大菱鲆微卫星标记的开发与其应用

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1、学校代码：10264研究生学号：M100101037上海海洋大学硕士学位论文题目：大菱鲆微卫星标记的开发与其应用Isolationandapplicationof英文题目：microsatellitemarkersforTurbot(ScophthalmusmaximusL.)专业：水产养殖研究方向：海水鱼类遗传改良研究姓名：李猛指导教师：马爱军研究员二0一三年四月十日大菱鲆微卫星标记的开发与其应用学位论文完成日期：指导教师签字：答辩委员会成员签字：上海海洋大学学位论文原创性声明本人郑重声明：我恪守学术道

2、德，崇尚严谨学风。所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经明确注明和引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品及成果的内容。论文为本人亲自撰写，我对所写的内容负责，并完全意识到本声明的法律结果由本人承担。学位论文作者签名：日期：年月日上海海洋大学学位论文版权使用授权书学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅或借阅。本人授权上海海洋大学可以将本学位论文的全部

3、或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在年解密后适用本版权书。本学位论文属于不保密□学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日上海海洋大学硕士学位论文大菱鲆微卫星标记的开发与其应用摘要1.利用FIASCO（FastIsolationbyAFLPofSequencesContainingrepeats）法筛选大菱鲆微卫星DNA序列。先用MseI酶酶切大菱鲆的基因组DNA，加接头，用M00通用引物PCR扩增，建立小片段基因组文库；再采用

4、以生物素标记的(CA)12，(AC)17，(AG)17，(AT)17，(AAT)10，(AAC)10，(GACA)10，(GATA)10为寡核苷酸探针，与串联重复序列杂交，构建大菱鲆的微卫星DNA富集文库；与载体连接，转入感受态细胞中，经含氨苄的LB培养基培养，初筛出2027个阳性菌落；经三组PCR反应，二次筛选出655个克隆，富集效率为32.3%。测序后得到597条序列，经分析76个克隆（12.73%）缺乏明显的微卫星序列，65个克隆为雷同序列（10.89%），因此本实验共得到469条含有串联重复序列的

5、独立克隆，此次FIASCO法的富集效率为78.56%。2.对上述筛选的微卫星序列进行了特征分析。在469条单一序列中分析得到597个微卫星位点。其中完美型为309个，占51.76%；非完美型为207个，占34.67%；复合型81个，占13.57%。所得到的微卫星DNA核心序列的重复次数在3～96次之间，平均重复数为13.39次，重复次数主要集中在3～19次，占78.02%；所筛大菱鲆微卫星DNA重复类型最多是二碱基，占85.25%；重复单元类别最多的是(CA/GT)n，占77.6%，其次是(AG/CT)n

6、，占11.50%。所筛微卫星序列长度主要集中在150bp～349bp之间（81.3%）。此外，还有1个克隆含有重复单元为八碱基(AGACGGAC)n的串联重复序列，即小卫星序列，另两个克隆分别含有(AC)6(GC(AC)3)6和(TG)14(AGCGCA(TG)5)4重复序列。3.开发大菱鲆微卫星引物。分析得到的469个微卫星位点侧翼序列情况，有384个位点（81.88%）两端有合适的侧翼序列进行引物开发；结合实际情况共设计了413对引物，其中有360对能够得到稳定表达的产物。经微卫星标记初筛试验，168

7、对引物（46.7%）的扩增产物带型单一，183对引物（50.8%）的PCR产物有多态性，其中110个微卫星位点（30.6%）符合遗传连锁图谱作图标准。4.进行大菱鲆微卫星标记初筛实验，以期获得构建大菱鲆遗传连锁图谱的作图标记。通过拟作图家系的2个亲本和6个Fl代个体对748对微卫星引物（上述实验开发的360对引物和文献已发表的388对引物）进行初步筛选，1上海海洋大学硕士学位论文其中有721对引物能够获得清晰的扩增产物：254对引物的扩增产物为单一目的条带；467对引物扩增产物的目的条带具有多态性，其中有

8、294个微卫星位点符合遗传图谱作图标记的标准。5.微卫星标记在作图家系F1代中的分离模式。从初筛试验获得的294个符合作图标准的微卫星位点中，随机选取120对微卫星引物，在拟作图家系的2个亲本和92个Fl代个体中进行标记分离情况研究，其中115对引物能够获得清晰的扩增产物。共得到五种分离模式（♀×♂）：abxcd、efxeg、hkxhk、lmxll、nnxnp；每个标记分离产生2~4个等位基因，共获得254个等位基因，平均等位