明GP5截短蛋白能与PRRSVHN07一l株阳性血清和经典的BJ．4株阳性血清发生特异性反应，且HN07．1株阳性血清可检测到的最低蛋白含量达O．1251xg／mL；免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)和间接免疫荧光实验(IFA)证实GP5截短蛋白免疫后的小鼠血清能识别天然的PRRSV病毒，证明了表达的GP5截短蛋白具有良好抗原性。以截短的PRRSV-GP5截短蛋白作为检测原建立了PRRSV血清抗体间接ELISA检测方法。优化了ELISA的工作条件，确定抗原包被浓度为2．5p4；／mL，5％脱脂奶为最佳封闭液，待检血清l：400稀释，其最佳反应时间为45min，酶标二抗最佳稀释度为1：2000，其最佳反应时间为30min，最佳显色时间为5min，以X+3SD=0．26作为阴阳性判定的临界值。该方法与IDEXXHerdChek*P褂遇2XRELISA商品化试剂盒的符合率为77．1％。特异性实验表明：建立的ELISA方法不与PCV、CSFV等阳性血清发生交叉反应。此方法的建立对PRRSV的临床监测、疫苗效力、仔猪母源抗体检测及免疫保护力的评价具有重要意义。关键词：猪繁殖与呼吸综合征病毒；GP5截短蛋白；间接ELISAVl Abs订actAbstractPorcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus(PRRSV)isasingle-stranded，non．segmented，positive—senseandenvelopedRNAvirus，possessingtwodistinctgenotypes：European(typeI)andNorthAmerican(typeII)，representedbyLelystadvirusfLV)andVR．2332respectively．ItwasisolatedandcharacterizedforthefirsttimeinEuropeinl991and1yearlaterintheUnitedStates．InChina,PRRSVwasfirstedisolatedin1996；2006haswitnessedanovelandhighvirulentPRRSVspreadingacrossseveralprovincesinChina，causinghugeeconomiclosses．Inthisstudy,transmembranesequenceslocatedinthemiddleofGP5proteinwassuccessfullydeletedthroughOE-PCR．TheremainedGP5geneswereligatedtogetherthroughaflexiblelinker,andtheninsertedintopET28a(+)andexpressedinEcoli．RecombinanttruncatedGP5proteinwasabout16kDaandexistedmainlyasinclusionbodies．WesternblotindicatedthetruncatedGP5proteincouldreactspecificallywithpigpositiveserumagainstP剐RSVandanti—His6mAb，respectively．Afterrecoveringfrominclusionbodiesthroughnickelaffinitypurificationandrefoldingbygradientdialysis，thetruncatedGP5proteinshowedhighspecificreactiontoPRRSVpositiveseruminELISAandwasusedtoimmunizeBALB／cmice．BothIPMAandIFAindicatedthatmousepolyclonalantibodycouldreactapparentlywithPRRSV-infectedcellsasdidpigpositiveserumagainstPRRSV．Thus，thetruncatedGP5wasdemonstratedtohavesoundimmunogenicity．Besides．anindirectELISAbasedontruncatedGP5wasestablishedtomonitorvaccineefficacyintheclinics．Theoptimalantigencoatingconcentrationwasdeterminedat2．5I．tg／mL；5％skimmedmilkwasdemonstratedtobethebestblockingbuffer；theoptimaldilutionofserumsampleswasdeterminedat1：400andtheirincubationtimewasoptimizedtobe45min．Theoptimaldilutionofconjugatewasdeterminedat1：2000anditsoptimalincubationtime30min．Theoptimaltimeforcolordevelopmentwas5min．andO．26wasdeterminedasthecut-offvalue．ThecoincidenceratebetweenGP5basedELISAandIDEXXHerdChek奉PRRS2XRELISAKitwas77．1％．InthisestablishedELISA，GP5showednocross—reactionwithpositiveseraofPCVandCSFV．Keywords：PRRSV；TruncatedGP5protein；IndirectELISAVII 致谢致谢本课题研究是在导师张改平院士的严格要求和悉心指导下完成的，张老师在选题、实验方案设计到实验过程中遇到问题的分析和解决等方面都给予了启发性的指导和帮助。在三年的学习过程中，导师渊博的学识、科学的思维方式、广阔的思想、精益求精的治学态度、开拓创新的进取精神，不仅培养了我对科学研究的热情和兴趣，更让我学会了做人要有宽广的胸怀和广阔的气度。尤其是他崇高的敬业精神、忘我的工作作风和不懈的执着追求，给我树立了学习的榜样，将使我终生受益；在此表示深深的敬意和由衷的感谢!本研究工作在河南省动物免疫学重点实验室开展，感谢实验室提供优良的实验条件、学习机会和工作环境。研究过程中得到了郭军庆研究员的指导，郭老师严谨的科研态度和科研作风对我产生了深深的影响，在此衷心感谢郭老师在实验研究和论文撰写及生活中给予的悉心指导和特别帮助。非常感谢邓瑞广研究员、周玲女士在实验研究和生活中的关心和帮助。感谢李学伍研究员、杨艳艳研究员、肖治军研究员、乔松林副研究员、罗俊副研究员、郝慧芳副研究员、郅玉宝副研究员、职爱民副研究员和李青梅副研究员在实验过程中的交流与探讨。感谢卢清侠、邢广旭、藤蔓、王丽、杨苏珍、赵东、柴书军、杨继飞、王方雨、樊剑鸣、史西保、王建中、刘庆堂和张丽等各位老师在生活中各个方面给予的帮助和大力支持。感谢河南农业大学牧医工程学院崔保安教授、宁长申教授、王川庆教授、赵军教授、夏平安教授、菅复春副教授、张光辉副教授、杨霞老师、陈丽颖老师、陈红英老师、李新生老师、张红英老师、魏战勇老师、陈陆老师和杨明凡老师等在学习期间给予的支持和帮助。感谢农业部动物免疫学重点开放实验室师兄李鹏博士后、金前跃博士、刘运超博士、万博博士、赵朴博士、鲍登克博士、冯华硕士、王林林硕士、杜晓明硕士、王大伟硕士、刘明硕士、鄂巍硕士和王兴涛硕士；师姐姬向波博士、迟佳琦博士、余祖华博士、宋春美博士、刘珍博士、宋幸辉硕士、王睿硕士、赵丽娜硕士和孙亚宁硕士；感谢实验室同学王志红、王蕊、蒋志政、赵启法、刘永晖、薛白、王倩倩、李培培、王耀、张小辉、龚芳、裴亚峰、王树芬和李靓及师弟师妹陈静、陈稳、陈玉梅、禹乐乐、王坤、刘明阳、王世红、范璐璐、李文君、王玲玲、贾俊杰、刘畅、常永哲、胡博和宿靖伟等在生活中给予的帮助及在实验期间给我带来的欢乐和美好回忆。感谢我的同学河南农业大学牧医工程学院刘雨丰、陈礼朋、岳旭龙、张九州、马攀攀、张祥、史亚东、袁林、王亚丹、何俊丹、李梦婕、李昆明、张云、朱丹、胡刚叶、姜涛、宋丹、苗银萍、李乔晶、秦佳晨、陈静、张宜娜、周欣、刘玲玲、吕文强、杜海利、解金辉和任卫青等所有同学在文献查阅过中提供的帮助，在学 致谢习和生活中对我的关心和照顾并及时帮我传递学校最新信息。感谢参加我论文评阅和答辩的各位专家教授的指导。深深感谢我的父母含辛茹苦的养育之恩及亲戚、朋友多年来对我学业和生活上无私的支持、鼓励和关怀。再次感谢所有关心、支持、帮助我的领导、老师、同事和亲友。王寅彪2012年5月 河南农业大学2012届硕士学位论文1病原学第一部分文献综述猪繁殖与呼吸综合征(Porcinereproductiveandrespiratorysyndrome，PRRS)是世界范围内最重要的猪病之一，给养猪业造成了极大的经济损失。该病以怀孕母猪妊娠后期繁殖障碍及猪群呼吸困难为主要特征【ll。临床表现为母猪繁殖障碍，呈现死胎、流产、木乃伊胎及弱仔等症状；仔猪及育成猪表现为呼吸系统症状；此病经典但不常出现的特征是“猪蓝耳”。1992年，世界动物卫生组织(OfficeInternationalDesEpizooties，OIE)将PRRS列为B类动物疾病。PRRS是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcinereproductiveandrespiratorysyndromevirus，PRRSV)引起的；1987年PRRS最早出现予美国；1991年，PRRSV首次在欧洲从患病猪的肺泡巨噬细胞(PorcineAlveolarMacrophages，PAM)中被分离出来，1年后在美国被分离出来驻'31。PRRSV是一种较小的、有囊膜的RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)，动脉炎病毒属(Arterivirus)；同科的还有马传染性动脉炎病毒(Zquinearteritisvirus，EAV)、鼠乳酸脱氢酶病毒(Lactatedehydmgenase-elevatingvirus，LDV)及猴出血热病毒(Simianhemorrhagicfevervirus。SHFV)1241。根据病毒基因型不同，PRRSV被分为欧洲型及美洲型，分别以LelystadviruS(LV)株和VR．2332株为代表14'引。虽然I，v株和VR．2332株基因组存在40％的差异，却造成相似的临床症状【61。1996年，哈尔滨兽医研究所在国内首次分离到PRRSV，证实本病在国内存在【71。2006年，我国十几个省』“泛流行一种严重的生殖道疾病，称为无名高热，被证实是一种由新弛毒力更强的PRRSV毒株引起的18'91。PRRSV病毒粒子呈球形，直径约为48nm．