近β钛合金表面微弧氧化处理对成骨细胞早期行为的影响

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1、近β钛合金表面微弧氧化处理对成骨细胞早期行为的影响作者：赵领洲，张玉梅，魏艳萍，李健学【摘要】目的：观察微弧氧化（MAO）方法对近β钛合金Ti5Zr3Sn5Mo15Nb（TLM）表面处理后对成骨细胞早期行为的影响.方法：用脉冲直流电源在两个不同电压下对TLM表面进行微弧氧化处理，并用电镜观察试样表面形貌.MTT方法检测成骨细胞增殖，用商业试剂盒检测总蛋白合成及碱性磷酸酶（ALP）活性.结果：微弧氧化处理可以在TLM表面形成一层多孔生物活性氧化层，其形貌与微弧氧化电压有关，低电压时形成的孔洞结构较小，高电压时形成的孔洞结构较大.成骨

2、细胞在微弧氧化表面的早期增殖（24，72，120h）及7d细胞总蛋白合成明显高于抛光表面，且细胞在高电压微弧氧化表面的增殖优于低电压表面.而培养7d后微弧氧化表面的细胞ALP活性明显低于抛光表面，且高电压表面的最低.结论：微弧氧化处理改变了TLM表面形貌以及其它特性，从而促进成骨细胞在其表面的增殖及合成分泌活性，但抑制其ALP活性.不同电压下形成的不同微弧氧化形貌对成骨细胞的早期行为有影响.【关键词】钛合金；微弧氧化；表面特性；成骨细胞0引言目前，广泛应用于临床的纯钛和Ti6Al4V种植体材料中存在着铝（Al）和钒（V）的潜在毒性及弹

3、性模量太大易造成界面应力屏障等问题.为此，我们开发了一种不含Al和V的近β钛合金Ti5Zr3Sn5Mo15Nb（TLM），其弹性模量较纯钛和Ti6Al4V低，并且其弹性模量、强度及可塑性等机械性能匹配优于其它报道的β钛合金［1］，有希望成为新一代骨植入材料.体外细胞与种植材料的相互作用在一定程度上可以反映材料的生物活性.细胞对材料的反应受到材料表面性质影响，目前普遍认为粗糙的表面形貌有利于促进细胞的生物学反应［2］.微弧氧化（MAO）方法可以在材料表面生成一层多孔粗糙且与基底紧密结合的氧化膜，有利于改善种植体表面生物相容性［3

4、］，而微弧氧化膜的表面特性如孔隙大小、孔隙率及粗糙度等可通过微弧氧化参数如电压等来控制调节.我们采用两个不同的电压对TLM进行微弧氧化处理，观察不同形貌对成骨细胞早期增殖、总蛋白合成及碱性磷酸酶（ALP）活性的影响.1材料和方法1.1材料TLM圆片（直径14.5mm，厚度1mm；西北有色金属研究院）；微弧氧化电源MAO100（西安交通大学金属材料强度国家重点实验室）；DMEM培养基（Gibco公司）；新生牛血清（Gibco公司）；MTT（Solarbio公司）；蛋白测定试剂盒和ALP测定试剂盒（北京中生北控生物科技股份有限公司）；24/

5、96孔培养板（Costar公司）；扫描电子显微镜（日本，JSM6460）.1.2方法1.2.1试样制备及试样形貌观察TLM圆片表面用碳化硅砂纸400号至1200号顺序抛光.微弧氧化处理之前试样依次采用丙酮超声清洗15min，去离子水30min，空气干燥.微弧氧化电解液含有0.04mol/LβGP（C3H7Na2O6P·5H2O)和0.2mol/LCA(C4H6CaO4·H2O),电源频率100Hz，占空比20%，处理时间5min.根据MAO所采用电压不同，试样分为3组：P：抛光组，作为对照；MAO300组：微弧氧化最终电压为300V；

6、MAO450组：微弧氧化最终电压为450V.试样在用于实验之前依次用丙酮、无水乙醇、750mL/L乙醇及去离子水各超声清洗20min，131℃高压蒸汽消毒30min.采用扫描电子显微镜观察试样表面形态，工作电压20kV.1.2.2细胞培养成骨细胞由胰酶胶原酶连续消化新生1d大鼠头盖骨获得.机械方法轻柔地去除头盖骨表面及骨缝处的软组织.为了降低成纤维细胞污染，骨片先用胰酶消化90min并弃上清.细胞培养液为DMEM，100mL/L新生牛血清、10mL/L青霉素、10mL/L链霉素.成骨细胞表型由ALP及矿化结节染色验证.37℃，50mL/

7、LCO2湿润条件下培养，2～5代用于细胞实验.1.2.3细胞增殖实验试样放在24孔培养板内，每组试样随机选3个样本.细胞接种密度为2×104/孔，细胞培养液为1mL.细胞培养24，72，120，68h后终止细胞培养，PBS漂洗2次，每孔加入5g/LMTT200μL和800μL无血清无酚红DMEM.37℃孵育4h后吸弃上清，加入1mLDMSO溶解生成的结晶物，每孔取3份200μL溶解液转移到96孔培养板，测A490nm值.1.2.4细胞总蛋白合成测定试样放置和细胞接种同细胞增殖实验.细胞培养7d后吸弃培养液，PBS漂洗2次.每孔加入蒸馏水1

8、mL，3个冻融循环裂解细胞.每孔取3份100μL细胞裂解液转移到96孔培养板，空白孔加100μL生理盐水，3个标准孔各加入100μL标准蛋白（70g/L），然后各加入200μL蛋白测定试剂，3