蛋白质的定量测定方法

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1、六、蛋白质含量定量法一、Folin-酚试剂法测定蛋白质含量【实验目的】1.学习Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的原理。2.掌握Folin-酚试剂法测定蛋白质含量的方法和操作。【实验原理】蛋白质中含有酪氨酸和色氨酸残基，能与Folin-酚试剂起氧化还原反应。反应过程分为两步，第一步：在碱性溶液中，蛋白质分子中的肽键与碱性铜试剂中的Cu2+作用生成蛋白质-Cu2+复合物；第二步：蛋白质-Cu2+复合物中所含的酪氨酸或色氨酸残基还原酚试剂中的磷钼酸和磷钨酸，生成蓝色的化合物。该呈色反应在30分钟内即接近极限，并

2、且在一定浓度范围内，蓝色的深浅度与蛋白质浓度呈线性关系，故可用比色的方法确定蛋白质的含量。进行测定时要根据蛋白质浓度的不同选用不同的测定波长：若蛋白质含量高时（25-100μg）在500nm波长处进行测定，含量低时(5-25μg)在755nm波长处进行测定。最后根据预先绘制的标准曲线求出未知样品中蛋白质的含量。Folin-酚试剂法操作简便，灵敏度高，样品中蛋白质含量高于5μg即可测得，是测定蛋白质含量应用得最广泛的方法之一。【实验材料】1.实验器材100毫升容量瓶  2只；移液管  1毫升4支，5毫升2支；

3、721型分光光度计。2.实验试剂(1) Fo1in-酚试剂甲：将lg碳酸钠溶于50ml 0.lmol／L氢氧化钠溶液中，再把0.5g硫酸铜(CuSO4·5H2O)溶于100m1 1％酒石酸钾(或酒石酸钠)溶液，然后将前者50ml与后者lml混合。混合后1日内使用有效。(2)Folin-酚试剂乙：在1.5L容积的磨口回流瓶中加入100g钨酸钠(Na2WO4·2H2O)、25g钼酸钠(Na2MoO4·2H2O)、700ml蒸馏水、50ml 85％磷酸及100ml浓盐酸，充分混匀后回流10h。回流完毕，再加150

4、g硫酸锂、50ml蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴，冷却后定容到1000ml。过滤，如显绿色，可加溴水数滴使氧化至溶液呈淡黄色。置于棕色瓶中暗处保存。使用前用标准氢氧化钠溶液滴定，酚酞为指示剂，以标定该试剂的酸度，一般为2mol／L左右(由于滤液为浅黄色，滴定时滤液需稀释100倍，以免影响滴定终点的观察)。使用时适当稀释(约1倍)，使最后浓度为lmol／L酸。(3)标准蛋白质溶液：用分析天平精密称取牛(或人)血清白蛋白100毫克，用少量蒸馏水完全溶解后，转移至100毫升容量瓶中，准

5、确稀释至刻度，使蛋白质浓度1mg/ml。(4)样品溶液：配制约0.5mg/ml的酪蛋白溶液作为未知样品溶液。【实验操作】1. 绘制标准曲线取7支试管，按下表分别加入各试剂试剂          管号0123456标准蛋白质溶液(ml)0.00.10.20.30.40.50.6蒸馏水(ml)1.00.90.80.70.60.50.4Fo1in-酚试剂甲(ml)5555555摇匀，室温下放置10分钟Fo1in-酚试剂乙(ml)  111 1111各管加入Fo1in-酚试剂乙后，立即摇匀，放置30分钟后比色，在5

6、00nm处记下各管光密度，以0号管为对照，以光密度为纵坐标，标准蛋白质溶液浓度为横坐标，绘制标准曲线。2.测定未知样品：取2支试管，分别准确吸取1毫升样品溶液，各加5毫升Fo1in-酚试剂甲，摇匀，室温放置10分钟后，再各加1毫升Fo1in-酚试剂乙，立即摇匀，放置30分钟，在500nm处测定光密度值。   【实验结果】根据未知样品溶液的光密度值，在绘制好的标准曲线图中查出样品溶液中的蛋白质含量。二、凯氏定氮法测定蛋白质含量【实验目的】学习凯氏定氮法的原理和操作技术。【实验原理】 凯氏定氮法用于测定有机物的

7、含氮量,若蛋白质的含氮量已知时，则可用此法测定样品中蛋白质的含量。 当蛋白质与浓硫酸共热时，其中的碳、氢两元素被氧化成二氧化碳和水，而氮则转变成氨，并进一步与硫酸作用生成硫酸铵。此过程通常称为“消化”。但是，这个反应进行得比较缓慢，通常需要加入硫酸钾或硫酸钠以提高反应液的沸点，并加入硫酸铜作为催化剂，以促进反应的进行。消化完成后，在凯氏定氮仪中加入浓碱，可使消化液中的硫酸铵分解，游离出氨，借助水蒸汽蒸馏法，将产生的氨蒸馏到一定量、一定浓度的硼酸溶液中，硼酸吸收氨后，氨与溶液中氢离子结合，使溶液中的氢离子浓度

8、降低，指示剂颜色改变，然后用标准无机盐酸滴定，直至恢复溶液中原来的氢离子浓度为止。根据所用标准盐酸的量可计算出待测物中的总氮量。蛋白质的含氮量为16%，即1克蛋白质中的氮相当于6.25克蛋白质，用凯氏定氮法测出的含氮量乘以6.25,即得样品中蛋白质的含量。【实验材料】1.实验器材微量凯氏定氮仪  1套；50ml凯氏烧瓶  4个；移液管；锥形瓶；试管；小玻璃珠2.试验试剂(1) 浓硫酸；30％氢氧化钠溶液；2％硼酸