83nm；其核衣壳直径约为25rim-30nm，外绕脂质双层膜，为一球形立体对称且具电子致密性的二十面体核衣壳；表面有明显突起；用氯仿或乙醚等脂溶剂处理可灭活PRRSV，证明PRRSV病毒粒子存在囊膜。PRRSV在氯化铯中浮密度为¨9，在蔗糖中浮密度为1．14：不能凝集哺乳动物如猪、羊、牛、鼠、马、鸭、鸡、兔及人O型红细胞；对热不稳定，在40C以上逐渐失去感染性，560C经15min．20min失活IⅢ1。2PRRSV的分子生物学特性2．1PRRSV基因组特征PRRSV基因组长度约15kb，含有9个开放阅读框(ORF)。基因组5，端有帽子结构；3，端有多聚A结构。与其他动脉炎病毒一样，PRRSV基因组也为多顺反子结构；含有两个大的开放阅读框(ORFla和ORFIb)且在ORFlb下游含有6到9个成套式的开放阅读框。因为大多结构蛋白的基因在末端重叠，所以PRRSV基因组是复杂且极其紧凑的。ORFIa和ORFIb占基因组大小的80％左右，编码两个较大的病毒复制多聚蛋白ppla和pplab；这两个蛋白由 河南农业大学2012届硕士学位论文四种蛋白酶切割为14个非结构蛋白，主要参与病毒基冈组复制及距基|天I组mRNA转录。ORF2a、ORF2b及ORF3-7分别编码病毒结构蛋白：GP2a、E＼GP2b、GP3、GP4、GP5、M及N蛋白⋯1。GenomePRRSVLeaderRNAPoIymeraseStructuraIgenes0RF“。。—。卞●。。。—。。'___———■—I——I{。-土J’、b，，止148L_J_。__尸—L—L—JII_-尸lL—u。ll_-严·LL_———一量—■●●一■图卜1PRRSV基因组结构及其编码的主要蛋白Fjg．1—1PRRSVgenomestructureanditsmajorprotejrts2．2PRRSV主要蛋白的作用RNAl234567PRRSV的ORFI编码RNA依赖的RNA聚合酶，后被切割成1卜结构蛋白：其主要结构蛋白为GP5蛋白、M蛋白和N蛋白，分别由ORF5．7编码；由ORF2．4编码的GP2、GP3及GP4蛋白属丁．次要结构蛋白【31。纳尔逊等【坨1研究了猪体对关国株PRRSV体液免疫的动态学特征，发现猪体最早产生的是针对N蛋白的抗体，其次是针对M蛋白的抗体，之后针对是GP5蛋白的抗体。N蛋白是病毒粒子中含鼙最丰寓且免疫原性较强的成分，以二聚物形式存在。与其他动脉炎病毒一样，PRRSV的N蛋白是其最基本的蛋白；分子鼙较小，约在14．15kDa：欧洲株PRRSV的N蛋白含有128个氨基酸，美洲株PRRSV的N蛋白含有123个氨基酸I41。它能够在感染的细胞中人量表达，SDS．PAGE及Westernblot分析得知N蛋白IIl‘病毒粒子蛋白成分的20％．40％㈣。ORF6编码的1卜糖基化的M蛋白是动脉炎病毒最保守的结构蛋白；分子量约为18．19kDa。与冠状病毒的M蛋白相比，PRRSV的M蛋白的N端跨膜二次且仅在病毒粒子表面留一段短至10．18个氨基酸的序列‘141。与EAV利LDV一样，PRRSV的M蛋白在感染细胞的内质网聚集，与GP5蛋向通过二硫键交联形成异源二聚体。在PRRSV感染的细胞内，同样存在着二硫键交联的M／M蛋白同源二聚体，但此二聚体并不存在丁病毒粒子‘”I。在EAV中，也有同样的现象出现【16】。LDV的GP5蛋白与M蛋白分子内二硫键的断裂会降低感染力，尚不清楚PRRSV是否也是如此I"J。GP5蛋白是PRRSV主要的囊膜蛋白，分子量约在24．5—26kDa；跨膜3次；在信号肽脱离后，仅留大约30个氨基酸左右的胞外l又：丁．膜外与M蛋白的胞外区通过二硫键交联【19'2m31。2 河南农业大学2012届硕士学位论文尽管美洲株及欧洲株PRRSV基因组存在明显差异，但两者ORF5编码的蛋白在亲水性方面十分相似【24。261。先前研究报道称GP5蛋白上含有与病毒中和相关的表位㈣；且在美洲株与欧洲株GP5胞外区均有中和表位12”01。PRRSV的GP5蛋白是与中和抗体及保护力产生相关的主要病毒蛋白，而M蛋白被认为是与强烈的细胞免疫相关。美洲株及欧洲株PRRSV均能在易感的猴肾细胞及PAM细胞原代培养物中诱导细胞凋亡【19’20l，这一特性主要是由GP5蛋白引起的，因为在COS．1及BSC40细胞中用牛痘病毒表达ORF5，导致了强烈的与细胞凋亡相关的细胞毒作用。GP5诱导的细胞调亡作用并不能被恒定表达抗凋亡蛋白Bcl．2的细胞系阻断，表明作用靶标可能存在于Bcl．2下游或使用其它未知的凋亡途径【191。瞬时表达实验证实GP5蛋白能够诱导凋亡的部分位于前118个氨基酸残基；其C端区域对凋亡不起作用I引】。在体内，PRRSV不仅在肺部及淋巴组织诱导细胞凋亡120l；而且在睾丸内的巨噬细胞和生殖细胞中复制，通过凋亡细胞造成大量生殖细胞损耗及死亡1221。GP2蛋白由ORF2编码；它是EAV中Gs蛋白的对应体，分子量约为29．30kDa。美洲株及欧洲株PRRSV的GP2蛋白均包含两个截然不同的疏水峰及两个N端糖基化位点。在EAV中ORF2a编码E蛋白，分子量约为8kDa：利用反向遗传技术发现E蛋白对于生成有感染性的EAV病毒子代具有不可或缺的作用12引。尚有待确证这一低分子量的结构囊膜蛋白是否也在PRRSV感染的细胞中表达。GP4蛋白是由ORF4编码的载脂蛋白，分量约为19．6．20．0kDa：其N端及C端含有高度疏水区及四个欧洲株及美洲株PRRSV共有的糖基化位点。欧洲株及美洲株PRRSV的GP4蛋白并不保守，Lv株的GP4与中和表位相关。己明确地知道，抗GP4的单克隆抗体在中和作用方面比不上抗GP5的单抗更有效。LV株GP4蛋白亲水区内的中和表位域已被鉴定出来位于氨基酸40．79：但这一区域在欧洲株中高度变异124】。也有报道称GP4在诱导中雨I抗体产生方面的作用存在争议【25】。GP3蛋白由254个氨基酸组成，在欧洲株及美洲株间同源性较低(54-60％)[26,271。造成这一情况的原冈在于前端的35个氨基酸，它们在两株问的同源性仅有29％。然而。GP3蛋白的前30个氨基酸为一信号肽，在蛋白成熟过程中被切割。因此，这一区域并不是影响GP3蛋白生物学活性的主要因素。在使用单克隆抗体分析了一系列英国蛛PRRSV抗原变异程度后，Dmw等发现不同株GP3蛋白C端变化很大【281。而且，GP3蛋白被认为是欧洲株成熟病毒粒子上的结构蛋白阢2引。然而，QuebecIFA．Kiop(一个典型的PRRSV美洲株)上的GP3蛋白却是一种与病毒粒子无关的可溶性分泌蛋130,31】。在EAV中，GP3蛋白对于组成感染性病毒粒子的过程至关重要㈣。抗GP3蛋白的抗体在病毒清除过程中起作用【33】。3PRRSV检测方法目前，国际上尚没有理想的针对PRRS的预防和控制措施，因此加强对该病的监测尤为重要。检测PRRSV感染的方法包括病原学方法、血清学方法(抗原检测和抗体检测)、分子生物学方法等。 河南农业大学2012届硕士学位论文3．1病原学方法主要是病毒的分离与鉴定。急性病例确诊和新疫区病毒确定多用病毒的分离与鉴定【34I。病毒分离与鉴定是诊断PRRSV的最经典方法，一般是把所采集的病料，接种到易感细胞(如PAM)上，PAM对PRRSV有较高的敏感性，大多数毒株适应该细胞，且具有产毒量高等优点，经培养观察病变，如果出现典型的细胞病变并能被特异的PRRSV冈1性血清所中和，就可说明该病毒存在。然后经过盲传，使病变更明显，显示病毒分离成功。但是PAM的制备技术难度人，动物费昂贵，所以难以推J、-1351o而且病毒分离成本高、操作烦琐且周期长，对病料的要求也高，所以实验室检测PRRSV还要借助其他方法。3．2血清学方法是应用最J’．泛的实验室诊断方法，具有敏感性高，特异性好，操作简单等优点。我国进出境生猪PRRSV诊断的主要方法是血清学方法，主要有间接免疫荧光(IFA)、免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)雨1血清中和实验(SNT)。3．2．1间接免疫荧光(IFA)免疫荧光技术是利州抗原抗体反应和荧光标记方法等免疫学的基本原理，在荧光显微镜‘卜．观察特异荧光的技术，包括直接免疫荧光和间接免疫荧光，最常刚的是间接免疫荧光，Yoonp51等首先建立的IFA具有很高的特异性雨I敏感性，已在北美欧洲J“泛虑州，最早可以检测到PRRSV感染6大的PRRSV抗体。孙颖杰[361等建立的微量间接免疫荧光方法也有很好的特异性和敏感性。方法是使川96孔板接种PRRSV病毒制备PRRSV感染的单层Marc．145细胞，对待检猪血清进行检测，在荧光显微镜下观察FITC荧光强度。但IFA这种方法需要培养细胞，结果的判定也很主观，不适合人规模应刚，有一定的局限性。3．2．2免疫过氧化物酶单层细胞实验(IPMA)免疫过氧化物酶单层细胞实验利间接免疫荧光类似，所不同的是其染色为HRP酶染色，细胞警红棕色则说明抗体为附陛。该法是由Wensvoortt371等在1991年所建立的，在欧美国家广泛应J=l；j。与IFA相比，IPMA具有用福尔马林液固定后长时间保存的优点。但和IFA一样，实验判定主观性强，不利丁白动化操作，不适合火规模应用。3．2．3酶联免疫吸附实验(ELISA)ELISA方法是检测和诊断PRRSV的常规方法，主要有间接ELISA、阻断ELISA和Dot．ELISA等。检测PRRSV抗体的间接酶联免疫吸附实验是由AlbinaE．等网首先建立的，将PRRSV接种PAM细胞制各病毒抗原对待检测血清进行检测，其特异性和敏感性都高于IFA和IPMA，但本底反应高，容易出现非特异性反应。TakikawaN。等报道用MARC．145细胞培4 河南农业大学2012届硕士学位论文养PRRSV抗原，建立的间接ELISA法，解决了过去难以获得足够抗原的难题，适用于大规模检测PRRS抗体139】。但是用PRRS全病毒作为检测抗原时，制各成本高且存在可能散毒的危险。PRRSV的N蛋白基因相对保守，编码的非糖基化蛋白占病毒蛋白成分的200／0-40％，N蛋白具有良好的抗原性，猪感染后7天即可检出N蛋白抗体，且维持时间可长达数月，因此N蛋白可作为PRRSV抗体的检测抗原。但N蛋白不能够诱导产生中和性抗体，因而以N蛋白作为检测原的ELISA试剂盒不能反映动物机体的免疫状态，无法对疫苗免疫效果进行评价，对免疫猪群的抗体检测不适用。M蛋白、GP4和GP5能够诱导猪体产生中和性抗体，激活细胞免疫和体液免疫；法国海博莱．LS!试剂盒以膜蛋白(M蛋白、GP2、GP3、GP4、GP5)作为包被原检测PRRSV血清抗体的ELISA方法解决了N蛋白检测方面的缺陷，该方法与IFA、IPMA有很好的相关性，可用于疫苗效力和抗体水平评价。3．2．4血清中和实验(SNT)病毒感染机体以后，产生的能够中和病毒感染的抗体来即为中和抗体。中和就是病毒或毒素与相应的抗体结合后，丧失感染力。该实验主要用于检测PRRSV中和抗体，是由Yoon等‘401在对PRRSV感染的体液免疫特征研究中首次应用的。由于SN抗体在血清中出现比较晚，故不适宜用于早期诊断；且也需要人量的细胞，不适合大规模应用。3．2．