长链非编码rna ptenp在肾透明细胞癌中的功能及分子机制研究.pdf

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分类号学校代码学号D20117843310487密级博士学位论文长链非编码RNAPTENP1在肾透明细胞癌中的功能及分子机制研究学位申请人：姚炜敏学科专业：外科学（泌尿外科）指导教师：叶章群教授答辩日期：2014年5月 AdissertationsubmittedtoHuazhongUniversityofScienceandTechnologyfortheDegreeofDoctorofMedicineStudyontheFunctionandtheMolecularMechanismofLncRNAPTENP1inRenalClearCellCarcinomaD.Candidate:YaoWeiminMajor:UrologySupervisor:Prof.YeZhangqunHuazhongUniversityofScience&TechnologyWuhan430074,P.R.ChinaMay,2014 独创性声明本人郑重声明，本学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果的总结。尽我所知，除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本人将承担本声明引起的一切法律后果。学位论文作者签名：日期：年月日学位论文版权使用授权书本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权华中科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存和汇编本学位论文。保密□，在_____年解密后适用本授权书。本论文属于不保密□。（请在以上方框内打“√”）学位论文作者签名：指导教师签名：日期：年月日日期：年月日 目录英文缩略词表........................................................................................................................1摘要......................................................................................................................................2ABSTRACT..........................................................................................................................3引言......................................................................................................................................4参考文献................................................................................................................................6第一部分长链非编码RNA在人肾透明细胞癌中的表达研究.......................................9摘要....................................................................................................................................9ABSTRACT.........................................................................................................................10前言..................................................................................................................................11材料与方法......................................................................................................................11结果..................................................................................................................................19讨论..................................................................................................................................30参考文献..........................................................................................................................33第二部分长链非编码RNAPTENP1在肾透明细胞癌中的表达调控及功能研究.....37摘要..................................................................................................................................37ABSTRACT.........................................................................................