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《猪瘟病毒e2基因的克隆及原核和真核表达载体的构建》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、猪瘟病毒E2基因的克隆及原核和真核表达载体的构建70HeilongjiangAnimalScienceandVeterinaryMedicineNo102009猪瘟病毒E2基因的竞睡及原核朝真核袁达载体的构建黄涛,汤德元,嵇辛勤,曾智勇,徐健,王彬(贵州大学动物科学学院,贵州贵阳550025)中图分类号:$852.651文献标识码:B文章编号:1004—7034(2009)10—0070-03猪瘟(Classicalswinefever,CSF)是由猪瘟病毒(CSFV)引起的猪的高度接触性传染病
2、,严重危害养猪业的发展.猪瘟病毒全基因组为12.5kb左右的正链RNA病毒,编码多聚蛋白,在分类学地位上为黄病毒科瘟病毒属.所编码的猪瘟病毒结构蛋白为C和包膜糖蛋白Eros,E1,E2.其中Eros,E2是病毒诱导机体产生中和抗体的两个主要保护性抗原,同时也是病毒吸附进入敏感细胞的必需蛋白.猪瘟E2基因编码的gp55蛋白是引起动物产生保护性免疫的主要抗原蛋白,与完整猪瘟病毒相比,重组蛋白无感染性,而且具有易产生和易纯化等优点.研究通过对E2蛋白的体外重组,为猪瘟的预防与控制提供安全高效的基因工程
3、疫苗及配套的诊断抗原打下基础.1材料猪瘟病料,BI21感受态细胞,DH5e~,pMD18一T载体,原核表达质粒pET一32a(+),真核表达质粒pcDNA3.1(+).TrizolLS@Reagent试剂盒,SuperScriptm反转录酶,购自Invitrogen公司;RNaseInhibitor,dNTPs,DTF,DL一2000Marker,PCR试剂盒,TaqDNA聚合酶,限制性内切酶,小量质粒DNA提取试剂盒与小量胶回收试剂盒等,均购自宝生物工程(大连)有限公司;pfuDNA聚合酶等,
4、购于默克公司.根据GenBank报告的猪瘟病毒Alfort株,Brescia株和C一株的cDNA序列,通过比对分析,并用Oligo6.0软件设计1对特异性引物,在E2基因上游5端设计了BamHI酶切位点,E2基因下游5端设计了Hindm酶切位点,预计扩增片段长度为1137bp.引物由宝生物工程(大连)有限公司合成,其序列及位置如下:P15一CGGGATCCCGGCTAGCCTGCAAG—GAAGATFAC一3,长2440～2464bp;P25一收稿日期:2009—02—13;修回日期:2009—
5、08—09基金项目:贵州省省长基金项目((2005)184号)作者简介:黄涛(1981一),男,硕士研究生.通讯作者:汤德元(1964一),男,教授,博士,硕士生导师CCCAAGCTFGACCAGCGGCGAGI'I'G'l'I'C.1GTI'AG一3,长3560～3536bp.2方法2.1E2基因的克隆2.1.1病料的处理与总RNA的提取将采集的猪瘟病料用灭菌PBS研磨,用匀浆器磨细后,加入终浓度为1000IU/mL的双抗感作过夜;于一20cc反复冻融3次,12000r/min离心5～10mi
6、n;收集细胞悬液250L,按Invitrogen公司的TrlzolLS@Reagent试剂盒操作说明书提取病毒总RNA,在生物安全柜中37C干燥15～20min;加入2LDT1s,7IxLDEPC水,1IALRNaseInhibitor,混匀,65qC溶解5min后,冰浴1min;及时进行RT—PCR,或于一80℃保存(保存时间不能太长),待检.2.1.2RT—PCR扩增及目的基因的回收和纯化对提取的RNA进行反转录.取5×FSBuffer2IxL,dNTPs(10mmolfL)0.5L,Sup
7、erScriptmReverseTranscriptase0.5IxL,RNA酶抑制剂(40U/L)0.25IxL,flit(0.1mol/L)0.5L,下游引物(10mmol/L)1.25L,RNA模板5L(反转录总体系为1OL)在PCR仪中42℃作用1h.立即进行PCR扩增,取ddH2O36IAL,10×PCRBuffer(25retool/LMgC1,)5ixL,10mmol/LdNTPs1tAL,上,下游引物(10mmol/L)PI,P2各2.5L,RT产物2L和pfuDNA聚合酶1L,
8、构成50体系后混匀置于PCR仪上进行循环扩增.反应条件为94℃2min;94℃30S,52℃30S,72℃1min,共35个循环;7210min.扩增完成后,先取5PCR产物用1%琼脂糖凝胶电泳检测,当结果与预期条带一致时再将全部PCR产物电泳后,用清洁的刀片切下含有目的片段的凝胶,按DNA凝胶纯化试剂盒说明书进行回收和纯化.2.1.3目的DNA片段加A及回收纯化反应体系(40txL):回收的DNA30txL,10mmolfLdATP1IAL,TaqDNA聚合酶1IAL,10×TaqBuffer