5乳胶凝集实验(LAT)是一种以乳胶颗粒作为载体吸附可溶性抗原于其表面和特异性抗体反应的一种间接凝集实验。在国内王忠等1411利用纯化的PRRSV重组M蛋白制成乳胶抗原，建立了检测PRRSV血清抗体的乳胶凝集实验的诊断方法。LAT方法具有敏感性高、特异性强、价格低廉、操作简便、快速且可用于现场检测等优点，比较适合基层兽医使用1421。3．2．6免疫胶体金技术免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用丁二抗原抗体检测的一种新型免疫标记技术。最早产生于20世纪60年代。在国内李军等㈣建立了斑点免疫金渗滤法(DIGFA)，其以微孔滤膜为固相载体，用胶体金标记提纯后的兔抗PRRSVlgG，以红色胶体金为标记物，来检测PRRSV抗原。3．3分子生物学诊断血清学方法是目前广泛应用的实验室诊断方法，但检测结果不能区别疫苗免疫和野毒感染等缺点；分子诊断学因直接检测病毒基因，具有更敏感特异快速准确等优点，是以后诊断技术发展的新方向。近年来，分子诊断方法得到了广。泛应用，主要有RT-PCR、实时荧光定量PCR、巢式PCR、一步多重PCR、原位PCR以及核酸探针技术等。5 河南农业大学2012届硕士学位论文3．3．1实时荧光定量PCR(RT-PGR)RT-PCR是目前实验室诊断PRRSV的主要分子检测方法，是由Suarez等I删于1994建立的。PCR提供了一种良好的可替代细胞培养检测PRRSV的方法。RT-PCR是有效的用于对cDNA进行扩增的l：具；一天内即可完成，：【=作速度较快且具备高敏感性及高特异性。Guarino等应用RT-PCR对收集丁．美国不同地区的24株PRRSV野毒株进行了检测，其使用PRRSV美国株的ORF4、6、7及欧洲株的ORFlb作为母序列设计了人对引物：所有毒株的ORF7基因均得到扩增；对ORF4及ORF6而言，只有92％汞196％毒株得到扩增；而仅有88％的毒株的ORFIb基冈被扩增出来145l。表明ORF7可以作为RT-PCR扩增的靶标。RT-PCR的引物和探针可人量合成井长期保存，特异性强、灵敏度高，检测速度快，结果可靠，同时还可避免散毒。但对PCR实验而言，一个常有的问题是冈污染造成假卧|生的山现。实时荧光定量PCR是在PCR反戍体系中加入荧光基团，利川荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模版进行定量分析的方法，EhSpagnuolo．weaver等146】利JHj检测欧洲型和美洲裂PRRSV的SYBRGreenl荧光信号著异首先建立的。该法灵敏度高，省时，易Hj，自动化好。3．3．2核酸探针原位杂交(IsH)SurJH等147】用1SH方法对感染猪体内的PRRS进行了检测。首先利刚反转录的方法制备了cDNA地高辛探针，与感染PRRSV猪组织中的抗原进行了杂交。发现在早期和晚期的感染都可检测到PRRSVRNA，该方法不仅能检测猪体内是否存在PRRSV，而且还能确定病毒在猪体各脏器中的分布14引。核酸探针原位杂交就是将标记的核酸探针与细胞或组织中的核酸进行杂交。ChuehLL等1491丁．1999年制备了地高辛RNA探针，成功建立了敏感性强的荧光原位杂交技术，结果PRRSV核酸在巨噬细胞内明显可见，该法对PRRSV常规临床诊断及病毒持续感染研究有重要意义。3．3．3基因芯片(Genechip)肖驰等‘501首次应川了DNA微阵列技术构建了猪繁殖与呼吸疾病综合征病毒(PRRSV)、猪瘟病毒(CSFV)和猪圆环病毒2型(PCV2)检测芯片，为今后猪瘟、猪繁殖与呼吸综合征诊断的方法检测技术研究提供了新的思路；但冈成本高，没有得到火规模应用。3．3．4环介导等温扩增反应(LAMP)环介导等温扩增反应是由日本学者Notomi在((NucleicAcidsRes))杂志上首先公开的一种新的基因诊断技术，即LAMP技术，受到了广泛关注。现在该技术已成功地应用于禽流感、SARS、HIV等疾病的检测中。LAMP方法有特异性高、灵敏度高，易操作，仪器设备简单，结果检测简单肉眼可见，适合基层快速诊断，目前已成为研究的热点1511。然而，LAMP方法也有缺点就是假阿l生问题严重。目前国内大多数实验室不能严格分区，容易形成气溶胶污染，6 河南农业大学2012届硕士学位论文故没有大面积应用【521。4PRRSV疫苗PRRSV主要造成呼吸困难和繁殖障碍，但对于造成两者的病理生理特征知之尚浅。虽然感染PRRSV的公猪的精液可导致大小母猪也感染PRRSV[65柳】，但是大多数猪通过带有悬浮粒的气体感染【531。在两种情况下感染PRRSV的猪均能产生体液及细胞免疫应答；但对于康复期的猪体内的免疫力是否真正具有保护力存在疑问。事实上，在感染过PAM细胞及单核细胞，病毒进入淋巴系统的各个器官后，即便有高水平IgG抗体存在的情况’卜．，病毒血症也可扩张并持续约6剧12，州。病毒在淋巴组织及精液中持续存在也是PRRSV感染的一个特征f55’56】对于其它动脉炎病毒而言，亦是如此1571。PRRSV可分为欧洲株(1型)和美洲株(1I型)两种基因型；欧洲株中有四个Ⅱ型；同一型及弧型中的多样性也非常高1581。而且，PRRSV也可导致准种(由一种母序列汞1来自该序列的人量相关突变体所组成的病毒基冈组)的产生159，60l。PRRS在欧洲及美洲几乎同时出现。最早在国际市场上使用的PRRSV疫苗来源_丁．美洲株VR-2332改良的活疫苗。当时就已经清楚PRRSV基因多样性，尤其是欧洲株感染，能够对疫苗活力产生影响这一问题。怀孕母猪感染美洲PRRSV分离株NADC．8后，在怀孕后期用PRRSV欧洲株LV攻毒，对PRRSV经胎盘感染胎仅产生部分保护力(病毒穿过了1，7母猪的胎盘)；而用NADC．8同源的病毒攻毒时，所有母猪均完全受到了保护【6l】。这一结果表明，异源保护力虽然存在但是仅为部分性的；同时也说明PRRSV欧洲株与美洲株共有表位很可能参与了免疫保护【621。而且，抗乳酸脱氢酶病毒(LDV)中和性表位的单抗能够同时中和PRRSV的VR．2332及LV株；表明GP5蛋白上的中和性表位在某种程度上为动脉炎病毒属病毒所共有1631。虽然部分异源保护力在某种情境一F可能有利，但是以一种基冈型为基础制备的疫苗难以达到免疫净化效果。目前临床应用的PRRSV疫苗有减毒活疫苗和灭活苗。灭活苗产生的免疫以体液免疫为主，对清除PRRSV感染的巨噬细胞无能为力，免疫效果不理想【31；减毒活疫苗存在返强的可能性，已有报道证实有猪场应用PRRSV减毒活疫苗后爆发PRRS或从猪场分离到的疫苗来源的PRRSV能引起肺炎的发生I删，冈此开发安全高效的新型疫苗是当前预防PRRS的迫切需要。PRRSV疫苗应具备至少四项特点：效力、通用性、安全性及区分疫苗接种与自然感染的能力【62l。首先，要搞清楚的是参与激发产生保护性免疫力的B细胞表位与T细胞表位。虽然T细胞对PRRSV多聚肽的应答在病毒感染的动物中被报道过，但对T细胞表位目前尚无深入了解【651。要研发PRRSV通用疫苗，美洲株PRRSV与欧洲株PRRSV共有的主要表位应当被详细鉴定出来。其次，要研究确定究竟病毒粒子或病毒基因组中那一组分参与调节宿主免疫系统及其发生机制，这对于研发减毒活疫苗很重要。因为一种疫苗的效力不仅与其自身免疫特性相关，而且也关系到其它毒株；所以，研究基因多样性及不同PRRSV株间免疫病理特性是必需的。第三，研发的疫苗应当具有安全性。这就意味着任何存在毒力返强的可能都要消除，在猪体间传播疫苗株的可能应当最小甚至不存在。一种确保安全性最明确的方式是使用非复制型疫苗。然而，尚不清楚非复制型疫苗是否能够诱导产生中和性抗7 河南农业大学2012届硕士学位论文体及足够的细胞免疫应答。而且，应深入开展关于PRRSV皿单位和载体依赖性疫苗及佐剂的研究。第四，研发能够区分野毒感染与疫苗免疫的疫苗是十分必需的。因为PRRSV是一种基因组很小的病毒，很难找到进行缺失的靶标序列；而且，到目前为止，对病毒基因组必需成分及非必需成分的精细研究尚未开展。Nsp2少许基因缺失导致的PRRSV自然变种表明非结构蛋白是构建分型疫苗的靶标16叫。一种有效的PRRSV疫苗不仅要对同一株中相同及不同基因型别PRRSV提供保护防l}：感染，而且要对同一基冈型中不同株提供保护防止感染。表1．1总结了研发新型疫苗己知、推测及未知的信息【62】。表1—1PRRSV感染中与疫苗研发相关的免疫应答特征Tab．1—1Someoftheknown．assumedandunknownfeaturesoftheirllmuneresponseinPRRSVinfectionreIevanttothedeveIopmentofvaccines5PRRSV与病毒感染的抗体依赖增强作用(ADE)PRRSV能够导致性成熟猪的繁殖障碍及猪群以间质性肺炎为特征的呼吸困难【671：对于3到4周龄的仔猪呼吸困难现象更为严重12】，这与这一时期PRRSV特异的母源抗体水平较低有8 河南农业大学2012届硕士学位论文关。母源抗体通常在4到8周龄的猪体内通过IFA或ELISA才可检测到【73I。这一观察表明PRRSV的ADE感染对该病的病理机制也起作用。这一假说可以被Choi等的工作证实；他在体外实验中研究表明PRRSV病毒量在有亚中和水平PRRSV特异性抗血清存在时可以提高【731。这一现象称为抗体依赖的病毒感染增强作用(Antibodydependentenhancementofvirusinfection。ADE)，在12科病毒中均有存在【73】。典型的例子有：猫传染性腹膜炎病毒(FIPV)、水貂阿留特(氏)病病毒(ADV)、马传染性贫血病毒(EIAV)及人登革热病毒(Dv)。ADE在登革热病毒致病机制方面的作用已被详细阐述。与第一次感染DV的人相比，当感染过相同或不同血清型DV后存有亚中和水平抗体的人雨次接触DV时，登革热病更加严重f72'731。此外，ADE作用也影响到疫苗的研制。分别用FIPV、EIAV及ADV灭活疫苗免疫过的猫、马和水貂，与未免疫过的动物相比，当用病毒的同源毒株攻毒时，出现更严重的病症【74l。在体外，PRRSV对PAM细胞的感染在有抗体存在的情况下，感染能够显著增强。增加的病毒产量及感染率高度一致，且病毒产量与感染率的比值大于1．4，表明不止一条途径导致了感染的增强。在体内，ADE也通过完全随机的阻断实验得到证实。与接种正常lgG的猪相比，接种Ⅱ中和水平的PRRSV特异性IgG的猪在攻毒后，病毒血症的平均水平及持续期更高(p<0．05)。相反，当猪体内中和抗体滴度为41092时，病毒复制被显著抑制(p<0．01)。中_j}II抗体活性在感染后(PI)37天低至检测不到的水平；ADE活性于Pl的20天在未稀释的血清中检测到并持续到62天[75】。6PRRSV的抗原表位对于PRRSV抗原表位的研究主要集中在N蛋白和GP5蛋白上，通过制备抗N蛋白的单克隆抗体，PRRSV美洲株N蛋白上的抗原表位已被鉴定出来；分别定位在氨基酸残基30．52(1)，37．5200，69．112(1V)及112．123(V)位吲；PRRSV欧洲及美洲株一个共有的空间表位被定位在N蛋白的中间区域氨基酸残基52．69(II!)位(76】。