................................38前言..................................................................................................................................39材料与方法......................................................................................................................40结果..................................................................................................................................50讨论..................................................................................................................................57参考文献..........................................................................................................................59第三部分长链非编码RNAPTENP1在肾透明细胞癌中的分子机制研究.................61摘要..................................................................................................................................61ABSTRACT.........................................................................................................................62前言..................................................................................................................................63材料与方法......................................................................................................................63 结果..................................................................................................................................73讨论..................................................................................................................................83参考文献..........................................................................................................................86综述....................................................................................................................................89附录....................................................................................................................................99致谢..................................................................................................................................100 华中科技大学博士学位论文英文缩略词表RCCCLncRNANTRenalclearcellcarcinomaRNAlongnoncodingRNANontumoroustissues肾透明细胞癌长链非编码RNA非肿瘤组织qRT-PCRMSPQuantitativereversetranscriptasePCR实时定量逆转录PCRMethylationspecificPCR甲基化特异性PCRceRNAPTENCompetingendogenousRNAPhosphataseandtensinhomolog竞争性内源性RNA磷酸酶和张力蛋白同源基因3’UTRHIF1αHOX3’untranslatedregion3’非编码区HypoxiainduciblefactoralphaHumanhomeoboxtranscriptionfactorsVascularendothelialgrowthfactorMammaliantargetofrapamycin缺氧诱导因子1α人同源盒转录因子血管内皮生长因子哺乳动物雷帕霉素靶蛋白VEGFmTOR1 华中科技大学博士学位论文长链非编码RNAPTENP1在肾透明细胞癌中的功能及分子机制研究华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科姚炜敏导师叶章群教授摘要目的研究长链非编码RNAPTENP1在人肾透明细胞癌中表达及调控，并进一步探索其功能及分子机制。方法运用lncRNAs芯片技术及qTR-PCR方法初步分析lncRNAs在人肾透明细胞癌中表达谱。用qRT-PCR检测PTENP1在肾透明细胞癌中的表达情况。