扇贝糖胺聚糖对ⅰ型单纯疱疹病毒的抑制作用论文

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1、扇贝糖胺聚糖对Ⅰ型单纯疱疹病毒的抑制作用论文于囡刘赛韩建建孙福生【摘要】目的研究扇贝裙边糖胺聚糖(SSGAG)不同浓度及不同作用时间对Ⅰ型单纯疱疹病毒(HSVⅠ)的抑制作用。方法以HSVⅠSM44株感染非洲绿猴肾细胞(Vero细胞),观察病毒感染后的细胞变性反应（CPE）,并检测不同浓度SSGAG及不同作用时间对HSVⅠ复制的抑制作用。结果与病毒对照组相比，SSGAG各浓度组（100、50、25mg/L）能有效保护经HSVⅠ感染的Vero细胞，使细胞活性增强（F=27.54,P0.01）；并减弱HSVⅠ导致的病变效应，抑制

2、病毒的复制，并且随着药物作用时间的延长，药物抗病毒效应逐渐增加，最高达88.64%。结论SSGAG体外具有明显的抗HSV1病毒作用。【关键词】糖胺聚糖扇贝裙边疱疹病毒Ⅰ型人［ABSTRACT］ObjectiveTostudytheinhibitoryeffectofglycosaminoglycanfromscallopskirt(SSGAG),indifferenttimeandconcentration,ontypeⅠherpessimplexvirus(HSVⅠ).MethodsTheVerocellse,onreplic

3、ationofHSVⅠinoglycan;Scallopskirt;Herpesvirus1,human单纯疱疹病毒(HSV)属疱疹病毒科,.freel，FBS）为杭州四季青生物工程材料有限公司产品；胰蛋白酶为AMRESCO公司产品；乙二胺四乙酸二钠（EDTA）由青岛海泰生物技术有限公司分装；酸性异丙醇为上海亨达化学试剂有限公司产品；四甲基偶氮唑蓝（MTT）为Sigma公司产品。TC2323型CO2培养箱为美国FormaScientific公司产品;XDP1型倒置显微镜为日本Olympus公司产品;ELx800型酶联免疫检测仪为美国B

4、ioTek公司产品;细胞培养板为Costar公司产品;超净工作台为苏净集团安泰公司产品。标准单纯疱疹病毒Ⅰ型(HSVⅠ)SM44株由中国协和医科大学提供。HSVⅠ在Vero细胞中传代，毒种于-80℃保存。SSGAG(青岛大学医学院药理学教研室提供)使用前用无血清DMEM培养液稀释到所需浓度。实验分为正常细胞对照组、病毒对照组、SSGAG各浓度组（100、50、25mg/L）。1.2实验方法1.2.1细胞培养Vero细胞由农业部动物检疫所惠赠。于DMEM高糖基础培养液中加入体积分数0.10的小牛血清、100U/mL青霉素及100mg

5、/L链霉素，置体积分数为0.05的CO2孵箱中37℃常规培养。1.2观察指标测定1.2.1病毒毒力测定3用病毒的致50%组织培养感染量（TCID50）表示病毒毒力。将Vero细胞接种于无菌96孔板,长成单层后，将HSVⅠ病毒原液进行连续10倍递次稀释,稀释度为10-1～10-9，每孔接种上述系列稀释度的病毒稀释液100μL,于37℃吸附1.5h后换维持液继续培养,每个稀释度设6个复孔,并设6孔正常细胞对照。每日在倒置显微镜下观察细胞病变（CPE）。CPE达50%以上计为病变孔，记录病变程度和孔数,待细胞病变稳定后，判定结果。记录标准：C

6、PE0%为“-”；CPE1%～25%为“+”；CPE26%～50%为“”；CPE51%～75%为“”；CPE76%～100%为“”。根据ReedMuench法计算病毒的TCID50。1.2.2SSGAG对HSVⅠ复制的抑制作用将100TCID50HSVⅠ病毒液接种到单层Vero细胞孔中,每孔100μL，37℃吸附1.5h,弃去病毒液更换含有不同浓度的SSGAG（100、50、25mg/L）维持液，每孔200μL,继续培养72h,每日在倒置显微镜下观察CPE并记录结果。记录标准同上。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，每组设6

7、个复孔。72h后，当病毒对照组细胞病变达75%以上时，应用MTT法测吸光度（A）值，并计算药物抗病毒有效率(ER%)。ER%=(药物组的平均吸光度值-病毒对照组的平均吸光度值)/病毒对照组的平均吸光度值×100%。1.2.3SSGAG的不同作用时间对病毒的抑制效应将一定量病毒液（100TCID50HSVⅠ）攻击单层Vero细胞孔,每孔100μL，37℃孵育2h后,弃去病毒液换含浓度为100mg/L的SSGAG维持液，每孔200μL,于含体积分数0.05CO2孵育箱中37℃分别培养12、24、48、72h后，换为不含药的DMEM维持液

8、，每日在倒置显微镜下观察CPE并记录结果。记录标准同上。同时设病毒对照组、正常细胞对照组，每组设6个复孔。72h后，当病毒对照组细胞病变达75%以上时，MTT法测吸光度值，并计算ER%。1.3