氨基酸残基37—52位间的区域在PRRSV欧洲及美洲株中十分保守，且为该蛋白最亲水的区域。但N蛋白特异性的抗体不具备病毒中和活性。PRRSV欧洲株N蛋白的抗原表位也通过LV株阳性血清鉴定了出来，分别定位在氨基酸残基2．12(位点A)；氨基酸残基25．30(位点B)；及氨基酸残基40-46(位点C)。第四个抗原表位(位点D)具有空间依赖性，包括氨基酸残基51．67及氨基酸残基80．90。位点A和C的表位在欧洲株中保守，但在美洲株中不保守。位点B的表位在欧洲株及美洲株中均保守。位点D的表位要么在欧洲株中保守，要么在美洲株中保守【77】。PRRSV感染的特征之一是中和性抗体(NAs)产生滞后。PRRSV欧洲株与美洲株主要的中和性表位(B表位)，位于GP5蛋白N端胞外区(氨基酸残基37-44)【29'30,7引。这个中和性表位位于糖基化位点的侧面。另一免疫优势表位(A表位)，位于GP5蛋白N端胞外区(氨基酸残基27．31)，与l型HIV一样，此表位具有诱骗表位的特征【731。这一诱骗表位能够干扰对主要中和性表位B产生的免疫应答，造成中和性抗体产生的滞后。在B表位与诱骗表位之间插入多DR辅助性T细胞表位能够在小鼠身上增强B表位的免疫原性【79J。表明A表位与B9 河南农业大学2012届硕士学位论文表位的远近距离对中和性抗体产生滞后具有重要影响【62J。诱骗表位并不是PRRSV逃避体液免疫应答的唯一途径。GP5蛋白上有四个糖基化位点，位于其中和性表位内或临近其中和性表位。虽然所有PRRSV株对中和抗体具有同等敏感性，但是缺失上游高变区糖基化位点的PRRSV美国野毒株比缺失一F游糖基化位点(N端44位)的PRRSV株在诱导中和性抗体方面更快速、更强烈【62】。7本研究的意义白1996年PRRSV在我国分离出以来，PRRSV感染量现广泛流行的趋势；给我国的养猪业造成了巨人的经济损火，同时也严重影响了畜牧产晶、食品的安全。PRRSV感染的显著特征是中和抗体产生滞后及抗体依赖的感染增强作川(ADE)：此两者给PRRSV感染的防控带来了极人的麻烦。由丁．日前还没有有效的针对PRRSV感染的预防和治疗措施，且缺乏人面积的血清学调布检测。GP5蛋白是PRRSV主要的结构蛋白，能够诱导产生中和性抗体。冈此，建立一种基丁-GP5的PRRSV缸清抗体ELISA方法，对猪体保护力和PRRSV疫苗免疫效力等方面的监测有着重要的意义。本研究首次采川OE．PCR技术将PRRSV变异株HN07．01的GP5蛋白的信号肽序列及疏水区序列去除，成功构建缺火跨膜区的GP5截短蛋白，在大肠杆菌中获得高表达；并以纯化后的GP5截短蛋白作为包被抗原，通过对实验条件进行优化，建立了PRRSV血清抗体间接ELISA检测方法，对丁临床PRRSV疫苗效力和仔猪母源抗体水平检测具有重要意义，同时解决了N蛋白作为包被原时不能对疫苗效力和机体免疫状态进行评价的问题。而且，GP5截短蛋白良好抗原性的存在也为研制更有效的PRRSV疫苗、抗病毒药物和诊断试剂提供了探索性的理论依据利思路。10 河南农业大学2012届硕士学位论文1引言第二部分PRRSV-GP5截短蛋白的表达与纯化PRRS自出现以来就对养猪造成了严重的危害，它主要引起母猪繁殖障碍和各种呼吸道症状。PRRSV是一种较小的、有囊膜的RNA病毒，属于套式病毒目(Nidovirales)，动脉炎病毒科(Arteriviridae)，动脉炎病毒属(Arterivirus)；同科的还有马传染性动脉炎病毒(Equinearteritisvirus，EAV)、鼠乳酸脱氢酶病毒(Lactatedehydrogenase-elevatingvirus，LDV)及猴出血热病毒(Simianhemorrhagicfevervirus，SHFV)12-4J。PRRSV基因组长度约15kb，含有9个开放阅读框。ORFla和ORF!b0与基因组大小的80％左右，编码两个较大的病毒复制多聚蛋白ppla和pplab；这两个蛋白由四种蛋白酶切割为14个非结构蛋白，主要参与病毒基因组复制及哑基因组mRNA转录。ORF2a、ORF2b及ORF3．7分别编码病毒结构蛋白：GP2a、E＼GP2b、GP3、GP4、GP5、M及N蛋削u】。N蛋白是其含量最丰富的蛋白，GP3、GP4和GP5蛋白均被报道出含有中和性抗原表位1821。GP5蛋白是PRRSV的主要囊膜蛋白，针对GP5蛋白的单抗在中和病毒方面的作用较GP4蛋白的单抗更为有效【s31。无论是在体内还是在体外，PRRSV病毒的中和都与GP5蛋白的单抗直接相关118，831。到目前为止，人们分别采用哺乳动物细胞、重组病毒、烟草植物和宿主动物等来表达GP5蛋创841。但考虑到蛋白表达量，大肠杆菌原核表达被认为是优先的选择。因为GP5蛋白与病毒中和直接相关，所以高效表达有生物活性的GP5蛋白对诊断试剂的研究及疫苗开发具有重要意义。2材料与方法2．1病毒、菌株及载体PRRSV河南株HN07一i、MARC一145细胞及pMD19-T-ORF5重组质粒由河南农科院动物免疫学重点实验室保存；大肠杆菌感受态细胞EcoliDH5a及BL21(DE3)19l《J自大连宝生物T程有限公司(TaKaRa)；克隆载体pMD19一T及表达载体pET28a(+)l购自Novagen公司。2．2酶及主要试剂PremixExTaqDNA聚合酶、T4DNA连接酶、限制性内切酶BamHl和HindIII、DNAMarker、质粒提取试剂盒及切胶回收试剂盒均购自大连宝生物工程有限公司(TaKaRa)；IPTG、HRP标记羊抗猪IgG购自华美公司；弗氏完全佐剂(FCA)和弗氏不完全佐剂(FIA)、DMEM培养基粉末及新生胎牛血清购自GIBCO公司；AEC酶底物试剂盒购自中山金桥；胰蛋白酶购自Ameresco公司；青霉素钠购自哈药集团制药部厂；3,3’，5，5’．四甲基联苯胺(TMB)购自德国Sigma公司；DH5a及BL21(DE3)感受态细胞购白天根生化科技有限公司。Il 河南农业大学2012届硕士学位论文2．3主要试剂的配制2．3．1LB培养基的配制LB液体培养基的配制：称取蛋白胨(Tryptone)109、酵母提取物(Yeastextract)59、及氯化钠(NaC!)109，溶于800mL去离子水中，加入去离子水定容至1000mL，搅拌使之完全溶解；调：侮pH值至7．0，高压灭菌，置于40C冰箱保持备用。LB同体培养基的配制：加琼脂粉于液体培养基中(159／L)，高压灭菌后，置于4。C冰箱保持备州。2．3．2无血清DMEM培养基的配制取一包DMEM粉末，川高压灭菌去离子水溶解并定容至1000mL，用约3．79的NaHC03调：肖pH值为7．0，混匀后，．u：j0．22pm滤膜过滤除菌，无菌分装每瓶人约450mL，置于40C冰箱保持备HJ，使用时按照要求按比例加入胎牛血清。2．3．3PBS(磷酸盐缓冲液)的配制称取KH2P040．249，KCl0．29，NaCI89，Na2HP04(Na2HP04·12H20)1．449，用800mL去离子水溶解，定容至1000mL，调二1了pH值为7．4，1．034x105Pa高压灭菌，置于40C保存备州。2．3．4TE缓冲液的配制10mmol／LTris．HCI(pH8．0)，Immol／LEDTA(pH8．0)，高压灭菌，置丁．4。C保存备刚。2．3．5溴化乙锭(EB)储存液的配制称取100mgEB溶解丁IOmL去离子水中，配成终浓度为10mg／mL，避光室温‘卜．保存，[作浓度为O．51ag／mL。2．3．62％琼脂糖凝胶的配制称取29琼脂糖，溶解丁．100mLl×TAE缓冲液，度为0．5lag／mL。2．3．70．25*4胰酶溶液的配制称取0．259胰蛋白酶，溶解丁．100mL玄离子水，2．3．8细胞裂解液的配制加热溶解，待冷却后加入EB，使其终浓并丁．0．221am滤器过滤，一20。C保存备J；_fI。10mmol／LTris．HCI，l0mmol／LEDTA，150mmol／LNaCI，0．5％SDS，去离子水定容，40C保存备川。2．3．95％和12％SDS-PAGE分离胶的配制5％SDS．PAGE浓缩胶(4mL)：2．7mL双蒸水，0．67mL30％丙烯酰胺溶液，0．5mL1．0mol／LTris．HCI(pH6．81，0．04mL10％SDS，0．04mL10％过硫酸铵，0．004mLTEMED。12％SDS．PAGE浓缩胶(10mL)：3．3mL双蒸水，4．0mL30％丙烯酰胺溶液，2．5mL1．5mol／LTris—HCI(pH8．8、，O．1mLi0％SDS。0．1mL10％过硫酸铵，0．004mLTEMED。2．3．101XNi-NTA结合缓冲液(Bindingbuffer)100mL：称取NaH2P041．569，Tris．HCiO．1219，尿素489，溶解于100mL蒸馏水中，调节12 河南农业大学2012届硕士学位论文pH值为8．0。40C保存。2．3．111XNi-NTA洗涤缓冲液(Washinguffer)100mL：称I玟NaI-12P041．569，THS-HCIO．1219，尿素489，调节pH值为8．0，4。C保存。2。3．121×Ni-NTA洗脱缓冲液(EIutionbuffer)100mL：称取NaH2P04i．569，TriS-HCl0．1219，尿素489，调节pH值为8．0，40c保存。2．3．13Lysisbuffer(菌体裂解缓冲液)100mL：称取NaCl0．889，TdS．HCl0．1219，EDTA0．2929，DTT0．039，加入甘油使其终浓度为10％，加入PMSF使其终浓度为0．5mM；调节pH值为8．0，40C保存。2．3．14Washingbuffer(洗涤缓冲液)100mL：称取NaCl0．589，Tris—HCl0．69，EDTA0．2929，Drrr0．039，力1)XTritonX-100使其终浓度为1％；调节pH值为8．0，40C保存。2．3．15Resuspensionbuffer(重悬缓冲液)100mL：称取NaCl0．589，Tds·HCl0．69，EDTA0．2929，DTT0．039；调：诲pH值为8．0，4。C保存。2．3．16Denaturationbuffer(删尿素变性液)100mL：称取NaCl2．99,Tds—HCl0．39，EDTAO．1459，DTT0．0159；尿素489；调：竹pH值为8．0，40C保存。2．3．17Renaturationbuffer(复性缓冲液)100mL：称取NaCI2．99，Tris·HCl0．249，GSH0．0349，GSSG0．0629；加入PMSF使其终浓度为0．2mM；调节pH值为8．0，40C保存。2．4主要仪器设备高速台式离心机(TGL．16B型)上海安亭科学仪器厂恒温振荡器(THZ．C型)太仓市实验设备厂GENEGENIUS凝胶自动成像系统英国Syngene公司双垂直电泳槽北京市六一仪器厂50mL离心机上海安亭科学仪器厂．200C冰箱．800C低温冰箱低速离心机青岛海尔股份有限公司美国热电公司北京医用离心机厂SW-CJ-2FD型双人单面净化工作台苏州净化设备有限公司13 河南农业大学2012届硕士学位论文C02恒温培养箱日本SANYO公司上皿电子天平(FA2004型)上海精科实业有限公司WFZ751型紫外可见分光光度计上海光谱仪器有限公司LS．