通过甲基化特异性PCR分析PTENP1基因甲基化状态。通过细胞增殖、迁移及侵袭实验和肿瘤异体移植实验探索PTENP1的功能。通过Westernblot检测PTENP1对PTEN表达的影响，利用荧光素酶报告系统验证miR-21对PTENP1及PTEN的靶向作用。利用过表达及共表达方法，探索mir-21及PTEN在肾透明细胞癌中的功能及miR-21及PTEN对PTENP1在肾透明细胞癌中功能的影响并分析相互作用关系。结果在肾透明细胞癌组织中可以检测到大量的lncRNAs，其中数百种lncRNAs在肾癌中均存在异常表达。PTENP1在肾透明细胞癌中低表达，其基因DNA存在甲基化。PTENP1和PTEN能够抑制肾透明细胞癌增殖、迁徙及肿瘤转移。PTENP1及PTEN的表达正相关，PTENP1能够增加PTEN的表达。在肾透明细胞癌中miR-21能够靶向作用PTENP1及PTEN。MiR-21在肾透明细胞癌中具有促癌功能。在肾透明细胞癌细胞系ACHN和SN12-PM6中mir-21能够抑制PTENP1的抑癌功能。结论PTENP1在人肾透明细胞癌中低表达并与基因甲基化有关。肾透明细胞癌中PTENP1是抑癌基因，作为竞争性内源RNA（competingendogenousRNA）通过竞争miR-21影响抑癌基因PTEN的表达可能是其发挥抑癌功能的分子机制。【关键词】肾透明细胞癌；长链非编码RNA；PTENP1；抑癌基因；竞争性内源RNA2 华中科技大学博士学位论文StudyontheFunctionandtheMolecularMechanismofLncRNAPTENP1inRenalClearCellCarcinomaAbstractObjectiveTostudytheexpression,regulation,functionandmolecularmechanismoflongnoncodingRNA(lncRNA)PTENP1inhumanrenalclearcellcarcinoma(RCCC).MethodsStudytheexpressionsignaturesoflncRNAsinhumanrenalclearcellcarcinomabymicroarrayandqRT-PCR.ExpressionofPTENP1wasexaminedbyqRT-PCRandMSPwasperformedtoanalysisthemethylationstate.TheexpressioncorrelationofPTENP1andPTENwasexaminedbyqRT-PCR.LuciferasereporterassaywasperformedtoconfirmthetargetingofmiR-21toPTENP1andPTEN.ThebiologicalfunctionassaysofPTENP1,miR-21andPTENincellproliferation,migrationandinvasionandtumourgrowthandmetastasiswereperformedinvitroandvivo.TheeffectofPTNEandmiR-21onthefunctionofPTENP1inRCCCwasperformed.ResultsThousandsoflncRNAsweredetectedinRCCCandhundredsofthemweredifferentiallyexpressedinallRCCCsamples.PTENP1wasdownregulatedinRCCCandaberrantmethylationwasdetectedinPTENP1promoter.PTENP1andPTENsuppressesproliferation,migrationandinvasionofRCCC.ThiswasadirectcorrelationbetweenPTENP1andPTENexpressions.OverexpressionofPTENP1couldimprovetheexpressionofPTEN.Mir-21wasupregulatedinRCCCandtargetingbothPTENP1andPTEN.Mir-21presentedtumourpromotingfunctioninRCCC.Mir-21couldsuppressthetumoursuppressorfunctionofPTENP1inRCCCinvitroandinvivo.ConclusionLncRNAPTENP1whichwasdownregulatedbyDNAmethylationfunctionsasPTENcompetingendogenousRNA(ceRNA)withthedependencyofmiR-21tosuppressRCCCprogression.【Keywords】Renalclearcellcarcinoma,LongnoncodingRNA,PTENP1,Tumoursuppressor,CompetingendogenousRNA3 华中科技大学博士学位论文引言在现代社会生活方式及环境的改变、人均寿命延长的背景下，癌症的发病率日渐增高[1]。在发达国家癌症已经成为第一位的死因，在发展中国家中也上升为仅次于慢性病的人群死亡原因，造成严重的社会负担[2]。肾细胞癌是起源于肾实质泌尿小管上皮系统的恶性肿瘤，简称肾癌[3]。肾癌是泌尿系统最常见的肿瘤之一，可占高达3%的成人恶性肿瘤。在肾癌中又以肾透明细胞癌最为常见，占肾癌的75%以上[3]。在2008年全球有265731新发肾癌病例并有113315人死于肾癌，我国肾癌发病率在各地区差异较大，且发病率呈逐年上升趋势，肾癌已经成为严重危害人群健康的重要疾病[2,4-7]另一方面，随着手术技术及辅助治疗的不断进展，早期肾癌已经能达到较好的治疗效果，但是对于为数不少的进展期肾癌，特别是有转移的肾癌，尽管近年来出现了靶向。治疗等新型药物，仍缺乏令人满意的治疗方法，这些病人往往预后不良[3,8-11]。故深入研究肾癌发生发展的相关分子机制，寻找新的诊断和治疗靶点具有重要的现实意义。大量的基础研究表明，肾癌的发生和发展可能涉及许多的基因突变或异常调控，如VHL,PBRM1，MET,FLCN,TSC1,TSC2,TFE3,TFEB,MITF,FH,SDHB,SDHD及PTEN等[12,13]。其中VHL突变、PI3-K/Akt/mTOR通路异常及局部微环境的改变导致的缺氧诱导因子（HIF）α异常堆积，从而引起一系列生长因子的异常表达在肾透明细胞癌的发生发展中处于重要地位，并针对开发了一系列靶向治疗靶点和药物[11,14,15]。