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1、微卫星分子标记开发操作指南1、250ngDNA酶切（DNA必须比较纯）反应体系：ddH2017.25µL10XbufferR2.5µLMseⅠ(10U/µL)0.25uL（2.5U）DNA(50ng/µL)5µL总反应体系25µL,PCR仪内37℃,3h酶切,65℃，15分钟失活。电泳检测：1.5%的琼脂糖，150V电泳20min，点样量约9µL-10µL，剩余的15µL用于连接。2、酶切后的产物连接。反应体系：ddH208.8µLMseⅠ接头1uM(3µL)即1pmol/µL0.405nmol/μl=405pmo
2、l/μlT4buffer3µLT4DNAligase(5U/µL)0.2µL(1u)酶切后DNA15µL总反应体系30µL,PCR仪内37℃,2h或21℃，过夜连接，65℃10min失活。MseⅠ接头5’-TACTCAGGACTCAT-3’/5’-GACGATGAGTCCTGAG-3’接头：10µL100pmol/µL+90µLddH2O=100µL10pmol/µL3、连接的产物用灭菌蒸馏水稀释10倍（10µL酶切产物+90µL水）4、稀释的连接产物预扩增。反应体系：无菌水9.6µLTaqDNA聚合酶buffer
3、1X2µLMgCl21.5mM2µLMseⅠ-Nprimer120ng1µLdNTPs200uM0.2µLTaqDNA聚合酶0.4U0.2µL稀释的连接产物5µL5µL总反应体系20µL。反应条件为：94℃30s，53℃60s，72℃60s，14-26个循环（循环数需优化14-17-20-23-26）MseⅠ-N引物为：5’-GATGAGTCCTGAGTAAN-3’，N表示包括所有4种可能的选择碱基N=A，T，C，G,1.5%琼脂糖电泳检测5、最佳反应条件下，PCR重新扩增一次，获得几百ng的扩增产物，试剂盒纯化。
4、6、杂交*5’端生物素化的探针的选择：常见的几种探针：（AC）15，（CT）15，（GA）15，（CAA）10，（AAG）8，（GATA）7，（ACCT）6*250ng-500ng扩增的DNA与50-80pmol的生物素化的探针混合，加入总体积100µL的SSCX4.2和SDS0.07%中（即21µLSSCX10加0.7µLSDS10%，加水至100µL）。2µg的DNA与200pmol的探针在终体积500µL终浓度0.5XSSC溶液中，60℃杂交2小时。*95℃3min变性，室温，15min退火7、富集纯化的带接
5、头的DNA（2-2.5微克）约30-50µL，95℃变性5分钟，与3’端生物素化的（CA）10或（GA）10或5’生物素化探针（60℃杂交2h）200pmol（1µL）在50℃0.5倍SSC杂交1.5h,加入600µL的磁珠重悬于100µL的0.5XSSC溶液中，室温，20分钟。300µL的预热至50℃的0.1XSSC溶液洗2次300µL的0.1XSSC溶液室温洗2次DNA洗脱至100µL的预热至50℃的双蒸水中，2次试剂盒操作说明：轻弹管底，使磁珠重悬，用磁场吸附磁珠,小心去上清（不能离心!!）用300µL的0.
6、5XSSC溶液重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清(重复2次)重悬于100µL的0.5XSSC,加入DNA探针混合物室温温育10分钟，每1-2分钟，倒置管子混匀吸附磁珠，去上清300µL的0.1XSSC溶液重悬并清洗磁珠，磁场吸附，去上清。重复3次，最后一次去上清尽量去干净（洗完后的上清保留以便查找实验故障的原因）重悬于100µL的水中，轻弹管底是磁珠重悬磁场吸附磁珠，上清液（我们需要的产物）转移至灭菌的管子中，保留磁珠。加入150µL的水，重复洗脱一遍，共得到250µL的产物富集*1mg的磁珠用TEN100（10mM
7、Tris-HCl,1mMEDTA,100mMNaCl,pH7.5）冲洗，重悬于40µL的TEN100中。*加入10µL（约1ug）的不相关的PCR产物（为了尽量减少非特异性结合的DNA）*DNA-探针混合物用300µL的TEN100稀释*稀释的DNA-探针混合物加入洗好的磁珠，室温温育30min，温育过程中不时温和搅拌(Incubateonrotator,orsidewaysinorbitalshakeronslowspeedat50for30min.)*15000转，离心1min，（以便查找失败原因）*非严格冲洗
8、：加入400µL的TEN1000（（10mMTris-HCl,1mMEDTA,1MNaCl,pH7.5）,室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，上清转移至另一管中保存备用。重复2次。*严格冲洗：加入400µL的SSC0.2X，0.1%SDS，室温下轻柔混合5min，15000转，离心1min，上清转移至另一管中保存备用。重复2次。8、加入50µ