B35L型立式压力蒸汽灭菌锅SIM．F124型制冰机江阴滨江医疗设备厂日本三洋公司101型电热鼓风干燥箱天津市泰斯特仪器有限公司HQ．60型旋涡混合器移液器酶标仪白动舣重纯水蒸馏器北京同止生物技术发展公司人龙医药设备(上海)有限公司美国伯乐公司上海弧荣生化仪器厂JY92．iiN超声波细胞粉碎仪!j2波新芝生物科技股份有限公司PTC一200型梯度PCR仪美国基冈一I：程公司电热恒温培养箱(DH6000AB型)天津市泰斯特仪器有限公司电泳槽(DYCP．31A裂)北京市八一仪器厂电泳仪：l匕京市人一仪器厂电热恒温水槽上海一恒科技有限公司2．5引物设计与合成根据DNAStar软件对PRRSVORF5分子特征的分析结果，使川PrimerPremier5．0，设计四条表达引物川以去除GP5基冈上的信号肽基冈序列和跨膜区基冈序列。引物Pl的5’端有BamHl酶切位点；引物P4的5’端有HindII!酶切位点；引物P2的5’端前30个碱基编码两个连续重复的GGGGS氨基酸序列；引物P3的5’端前30个碱基为引物P2的5’端前30个碱基的反向互补序列。为确保翻译终．1}：，引物P4的5’端引入了TAA和TAG两个终止密码子。14 河南农业大学2012届硕士学位论文表2-10E-PCR扩增弓I物Tab．2-1PrimersforOE—PCRAmpIificationofGP5Gene2．60E-PCR扩增采用OE．PCR将GP5蛋白的N端部分(GP5a)和C端部分(GP5b)的基因相连接，为尽量减小重组蛋向与天然GP5蛋白在空间构象上的差异，同时确保蛋白抗原性的存在，在GP5蛋白N端部分和C端部分之间加入了两个连续重复GGGGS氨基酸序列的柔性Linker。为将目的基因序列连接到原核表达载体pET28a(+)_L，应用了两个限制性内切酶酶切位点：BamHI雨lHindII!。SignalpepUdeGPSa(96bplTrans—membraneregionsGPSb(213bp)II：：：■■●：：：：l射．96+30I130+213+12)L竺兰!竺一一一-JBamHI15’)：：：：■■_I山GP5aLinkersequence(30bp)GP5bHindIII(3’)图2—1PRRSV—GP5重组蛋白OE—PCR扩增示意图Fig．2-1SchematicrepresentationofOE—PCRfortheconstruot；onoftruncatedGP5在扩增GP5a时，应用引物Pl和P2进行扩增，50此反应设计体系如下：15 河南农业大学2012届硕士学位论文pMDT-GP5模板(10ng／gL)PI(10pmol／I．tL)P2(10pmol／lxL)PremixExTaqDDW总体积1gL2．5此2．59L259L199L509L反应条什为：950C预变性5min；94。C变性1min，650C退火40sec，720C延伸1min，循环30次：之后72。C再延伸10min。在扩增GP5b，应川引物P3和P4进行扩增，50[ttL反应设计体系如下：pMDToGP5模板(10ng／laL)1此P3(10pmol／gL)P4(10pmol／gL)PremixExTaqDDW总体积2．59L259L191aL509L反应条仆为：95。C预变性5rain；94。C变性lmin，660C退火40sec，72。C延伸Imin，循环30次；之后720C再延伸10min。对N端和C端的扩增产物进行切胶同收纯化后，采川OE—PCR将这两部分进行拼接。509L，OE-PCR反应设计体系如卜．：GP5a模板(10ng／gL)1灿GP5b模板(10ng／IxL)PI(10pmol／gL)P4(10pmol／gL)PremixExTaqDDW总体积1uL2．59L2．51xL259L18uL509L反应条件为：95。C预变性5min；94。C交性lmin，65。C退火40sec，72。C延伸]min，循环30次；之后720C再延伸10min。16 河南农业大学2012届硕士学位论文2．7重组质粒pET-GP5的构建2．7．1质粒DNA的制备采用AxyPrcp质粒DNAdx量试剂盒(采用改进的SDS碱裂解法，结合DlNA制备膜选择性地吸附DNA的方法达到快速纯化质粒DNA的目的)以制备高度纯化的质粒DNA。操作步骤如下：1．取1-4mL在LB培养基qb37。C振荡培养过夜的菌液，120009，离，IMmin，弃尽上清。2．加2501上L预冷的BufferSI(预先加过RNaseA，40c保存)完全悬浮菌体沉淀，悬浮均匀，不留小的菌块。3．)J112501xLBufferS2，温和并充分地上下翻转4．6次混全均匀使菌体充分裂解，直至形成透亮的溶液，不宜超过5min。4．加350I．tLBufferS3，温和并充分地上-卜-翻转6．8次，120009，离。C,10min。5．吸取步骤4中的离心上清液移到制备管(置-J"2mL离心管中)，120009，离，L．Imin，弃滤液。6．将制备管置回离心管，]J【i5001aLBufferWl，120009，离一L,lmin，弃滤液。7．将制备管置回离心管，JJl]700lxLBufferW2，1200％，离。th,lmin，弃滤液，同法雨用BufferW2洗涤一次，弃滤液。8．将制备管置回2mL离心管中，120009，离心1min。9．将制备管移入新的1．5mL离心管中，在膜中央加入609L，60。C预热的无菌去离子水，静置lmin，120009，离-I二,1min。10．使用紫外分光光度计(Nanodrop1000)测定提取的质粒DNA含量：置于．200c保存。2．7．2PCR产物及双酶切产物的回收纯化采用E．z．N．A．TMGelExtractionKit的操作说明同收PCR产物及酶切基冈片段。1．进行琼脂糖凝胶电泳，分离DNA片段。2．用洁净刀片切出含目的DNA片段的凝胶，切碎后放入离心管中。3．称取胶块重量，计算胶块体积(以1mg=!laL计算)。向胶块中加入等体积的Bindingbuffer(XP2)，55。C．600C放置7rain，并间断震荡混合使胶块充分融化。4．pH观察：若上述混合物为橙色或红色；加入59L，5M醋酸钠pH5．2以降低其pH值；正常颜色应为淡黄色。5．取1个HiBindDNA结合柱，置于2mL收集管中；吸取2009L的BufferGPS平衡缓冲液于柱子中；室温放置3-5min。6．室温下以100009离心2min；倒弃收集管中的滤液，把HiBindDNA结合柱置回收集管中，加入7009L灭菌水于柱子中，同上离心。7．弃滤液，将HiBindDNA结合柱置回收集管中：取700pL含目的基因的凝胶溶液加入DNA结合柱中，100009室温离心Irain，弃滤液。8。将HiBindDNA结合柱置回收集管中，若凝胶溶液体积大于700．L，则取剩余溶液同步骤17 河南农业大学2012届硕士学位论文4离心操作(每个柱子的最大DNA吸附量为25p,g；若大量回收，则应把样品分装离心)。9．将HiBindDNA结合柱置回收集管中，加300“LXP2于HiBjndDNA结合柱中，lOOOOg室温离心1min弃滤液：10．将HiBindDNA结合柱置同收集管中，加7001aLSPWWashBuffer于HiBindDNA结合柱中，100009离心1min，弃滤液，重复此步骤。11．将HiBindDNA结合柱置同收集管中，以大于130009离心2min，以除去乙醇。12．将HiBindDNA结合柱置丁1．5mL的微离心管中，加入60uL，600C预热超纯水至膜上静置1min；以大于130009离心1min。13．使用紫外分光光度计(Nanodrop1000)测定同收的DNA含量；．200C保存。2．7．3重组GP5基因的双酶切将同收纯化的重组GP5基冈片段，川BamHI及Hind111进行舣酶切，在370C水浴中反应8h。20“L酶切反应体系为：GP5(73．9n∥pL)BamHI10×Kbu仃erDDW2．7．4pET28a(+)载体的双酶切5pL0．26UL0．26¨L2txL12．48“L将提取制备的pET28a(+)载体基冈片段，)-[]BamHl}J(HindIIl进行双酶切，在37。C水浴中反应8h。20I．tL酶切反应体系为：pET28a(+)(92．1ng／!aL)BarnHIlOxKbu仃erDDW1810¨L0．6uL0．61aL2“L6．8IlL 河南农业大学2012届硕士学位论文2．7．5GP5与pET28a(+)双酶切产物的连接将酶切回收的GP5基因片段与pET28计)载体片段连接，在16。C水浴中反应连接过夜。20I．tL连接反应体系为：GP5ab酶切片段(29．3ng／pL)10pLpET28a(+)酶切片段(14．Ing／pL)3uLT4ligase10xT4ligasebufferDDW2．7．6重组质粒pET-GP5构建图谱i．31xL21aL3．71aL以pMDT-GP5模板，使用OE—PcR对目的基因进行扩增，扩增产物使用B俐Hl雨lHind1II进行双酶切：同样对提取的pET28a(+)质粒使用这两酶进行酶切，之后，将GP5和IpET28a(+)的酶切产物使用T4DNA连接酶进行连接，转化火肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。I—土=：==：=R8一H．上8口⋯：!：：：=≯¨8一M上8一艺=：：=¨图2-2重组质粒pET-GP5构建图谱Fig．2-2SchematiCrepresentationoftheconstructionofrecombinantpIasmidpET—GP52．7．7重组质粒pET—GP5的转化1．从一80。c冰箱中取出DH5a感受态细胞，置于冰上至融化，将101aL，pET-GP5连接产物瞬时离心，加入1001aL感受态细胞悬液中轻轻旋转以混匀，在冰浴上静置30min。2．42。C水浴热激60-90sec，然后快速将管转入冰浴中放5min。3．向管中加入lmL的LB培养基，混匀后在370c摇床中振荡培养1．2h。4．50009离心4min，见管中有菌体沉淀，吸去960p,L的上清后，将离心管内容物混匀。19 河南农业大学2012届硕士学位论文5．吸取1009L已转化的感受态细胞加入到含Kan抗性的LB平板上；用无菌的弯头玻棒轻轻将细胞均匀涂开；置于室温至液体被吸收，倒置平板；370C温箱中培养12．16h。2．7．8阳性重组质粒pET—GP5的筛选与鉴定转化后，挑取平皿长出的表面光滑、边缘整齐且有一定光泽的5．10个单克隆菌落分别接种于含10099／mL，Kan抗体的LB液体培养基中，37。CT-2509摇床上震荡10．15h，分别进行菌液PCR及舣酶切鉴定：将鉴定出来的附陛克隆的菌液过夜扩人培养，送上海生工测序，川以确定GP5基冈是否连接成功及其插入的位置、人小是否止确。测序后，将基因序列与NCBI上公布的PRRSV-GP5序列进行比对。阿I性菌种川15％甘油保存，置于．