相应的靶向治疗已经取得一定的成效，但是随着现有靶向治疗深入运用局限的发现及肾癌基础研究的进一步发展，学术界已经达到一个基本共识，即在肾癌的发生和发展中仍存在许多额外的重要分子事件[14,16]诊断和治疗有重要的意义。。进一步探索这些分子事件对推进肾癌的非编码RNA在正常生物过程及疾病发生发展中的重要调控功能，是近十余年生命科学研究最重要的进展之一[17]。长链非编码RNA（longnoncodingRNA,lncRNA）是一类由RNA聚合酶II转录的，长度大于200nt的RNA分子，具有mRNA相似的结构，可有不同的剪接，可形成polyA尾巴及启动子结构[18]。哺乳动物的基因组序列。研究人员很早就发现产生的lncRNA转录本数量是蛋白编码RNA的上十倍[18]4 华中科技大学博士学位论文lncRNA的存在，但是多年来lncRNA被认为是不具有生物学功能的RNA聚合酶II转录的副产物。然而，近年来的研究表明，大多数的lncRNA在组织分化发育过程中，都具有明显的时空表达特异性，lncRNA通过多种机制参与了基因组印记以及染色质修饰，转录激活及干扰，分子运输等多种重要分子过程的调控[19-21]。研究表明lncRNA通过多种方式，在多种疾病的异常分子调控中发挥重要作用，特别是在癌症的发生发展中的作用远远超过人们的预期[22,23]。多种lncRNA在多种癌症的分子机制中的作用已经得到证实，如H19与肝癌及乳腺癌有关，MALAT-与非小细胞肺癌及肝癌有关，DD3/PCA3、PCGEM1与前列腺癌有关等[24-27]。lncRNA在癌症中的作用及其机制已经成为癌症研究的一个重要方面，为人类进一步认识癌症的分子机制及寻找新的关键诊断和治疗靶点开启了新的天地[28]。故本实验组通过基因表达芯片及RT-PCR深入研究了肾透明细胞癌中lncRNA的表达谱。探索相对于癌旁组织，肾透明细胞癌中呈现的异常表达的lncRNA，初步分析lncRNA在肾透明细胞癌的发生发展中可能扮演的角色。PTENP1是经典抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源基因（Phosphataseandtensinhomolog，PTEN）的假基因（pseudogene）。研究证明PTEN基因编码一种磷酸酶，能够通过负向调节PI3-K/Akt/mTOR信号通路而发挥抑癌作用[29]。转录于9p13.3的长链非编码RNAPTENP1作为PTEN的假基因与PTEN有高度同源性，在PTENP1的3’的非编码区（3’-UTR）存在与PTEN3’-UTR高度同源(～95%)的区域[30]。有权威研究表明在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等细胞系中靶向PTENP1的MicroRNA如miR-17,miR-21,miR-214,miR-19和miR-26等也可以靶向PTEN，能够通过竞争靶向PTEN的MicroRNA而调节PTEN的表达水平从而在癌症的发生发展中发挥作用[30]有研究发现在多种癌细胞系中PTEN的CpG岛没有存在甲基化而PTENP1的CpG岛。则存在甲基化，我们的前期工作也发现在肾透明细胞癌中PTENP1低表达[31]。故我们认为PTENP1在肾透明细胞癌中的作用很可能极为重要作用。深入研究PTENP1在肾透明细胞癌中的作用及其分子机制不仅有利于我们更加深入地了解肾癌的发生发展过程中的分子事件而且有利于在目前的条件下寻找新的治疗靶点以及进一步丰富肾癌相关分子生物学理论。5 华中科技大学博士学位论文参考文献：[1]JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics[J].CACancerJClin,2011,61(2):69-90.[2]FerlayJ,ShinHR,BrayF,etal.Estimatesofworldwideburdenofcancerin2008:GLOBOCAN2008[J].IntJCancer,2010,127(12):2893-2917.[3]MotzerRJ,JonaschE,AgarwalN,etal.Kidneycancer,version2.2014[J].JNatlComprCancNetw,2014,12(2):175-182.[4]陈万青,郑荣寿,张思维,等.2003～2007年中国癌症发病分析[J].中国肿瘤,2012(03):161-170.[5]郑荣寿,张思维,吴良有,等.中国肿瘤登记地区2008年恶性肿瘤发病和死亡分析[J].中国肿瘤,2012(01):1-12.[6]张思维,雷正龙,李光琳,等.中国肿瘤登记地区2006年肿瘤发病和死亡资料分析[J].中国肿瘤,2010(06):356-365.[7]张思维,陈万青,孔灵芝,等.中国部分市县1998～2002年恶性肿瘤的发病与死亡[J].中国肿瘤,2006(07):430-448.[8]KenneyPA,WoodCG.Integrationofsurgeryandsystemictherapyforrenalcellcarcinoma[J].UrolClinNorthAm,2012,39(2):211-231.[9]VeeratterapillayR,SimrenR,El-SherifA,etal.Accuracyoftherevised2010TNMclassificationinpredictingtheprognosisofpatientstreatedforrenalcellcancerinthenortheastofEngland[J].JClinPathol,2012,65(4):367-371.[10]PoprachA,BortlicekZ,BuchlerT,etal.PatientswithadvancedandmetastaticrenalcellcarcinomatreatedwithtargetedtherapyintheCzechRepublic:twentycancercentres,sixagents,onedatabase[J].MedOncol,2012,29(5):3314-3320.[11]vanderVeldtAA,HaanenJB,vandenEertweghAJ,etal.Targetedtherapyforrenalcellcancer:currentperspectives[J].DiscovMed,2010,10(54):394-405.