近β钛合金表面微弧氧化处理对成骨细胞早期行为的影响论文

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1、近β钛合金表面微弧氧化处理对成骨细胞早期行为的影响论文赵领洲，张玉梅，魏艳萍，李健学【摘要】目的：观察微弧氧化（MAO）方法对近β钛合金Ti5Zr3Sn5Mo15Nb（TLM）表面处理后对成骨细胞早期行为的影响.方法：用脉冲直流电源在两个不同电压下对TLM表面进行微弧氧化处理，并用电镜观察试样表面形貌.MTT方法检测成骨细胞增殖，用商业试剂盒检测总蛋白合成及碱性磷酸酶（ALP）活性.结果：微弧氧化处理可以在TLM表面形成一层多孔生物活性氧化层，其形貌与微弧氧化电压有关，低电压时形成的孔洞结构较小.freel

2、m，厚度1mm；西北有色金属研究院）；微弧氧化电源MAO100（西安交通大学金属材料强度国家重点实验室）；DMEM培养基（Gibco公司）；新生牛血清（Gibco公司）；MTT（Solarbio公司）；蛋白测定试剂盒和ALP测定试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；24/96孔培养板（Costar公司）；扫描电子显微镜（日本，JSM6460）.1.2方法1.2.1试样制备及试样形貌观察TLM圆片表面用碳化硅砂纸400号至1200号顺序抛光.微弧氧化处理之前试样依次采用丙酮超声清洗15min，去离子水30m

3、in，空气干燥.微弧氧化电解液含有0.04mol/LβGP（C3H7Na2O6P·5H2O)和0.2mol/LCA(C4H6CaO4·H2O),电源频率100Hz，占空比20%，处理时间5min.根据MAO所采用电压不同，试样分为3组：P：抛光组，作为对照；MAO300组：微弧氧化最终电压为300V；MAO450组：微弧氧化最终电压为450V.试样在用于实验之前依次用丙酮、无水乙醇、750mL/L乙醇及去离子水各超声清洗20min，131℃高压蒸汽消毒30min.采用扫描电子显微镜观察试样表面形态，工作电压20k

4、V.1.2.2细胞培养成骨细胞由胰酶胶原酶连续消化新生1d大鼠头盖骨获得.机械方法轻柔地去除头盖骨表面及骨缝处的软组织.为了降低成纤维细胞污染，骨片先用胰酶消化90min并弃上清.细胞培养液为DMEM，100mL/L新生牛血清、10mL/L青霉素、10mL/L链霉素.成骨细胞表型由ALP及矿化结节染色验证.37℃，50mL/LCO2湿润条件下培养，2～5代用于细胞实验.1.2.3细胞增殖实验试样放在24孔培养板内，每组试样随机选3个样本.细胞接种密度为2×104/孔，细胞培养液为1mL.细胞培养24，72，120

5、，68h后终止细胞培养，PBS漂洗2次，每孔加入5g/LMTT200μL和800μL无血清无酚红DMEM.37℃孵育4h后吸弃上清，加入1mLDMSO溶解生成的结晶物，每孔取3份200μL溶解液转移到96孔培养板，测A490nm值.1.2.4细胞总蛋白合成测定试样放置和细胞接种同细胞增殖实验.细胞培养7d后吸弃培养液，PBS漂洗2次.每孔加入蒸馏水1mL，3个冻融循环裂解细胞.每孔取3份100μL细胞裂解液转移到96孔培养板，空白孔加100μL生理盐水，3个标准孔各加入100μL标准蛋白（70g/L），然后各加入2

6、00μL蛋白测定试剂，37℃孵育30min.空白孔调零，测A570nm值，总蛋白浓度=A570nm样品/A570nm标准×标准蛋白浓度，结果用7d的MTTA490nm值标准化.1.2.5细胞ALP活性测定采用细胞总蛋白合成测定的同一细胞裂解液测量细胞ALP活性.每孔取3份100μL细胞裂解液转移到96孔培养板，空白孔加入100μL蒸馏水，然后各加入150μLALP测定工作液（使用前先37℃预保温10min），37℃反应30min后加入50μL1mol/LNaOH终止反应.空白孔调零，测A570nm值并用细胞总蛋白合

7、成标准化.统计学处理:采用SPSS11.0统计软件进行数据处理，用方差分析和SNK检验比较组间差别，取α=0.05.2结果2.1试样表面形貌试样的表面形貌如图1所示，抛光表面可见沿抛光方向平行排列的沟槽，并可见散在于表面的金属薄片.微弧氧化后表面沟槽消失，形成多孔结构，由均匀分布的火山口样突起相互连接组成，突起中央有孔洞存在.当电压为300V时，孔洞直径约0.2～2.5μm；当电压升高到450V，突起及孔洞的尺寸均增大，孔洞直径约1.0～7.0μm，而孔隙率较300V时低.2.2成骨细胞在试样表面的增殖大鼠成骨细胞

8、在TLM表面的增殖结果如图2所示.在24h和72h，成骨细胞在微弧氧化表面的增殖均显著高于抛光表面（P0.05）.到120h时，高电压微弧氧化表面细胞增殖仍显著高于抛光表面（P0.05），低电压表面细胞增殖低于抛光表面但无统计学差异.当培养168h后，微弧氧化表面的细胞增殖数目与抛光表面的无统计学差异.在24，120，168h时，高电压微弧氧化表面的细胞增殖