80。C备用。2．8PRRSV-GP5截短蛋白的原核表达及检测将含有卧I生重组质粒pET-GP5的火肠杆菌以1％接种蕈接种丁．含100斗g／mL，Kan抗性的LB液体培养基中，在37。C，2509摇床上培养过夜，进行诱导表达。实验对IPTG浓度、温度及诱导时间进行了优化，以使重组PRRSV-GP5截短蛋白在最优条什’卜-进行表达。2．8．1SDS-PAGE检测蛋白样品的制备：取1mM，IPTG诱导表达的细菌lmL，于120009离心2rain；沉淀州1009L的PBS悬浮：与等体积的2倍Loadingbufier混合，作为上样样品。配制5％浓缩胶及l5％分离胶，小心将胶放入电泳槽中，加入TG缓冲液，内槽加满且液面稍高丁．外槽：移女梳子，向上样孔中加入10pL处理过的蛋白样品，留一上样孔加入109L低分子量标准蛋白Marker：先川65V电乐使样品聚集在上_卜．层胶交界面，之后，J4j103V电压使样品跑至分离胶底部，关闭电源；使心考马斯亮蓝R250染液染色蛋白胶4—5h，用脱色液脱色过夜，期间换液2．3次；在凝胶背景透明后，川单蒸水终I}：脱色，根据Marker分析蛋白表达情况，并．1_}J扫描仪扫描蛋白胶，存取图片。2．8．2WesternbIot分析蛋白样品的制各及电泳同SDS．PAGE。采用半干式转移法，步骤如一F：1．凝胶的处理：SDS—PAGE之后，将胶用l倍转膜缓冲液平衡10min。2．硝酸纤维素膜(NC膜)的准备：剪裁与胶大小一致的NC膜，并将其完全浸于1倍转膜缓冲液中平衡10min。3．转膜：转膜仪阳极碳板和阴极碳板由下到上依次是滤纸、NC膜、蛋白胶、滤纸。在15V电压下，转膜lh。转膜结束后，先用丽春红染色观察载有蛋白Mwker的膜条带，并将其剪下，在氨基黑中染色lmin，之后在甲醇和乙酸l：1混合液中脱色，用双蒸水清洗，置于40C保存。4．免疫反应：使用洗液PBST清洗转印过的NC膜3．5次后，将膜放入5％脱脂奶中于40C过20 河南农业大学2012届硕士学位论文夜封闭。次日，弃封闭液，用PBST清洗NC膜3．5次。将PRRSV阳性血清用PBS稀释100倍，将膜覆盖，置于37。C反应1h。弃一抗，用PBST清洗NC膜3—5次。加入l：100倍稀释的}Ⅱ冲标记的二抗。置于37。C反应1h。弃二抗，用PBST清洗NC膜3．5次。加入AEC显色液进行显色反应，至出现条带时放入双蒸水中终止反应。2．8．3包涵体的纯化与复性2．8．3．1包涵体的制备截短的GP5蛋白主要存在于超声裂解后的沉淀中，以包涵体形式存在。包涵体制备步骤如下：1．将诱导表达的重组蛋白菌液200mL，在120009中，离心20min，弃去上清；2．用20mL的Lysisbuffer重悬沉淀，混合均匀，置于冰浴10min后，超声破碎，超声]：作参数为：间歇时间9s，工作时间9s，l：作次数99次：3．在4。C，90009进行离心20min，收集上清和沉淀，采用SDS．PAGE观察蛋白表达情况：4．用20mL的Washingbuffer重悬沉淀，混合均匀后进行超声，条件同上；之后于90009，40c离心20min，弃上清；5．用20mL的Resuspensionbuffer重悬沉淀，混合均匀于90009，4。C离心20min，弃上清；6．用8M的尿素变性液20mL溶解沉淀，混合均匀，室温静置20rain，之后，用紫外分光光度计测变性蛋白含量；7．于40C，90009离心20rain，收集上清，即目的蛋白变性液。2．8．3．2重组蛋白的过柱纯化截短的GP5蛋白质中含有His6标签，本实验采用Ni-NTA亲和层析柱纯化重组目的蛋白，具体步骤如下：1．平衡：取装有ImL填料的镍柱，加入2mLBindingbuffer清洗平衡柱子：2．上样：向镍柱中加入2mL的变性蛋白液，收集流出液体，并做好标记；3．洗涤：向镍柱中加入4mL的Washingbuffer洗涤蛋白样品，收集流出液体，做好标记；4．洗脱：向镍柱中加入5mL的Elutionbuffer，将目的蛋白从镍柱中洗脱下来，做好标记；5．再平衡：过完镍柱后，再次用2mL的BindingBuffer清洗平衡柱子。纯化后，将每步收集的液体组分进行SDS．PAGE电泳分析，观察重组蛋白过柱纯化情况并用紫外分光光度计测定蛋白含量。2．8．3．3包涵体的复性蛋白纯化后，将收集的变性蛋白液装入透析袋中，置于Renaturationbuffer中，在40c层析柜中磁力搅拌透析，每4．5h更换透析液，透析12h；后用PBS液透析3次，每次透析12h；2l 河南农业大学2012届硕士学位论文收集透析袋中液体，在4。C，100009离心10min，弃沉淀；上清用0．45um孔径滤膜过滤；紫外分光光度计测定上清中蛋白含量。用硅胶进行浓缩，收集浓缩后的蛋白，．800C保存备用。2．8．4酶联免疫吸附实验(ELISA)实验采用间接ELISA对复性后的蛋白进行功能鉴定，采用PRRSVHN07．1和BJ．4株阳性血清作为一抗反应血清。实验步骤如下：1．包被：川包被液(CBS)将PRRSV-GP5截短蛋白分别以10、7．5、5．0、2．5、2．0，1．0、0．5、0．25、0．125、0．0625雨10．03125pg／mL包板，50pL／孑L，放置于4。C过夜，PBST洗涤三次，垲干；2．封闭：每孔加满5％脱脂奶，置板丁370C封闭1h，川PBST洗涤三次；3．加一抗血清：川PBS分别待检血清作1：400稀释样晶，同时设阴性对照，每孔加50pL稀释斤的血清，将96孔板置丁．37。C反应30min，使川PBST洗涤三次；4．加酶标二抗：将羊抗鼠IgG—HRP或兔抗猪190-HRP刚5％脱脂奶作1：1000倍稀释，每孔加50pL，将96孔板置丁370C反应30min，使刚PBST洗涤三次；5．加酶显色底物：每孔加入50pL酶底物TMB，37。C反应5-10mira6．反应终I卜：每孔加入50pL终l卜液2MH2S04，酶标仪测定OD450值；7．结果判定：P／N值人丁-2．5时的血清可判定为m陛。2．8．5BALB／c小鼠免疫SPF级6～8周龄雌性BALB&小鼠，由河南省农业科学院农业部动物免疫学重点开放实验窒饲养。将复性后的GP5截短蛋白作为免疫原进行BALB&小鼠免疫，共免疫小鼠3只。具体免疫程序如卜．：表2-2BALB／c小鼠免疫程序Tab．2—2BALB／cmousejmmunizatOnprocedure 河南农业大学2012届硕士学位论文2．8．6免疫过氧化物酶单层细胞实验(I附A)免疫BALB／c小鼠后，采集小鼠血清，以PRRSVN蛋白的单抗作为阳性对照，通过IPMA检测免疫后的小鼠血清是否能与天然的病毒反应。IPMA反应步骤如下：1．制备MARC．145单层细胞，将细胞铺于96孔板上并于37。C，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养24h；2．待细胞有90％左右汇合时接HN07．1种毒，于370C在含4％胎牛血清的DMEM培养基中感染48．72h，观察细胞病变：3．弃去上清，用无菌PBS每孔加入150此清洗3次：4．固定：每孔加入50此含0．3％H202的预冷甲醇溶液固定10．15mira5．封闭：弃固定液后，用PBST清洗3次；每孔加满5％脱脂奶，在370C作用lh，封闭孔中多余位点：6．加一抗：弃封闭液后，用PBST清洗3次；将N蛋白的单抗及所要检测的鼠阳性血清进行1：100稀释，于每孔中加入50此，在370C作用1h；7．an：-：抗：弃上清液后，用PBST清洗3次；于每孔中加入509L，1：100稀释的羊抗鼠lgG-HRP，在37。C作用1h；弃上清液后，用PBST清洗3次：8．AEC显色：按AEC显色试剂盒说明，将A液、B液和c液按一定比例混合，每孔加入50此显色液，室温作用10rain，显微镜下观察染色结果。2．8．7间接免疫荧光(IFA)免疫BALB／c小鼠后，采集小鼠血清，以N蛋白的单抗作为阳性对照，通过IFA检测免疫后的鼠血清是否具有与病毒反应的能力。IFA反应步骤如下：1．制备MARC．145单层细胞，将细胞铺于96孔析上并于370C，在含10％胎牛血清的DMEM培养基中培养24h；2．待细胞有90％左右汇合时接HN07．1种毒，于37。C在含4％胎牛血清的DMEM培养基中感染48．72h，观察细胞病变；3．弃去上清，用无菌PBS每孔加入1501-LL清洗3次；4．固定：每孔加入509L含0．30／d-1202的预冷甲醇溶液固定10．15min；5．封闭：弃固定液后，用PBST清洗3次；每孔加满5％脱脂奶，在370C作用lh，封闭孔中多余位点；6。加一抗：弃封闭液后，用PBST清洗3次；将猪阳性血清及所要检测的鼠阳性血清进行l：100稀释，于每孔中加入50ILL，在37。C作用lh；弃上清液后，用PBST清洗3次；7．an-抗：于每孔中加入50乩l：100稀释加入二抗l：100稀释的异硫氰酸荧光素(FITC)标记羊抗鼠，在370C作用lh；弃上清液后，用PBST清洗3次；8．显微观察：用PBST洗涤3次，在荧光显微镜下观察结果。 河南农业大学2012届硕士学位论文3结果与分析3．1PRRSV-GP5蛋白分子特征分析结果DNAStar分析表明PRRSVoGP5蛋白的N端1．31个氨基酸为信号肽序歹lJ(Signalpeptide)，疏水性较强；中间氨基酸64—82位，87．99位，利107．129位三个区域同样表现出较强疏水性，而且抗原性及存在于表面的可能性较差。^———————————————————————————————————■卜———————————————●●—————一●^·o‘，Re口’眦G}m盱Rob科e●●■■■■■■—●■■●—■卜■——●■■■■■■■■■■H■●—_．—-．●_|●■●—■|_●■|■■H_兰etjRo；奇一，-oj⋯MrRobso—T_|卜———————————_l}—．_—————————————————置臣H譬卜—B_|卜—}————————n一臼T。一ReGo，；．63r’舭Rob螂c————————_【]——————H———————————————————————————．【卜———．|卜—斗口C．--,Re0·)一s．o}rr暗r．Roo；o，‘—■+●————●●●一——■■¨—|●—————-．■■I_——■■■—_一●H■斗●¨卜■■■_．■_■^tC,P；An‘p“帕arh，cRe3州E{：‘——●H●●——■h1●●—卜———■■————————————■●■L——●I■一●■■■-■-一■■■——一■E{tj^n。IE*P‘pit’七Re口c．rs．Er；’：一k．—忽毖吐一。——^羟昆么叫。。嵋一。一⋯⋯。!一⋯．．一_j一]。：}墨；暑毛互蚕；琴；亨』窒L’；r，‘生。-a≮互i蚕，2r甲—=；；，芒b‘鼍乏：薹i；=，岔正譬jj^』；土山’‘。j-·^。t’’耳’_‘盎=：l口“j：7。。h}’。n‘Pbthyt∈c3。1_tl图2-3PRRSV—GP5蛋白分子特征分析Fig．2-3MoIecuIarcharacteristiCSofPRRSV—GP53．2OE-PCR扩增结果OE．PCR对GP5蛋白的N端部分及C端部分扩增出来的GP5a及GP5b片段理论上分别应为135bp和255bp；连接后的GP5ab片段廊为360bp。重组质粒转化BL21(DE3)感受态细胞后，挑取刚性单克隆菌落进行培养，菌液PCR鉴定结果显示：PCR扩增出来的片段与目的片段人小一致。将初步鉴定为刚性的克隆菌液送上海生I：进行测序，测序结果表明实验获得了阅读框正确的重组表达载体。M24 河南农业大学2012届硕士学位论文图2-40E-PCR扩增结果M：DS2000：1：GP5a基因；2：GP5b基因；3：重组GP5基因Fig．2-4TheresuItof0E—PCRM．DS2000：1．GP5agene：2．GP5bgene：3．RecombnantC-P5gene3．3PRRSV-GP5截短蛋白的诱导表达将重组的GP5基冈与pET28a(+)载体连接后，转化人肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，将PCR鉴定及序列测定均为同l性的重组质粒命名为pET-GP5。采刚LB培养基对刚性的人肠杆菌BL21(DE3)在37。c进行培养，通过1mM终浓度的IPTG诱导蛋白表达。采川SDS-PAGE对重组蛋向表达情况进行鉴定后发现在16kDa左右有一条新山现的蛋白条带。采J4jWesternblot对其进行鉴定后发现，此蛋白条带能够被PRRSV猪ElI性血清及抗His单抗所识别。fI'Jga)M197．J一66．2—42．7—3L0—123鞫羹。，20．1．．—．M4一～期ABC图2-5SDS—PAGE电泳分析结果及Westernbot分析结果A：M：蛋白marker：1：pET一28a诱导：2：重组PRRSV—GP5未诱导：3：重组PRRSV-GP5诱导；B：PRRSV阳性血清作为一抗；C：HS单抗作为一抗。Fig．2-5SDS—PAGEandwesternbIotanaIysiSALaneM。Mid-rangeproteinmoIeCUIarweightmarkers(kDa)：Lane1．BL21(DE3)harboringpET-28anduced：Lane2．BL21(DE3)harborngpET—GP5unnduced：Lane3．BL21(DE3)harborngpET—GP5inducedB．WesternbIotUSingPRRSVpositiveserumasprimaryantibody：C，WesternbIotUSinganti—HiS8mAbasprimaryantibody)3．3．1重组PRRSV—GP5裁短蛋白的诱导表达条件优化实验对IPTG浓度、温度及诱导时间进行了优化，以使重组PRRSV-GP5截短蛋白在最优条件‘卜进行表达。25 河南农业人学2012届硕士学位论文3．3．1．1重组PRRSV—GP5截短蛋白表达的lPTG浓度优化对重组PRRSV-GP5截短蛋白分别以0、0．2、0．4、0．6、O．8、1．0、1．2及1．5mM终浓度的IPTG在37。c进行诱导表达4h；结果得知0．6mM为最佳1PTG诱导浓度。限Da)97．J一66．2．——42．’一j1．0一：0．1一lj．J一、il234567S图2-6不同IPTG浓度优化结果M：蛋白marker：1：PRRSV—GP5未诱导：2：02mMPTG诱导：3：04mMPTG诱导；4：0．6mMIPTG诱导：5：0．8mMPTG诱导：6：1．OmMIPTG诱导：7：1．2mMIPTG诱导：8：1．5mMIPTG诱导。Fig．2-6OptimizationofIPTGcontentrationLaneM．Mid-rangeproteinmoIecuIarweightmarkerS(kDa)：Lane1，BL21(DE3)harboringpET—GP5uninduced：Lane2，BL21(DE3)harborngpET—GP5nducedby0．2mMPTG：Lane3，BL21(DE3)harborngpET—GP5inducedby0．4mMIPTG：Lane4．BL21(DE3)harboringpET—GP5inducedby0．6mMIPTG：Lane5．BL21(DE3)harborngpET—GP5nducedby0．8mMPTG：Lane6．BL21(DE3)harboringpET—GP5nducedby1．0mMIPTG：Lane7．BL21(DE3)harboringpET—GP5induoedby1．2mMPTG：Lane9．BL21(DE3)harboringpET—GP5inducedby1．5mMPTG3．3．1．2重组PRRSV-GP5截短蛋白的不同温度诱导表达对重组PRRSV-GP5截短蛋白分别以18。C、25。C、30。C、37。C利42。C住IPTG终浓度为0．6raM条什卜诱导表达4h：结果得知370C为最佳诱导温度。汰Da)97．J一66．：一j：．，一31．o一】：O．1一14．4一图2-7不同温度优化结果图M：蛋白marker：1：PRRSV—GP5的18。C诱导；2：25。C诱导；3：30。C诱导；4-37。C诱导；5：42。C26=一 河南农业大学2012届硕士学位论文诱导。Fjg．2-7OptimationofinductiontemperatureLaneM．Mid-rangeproteinmoIeCUIarweightmarkers(kDa)：Lane1，BL21(DE3)harboringpET—GP5nducedat18。C：Lane2．BL21(DE3)harboringpET—GP5inducedat25。C：Lane3．BL21(DE3)harboringpET-GP5nducedat30。CLane4。BL21(DE3)harboringpET—GP5nducedat37。C：Lane5．BL21(DE3)harboringpET—GP5nducedat42。C3．3．1．3重组PRRSV-GP5截短蛋白的不同时间诱导表达对重组PRRSV-GP5截短蛋自在370C利IPTG终浓度为0．6mM条件卜．诱导表达2h、4h、6h、8h、(IcDa)97．．I一硒．2一12．7—31．O一如．1—14．4—10h、12h利15h；结果得知6h为最佳诱导时间。M123456789·巴=E=【：1曩图2-8不同时间优化结果M：蛋白marker：1：pET28a空质料诱导；2：PRRSV—GP5未诱导；3：诱导2h：4：诱导4h；5：诱导6h；6：诱导8h；7：诱导10h：8：诱导12；9：诱导15h。Fig．2-8OptimizationofinductiontimeLaneM．Mid-rangeproteinmoIeCUIarweightmarkers(kOa)：Lane1，BL21(DE3)harboringpET一28anduced：Lane2．BL21(DE3)harborngpET—GP5unnduced：Lane3．BL21(DE3)harboringpET—GP5induced2h：Lane4．BL21(DE3)harborngpET—GP5nduced4h：Lane5．BL21(DE3)harborngpET—GP5induced6h：Lane6．BL21(DE3)harborngpET—GP5nduced8h：Lane7．BL21(DE3)harborngpET—GP5induced10h：Lane9．BL21(DE3)harboringpET—GP5induced12h：Lane10．BL21(DE3)harboringpET-GP5induced15h．3．3．2重组PRRSV—GP5截短蛋白的可溶性鉴定将截短的GP5蛋白在37。C以0．6mMIPTG诱导表达6h，120009离心2rain收集菌体沉淀，以!／20菌液体积的Lysisbuffer重悬菌体，冰浴20rain，进行超声裂解(I：作时间9s，间隔时间9s，循环99次，功率400W)，最终结果显示目的蛋白仅有--d'部分以可溶性蛋白形式存在，火部分目的蛋白以不溶的包涵体形式被表达出来。27 河南农业大学2012届硕士学位论文(kDa)97．．I一铂．2一12．7—31．O一：O．1一14．1一图2-9重组蛋白PRRSV—GP5的可溶性鉴定M：蛋白marker；1：PRRSV—GP5诱导菌液：2：菌液超声后上清；3：菌液超声后沉淀Fig2-9SoIubieanaIysiSofrecombinantPRRSV—GP5LaneM．Mid-rangeproteinmoIecuIarweightmarkerS(kDa)：Lane1．BL21(DE3)harbor；ngpET—GP5nduced：Lane1．$upernatantofBL21(DE3)harborngpET—GP5nducedafteruItrasoncatjon：Lane3．PreciPitareofBL21(DE3)harboringpET—GP5inducedafteruItrasonication3。4PRRSV-GP5截短蛋白免疫原性的ELlSA鉴定结果为确定重组PRRSV-GP5截短蛋白的免疫原性，采州ELISA对其进行活性鉴定，川CBS将PRRSV-GP5截短蛋白分别以10、7．5、5．0、2．5、2．0、1．0、0．5、0．25、0．125、0．0625和0．031251ag／mL，40c过夜包被；川l：400倍稀释的PRRSVHN07．1株和BJ．4株同f性血．消和PRRSV阴性血清作为一抗，l：1000倍稀释的兔抗猪lgG—HRP作为二抗，结果表明GP5截短蛋白与HN07．1株同I性血．消的反应性强丁．经典的BJ．4株⋯性血清，且当其被稀释剑0．125pg／mL时，依然可以被HN07．1株的附|生血．i肯检测到，此时P／N值为2．86：说明表达的GP5截短蛋白具有良女，免疫原性。1^景苫o141．21080．60．4O2O，芦，～芦，，∥夕血．消稀释度28 河南农业大学2012届硕士学位论文图2-10GP5截短蛋白与BJ-4和HN07-1株阳性血清反应性对比Fig．2-10ImmunoreactionoftruncatedGP5withpositiveseratoPRRSVstrainsBJ一4andHN07—132．52leur,】s．叶盆e：0．5O—■一p砌坫、’m∞’一1楝国性立活=-4--"pR殳s、．醇性虫t昔怼胁≯蓬璺≯一对3．5PRRSV-GP5截短蛋白免疫原性的lPMA鉴定结果在GP5截短蛋白免疫BALB／c小鼠后，采集小鼠血．清，以N蛋白的单抗作为陶I性对照，采心1PMA对小鼠血清与病毒的反应性进行了鉴定。结果表明，免疫后获得的小鼠血清能与PRRSV发生特异性反应，进一步证明了重组PRRSV-GP5截短蛋白的良好免疫原性，同时也说明重组蛋白上存在与病毒表面相一致的抗原表位。29 河南农业大学2012届硕士学位论文C誊意气瞵|i√”珥、I毋C图2-12PRRSV-GP5截短蛋白免疫原性的IPMA鉴定a：N蛋白单抗(1：100)b：猪阴性血清(1：100)C：鼠阳性血清(1：100)d：鼠阴性血清(1：100)Fig．2-12IdentificationoftheimmunogenicityofPRRSV-GP5byIPMAa：monocIonaIantibodytoNproteinofPRRSV(1：100)：b：PRRSVnegativeswineserum(1：100)：CPRRSVpositivemouseserum(1：100)：d：PRRSVnegativemouseserum(1：100)3．6PRRSV-GP5截短蛋白免疫原性的IFA鉴定结果为进一步证明重组PRRSV-GP5截短蛋白的免疫原性，使川GP5截短蛋白免疫BALB／c小鼠获得的小鼠血清，采刚JFA对小鼠血清与病毒的反应性进行了鉴定。结果表明，免疫后获得的小鼠血清能与PRRSV丁IFA中发生特异性反廊。国bC图2—13IFA实验结果da：N蛋白单抗(1：100)b：猪阴性血清(1：100)c：鼠阳性血清(1：100)d：鼠阴性血清(1：100)Fig．2-13ldentificatiORoftheimmunogenicityofPRRSV—GP5byIFA30b 河南农业大学2012届硕士学位论文a：iiiollooIonaIantibodytoNproteinofPRRSV(1：100)：b：PRRSVnegativeSWineserum(1：100)：CPRRSVpositivetnogseser帆“：100)：d：PRRSVnegativemOUSes6rLlffl(1：100)．4结论与讨论目前，GP5蛋白大多通过真核表达获得，Hae．SunJung等使用森林脑炎病毒表达系统在哺乳动物细胞中表达了GP5蛋白【85J：Min．YuanChia等在烟叶中表达了GP5蛋白，并发现通过给猪喂养这些烟草植物，能够产生特异性的体液和细胞免疫应答1861。考虑到蛋白表达量时，原核表达往往是最优先的选择。但GP5蛋白N端大约30个氨基酸为一信号肽序列，在原核表达系统中无法使用，因此需要截除。本实验过程采用原核表达载体pET28a(+)对去除信号肽的GP5蛋白于大肠杆菌BL21(DE3)宿主菌中进行表达时，发现目的蛋白不能表达；由丁．怀疑可能是稀有密码子的存在影响了蛋白表达，于是将含目的蛋白的重组质粒转化了大肠杆菌Rossette宿主菌，但仍旧未发现其表达，排除了稀有密码子的影响：之后实验采刚DNAStar对PRRSV-GP5蛋白进行了分子特征分析。软件分析表明PRRSVGP5蛋白的N端1．31个氨基酸为信号肽序列(Signalpeptide)，疏水性较强；中间氨基酸残基64．82位，87．99位，和107-129位三个区域同样表现出较强疏水性，而且抗原性及表面可能性较差。丁．是认为疏水跨膜区的存在可能阻碍GP5蛋白在大肠杆菌中的表达。在去除GP5基因上的信号肽基冈序列和跨膜区基冈序列后，重组质粒pET-GP5在大肠杆菌BL21(DE3)@获得了高效表达。SDS．PAGE和Westernblot证实目的蛋白得以表达之后，ELISA实验表明GP5截短蛋向与HN07．1株阿l性血清的反应性强于经典的BJ．4株阳性血清，且当其被稀释到O．125pg／mL时，依然可以被HN07-1株的阳性血清检测到，此时P／N值为2．86；说明表达的GP5截短蛋白具有良好免疫原性。在进行了BALB／C小鼠免疫后，分别采用ELISA、IPMA和IFA等实验对GP5截短蛋白的免疫反应性也进行了鉴定，在这些实验中重组的GP5截短蛋白均表现出较好免疫反应性。实验获得了具有良好生物活性的重组GP5截短蛋白，可以用于制备PRRSV抗体检测的试纸或试剂盒及疫苗；同时可以被用来进行小鼠免疫制备单克隆抗体、PRRSV抗原检测试纸或试剂盒及其它相关基础与应用研究。 河南农业大学2012届硕士学位论文1引言第三部分PRRSV抗体间接EL|SA检测方法的建立PRRS是猪的一种高度接触性传染性疾病；其细胞嗜性相当较窄，主要侵害猪的单核巨噬细胞系，诱导细胞凋亡，引发免疫抑制。临床上主要引起猪的呼吸系统疾病、繁殖障碍及各种继发感染。白PRRS山现以来，它已在世界范围内传播，对养猪业带来了巨大的经济损失。我国丁1996年哈尔滨兽医研究所在国内首次分离到PRRSV，证实本病在国内存在【7】o2006年，我国十儿个省J’+泛流行一种严重的生殖道疾病，称为无名高热，被证实是一种由新型毒力更强的PRRSV毒株引起18'91。当前对丁PRRS的一个主要麻对措施还是进行疫苗接种及定期检测血清抗体水平。但对丁川疫苗免疫接种来防治PRRS，依然存在许多不同看法。目前临床廊州的PRRSV疫苗有减毒活疫苗和灭活苗。灭活苗产生的免疫以体液免疫为主，对清除PRRSV感染的巨噬细胞无能为力，免疫效果不理想【31；减毒活疫苗存在返强的可能性，已有报道证实有猪场虑川PRRSV减毒活疫苗后爆发PRRS或从猪场分离到的疫苗来源的PRRSVfl皂91起肺炎的发生164J，冈此开发安全高效的新型疫苗是当前预防PRRS的迫切需要。对于疫曲临床使刚效果的监测及评价也就变得十分重要。检测PRRSV血．清抗体的主要方法有ELISA、免疫过氧化物酶细胞单层实验(IPMA)以及免疫荧光染色(IFA)、血．清中雨I实验(SN)等。AlbinaE．等将PRRSV接种PAM细胞制备病毒抗原，首次建立了检测PRRSV抗体的间接酶联免疫吸附实验。TakikawaN．等报道用MARC．145细胞培养PRRSV抗原，建立的间接ELISA法，解决了过去难以获得足够抗原的难题，适．IIj丁人规模检测PRRS抗体p91。但是用PRRS全病毒作为检测抗原时，制备成本高而且可能有散毒危险等不足之处。GP5蛋白是PRRSV主要的囊膜蛋白，连续跨膜三次，在胞外区与M蛋白通过二硫键交联形成二聚体；且针对GP5蛋白的抗体与病毒中利作用直接相关。开发以GP5蛋白为包被原的ELISA检测方法，不仅可以检测PRRSV感染，对丁疫苗免疫效果评价及保护力都具有重要作川。2材料与方法试剂名称购买厂家HRP标记羊抗猪IgG及羊抗鼠IgG新生胎牛血清3，3’，5，5’．四甲基联苯胺(TMB)华美公司GIBCO公司德国Sigma公司2．1ELISA常规操作流程1．包被：用CBS稀释抗原，96孔板中每孔加入509L抗原，放置于4。C过夜包被；2．封闭：PBST洗涤三次，甩干；每孔加满封闭液5％脱脂奶，将96孔板置于37。C封闭1h，32 河南农业大学2012届硕士学位论文使用PBST洗涤三次；3．加一抗血清：用PBS将待检测血清作1：400稀释样品，每孔加50p．L稀释后的血清，同时设阴性、阳性和空白对照。将96孔板置于370C反应30min，使用PBST洗涤三次；4．加酶标二抗：将羊抗鼠IgG．HRP或兔抗猪lgG—HRP用5％脱脂奶作1：1000倍稀释，每孔加501aL稀释后的二抗，将96孔板置于370C反应30min，使用PBST洗涤三次；5．加酶显色底物：每孔加入509L酶底物TMB，37。C反应5-10min；6．反应终．II二：每孔加入50pL终．It-．液2MH2S04，酶标仪测定OD450值；7．结果判定：P／N值大于2．5时的血清可判定为阳性。2．2ELISA检测条件优化为确保ELISA在最佳的条件进．1：作，保证高特异性和高敏感性；实验对抗原包被浓度、血清稀释度、酶标二抗稀释度、包被液及血清、二抗孵育时间、显色时间等相关参数进行了优化。2．2．1重组PRRSV-GP5截短蛋白抗原最佳包被浓度的确定使用CBS将纯化的重组PRRSV—GP5截短蛋白按照5pg／mL、2．599／mL、1．251tg／mL、0．6199／mL、0．31lttg／mL及0．15pg／mL的浓度梯度包被96孔ELISA板，50I．tuE，置于4。C包被过夜；其余步骤按照ELISA常规操作进行。同时平行设置阴性对照。比较阴阳性血清OD450及P／N值，阳性血清OD450值在1．0左右且P／N值最火时的抗原包被浓度为最佳：【作浓度。2．2．2最佳血清稀释度的确定将重组的PRRSV-GP5截短蛋白按上述的最佳包被浓度进行包被，50¨U孔，置于4。C包被过夜；封闭后，将阴性和阡I性血清分别平行作1：100、l：200、1：400、l：800、1：1600及l：3200稀释，509L／孔。其余步骤按照ELlSA常规操作进行。比较阴阳性血清OD450及P／N值，阳性血清OD4so值在1．0左右且P／N值最大时的血清稀释度为最佳工作条件。2。2．3酶标二抗最佳工作浓度的确定重组的PRRSV-GP5截短抗原按上述的最佳包被浓度进行包被，最佳一抗稀释度进行反应后，将酶标二抗按照梯度分别进行1：500、1：1000、1：2000、l：4000、l：8000及1：16000倍稀释。其余步骤按照ELISA常规操作进行。比较阴阳性血清OD450及P／N值，阳性血清oi：)450值在1．0左右且P／N值最大时的酶标二抗稀释度为最佳工作条件。33 河南农业大学2012届硕士学位论文2．2．4一抗血清最佳反应时间的确定重组的PRRSV-GP5截短抗原按上述的最佳包被浓度进行包被，置于4。C包被过夜；封闭后，将血清按照最佳稀释条件进行稀释；分别设定阴性及阳性血清与抗原反应时间为10min、20min、30min、45min、60min及90min。比较阴阳性血清00450及P／N值，阳性血清OD450值在1．0左右且P／N值最人时的反应时间为一抗血清最佳孵育时间。2．2．5酶标二抗最佳作用时间的确定重组的PRRSV-GP5截短抗原按上述的最佳包被浓度进行包被，最佳一抗血清稀释度以最佳孵育时间进行反惠后，设定酶标二抗以最佳．1：作浓度与一抗作J=_lj为10min、20min、30min、45min、60min及90min。比较阴圈I性血清00450及P／N值，卧I生血清01：)450值在1．0左右且P／N值最人时的反廊时间为酶标二抗最佳孵育时间。2．2．6重组抗原包被条件的确定以最适的抗原浓度包被酶标板，100p．L／：fL，抗原包被条件分别为：37。C2h；37。C2h加4。C过夜：4。C过夜：37。clh利37。C1h加40C过夜。在不同的包被条件下，加入的一抗为阴阳性血清最佳稀释度，按照常规ELISA方法操作，重复两次，最后，比较阴刚性血清OD450及P／N值，最终确定重组抗原最佳包被条件。2．2．7封闭液的选择以重组蛋白抗原最佳包被浓度和最佳包被条件包被酶标板，以1％BSA、0．1％明胶、5％胎牛血清以及5％脱脂奶作为封}j』液进行封闭，2009L／：fL，37。C封闭2h，!jnh,vA最佳稀释度稀释的阴豫I性血清，按照常规ELISA方法操作，重复两次，最后，比较阴刚性血清OD450及P／N值，最终确定最佳封闭液。2．2．8显色时间的确定在确定以上反应条什的基础上，加入底物斤，分别显色5min、10min、15min。比较阴阳性血消OD450及P／N值，最终确定最佳显色时间。2．2．9间接ELISA临界值的确定从临床中收集PRRSV阴性猪血清31份，用建立的间接ELISA方法进行检测，重复两次，酶标仪读取OD450值，计算这31份血清OD450的平均值(X)和标准方差(SD)，根据公式：临界值=X+3SD，当血清样品OD450>临界值时，结果判定为阳性；当血清样品00450