[12]LinehanWM.Geneticbasisofkidneycancer:roleofgenomicsforthedevelopmentofdisease-basedtherapeutics[J].GenomeRes,2012,22(11):2089-2100.[13]Comprehensivemolecularcharacterizationofclearcellrenalcellcarcinoma[J].Nature,2013,499(7456):43-49.6 华中科技大学博士学位论文[14]FavoritoLA.Basicresearchinprostatecancer,kidneycancer,urinaryincontinence,pediatricurologyanderectiledysfunction[J].IntBrazJUrol,2013,39(2):152-154.[15]DutcherJP.Recentdevelopmentsinthetreatmentofrenalcellcarcinoma[J].TherAdvUrol,2013,5(6):338-353.[16]LinehanWM.Thegeneticbasisofkidneycancer:implicationsformanagementanduseoftargetedtherapeuticapproaches[J].EurUrol,2012,61(5):896-898.[17]AkhtarA,FuchsE,MitchisonT,etal.Adecadeofmolecularcellbiology:achievementsandchallenges[J].NatRevMolCellBiol,2011,12(10):669-674.[18]PontingCP,OliverPL,ReikW.EvolutionandfunctionsoflongnoncodingRNAs[J].Cell,2009,136(4):629-641.[19]MercerTR,DingerME,MattickJS.Longnon-codingRNAs:insightsintofunctions[J].NatRevGenet,2009,10(3):155-159.[20]WangKC,ChangHY.MolecularmechanismsoflongnoncodingRNAs[J].MolCell,2011,43(6):904-914.[21]GuttmanM,RinnJL.Modularregulatoryprinciplesoflargenon-codingRNAs[J].Nature,2012,482(7385):339-346.[22]WapinskiO,ChangHY.LongnoncodingRNAsandhumandisease[J].TrendsCellBiol,2011,21(6):354-361.[23]SultmannH,DiederichsS.LongNoncodingRNA:"LNCs"toCancer[J].EurUrol,2014.[24]LooijengaLH,VerkerkAJ,DeGrootN,etal.H19innormaldevelopmentandneoplasia[J].MolReprodDev,1997,46(3):419-439.[25]JiP,DiederichsS,WangW,etal.MALAT-1,anovelnoncodingRNA,andthymosinbeta4predictmetastasisandsurvivalinearly-stagenon-smallcelllungcancer[J].Oncogene,2003,22(39):8031-8041.[26]LinR,MaedaS,LiuC,etal.AlargenoncodingRNAisamarkerformurinehepatocellularcarcinomasandaspectrumofhumancarcinomas[J].Oncogene,2007,26(6):851-858.[27]DingM,CaoX,XuHN,etal.Prostatecancer-specificandpotentantitumoreffectofa7 华中科技大学博士学位论文DD3-controlledoncolyticvirusharboringthePTENgene[J].PLoSOne,2012,7(4):e35153.[28]GibbEA,BrownCJ,LamWL.Thefunctionalroleoflongnon-codingRNAinhumancarcinomas[J].MolCancer,2011,10:38.[29]SongMS,SalmenaL,PandolfiPP.ThefunctionsandregulationofthePTENtumoursuppressor[J].NatRevMolCellBiol,2012,13(5):283-296.[30]PolisenoL,SalmenaL,ZhangJ,etal.Acoding-independentfunctionofgeneandpseudogenemRNAsregulatestumourbiology[J].Nature,2010,465(7301):1033-1038.[31]HessonLB,PackhamD,PontzerE,etal.AreinvestigationofsomatichypermethylationatthePTENCpGislandincancercelllines[J].BiolProcedOnline,2012,14(1):5.8 华中科技大学博士学位论文第一部分长链非编码RNA在人肾透明细胞癌中的表达研究摘要目的观察分析长链非编码RNA(lncRNAs)在人肾透明细胞癌中表达谱，为进一步研究长链非编码RNA在肾透明细胞癌发生发展中的作用及其分子机制提供研究思路及研究基础。方法运用lncRNAs表达谱芯片检测六对肾透明细胞癌及其癌旁正常组织中lncRNAs的表达谱，对原始数据进行标准化处理筛选在肾透明细胞癌中差异性表达的lncRNAs，并作初步分析。通过qTR-PCR检测在原发肿瘤及癌旁组织验证芯片数据的结果以及检测差异性表达在肾癌人群中普遍存在的规律。在特定的规则下建立lncRNAs基因及编码基因共表达网络初步分析lncRNAs的可能作用靶点。结果在六对癌与癌旁组织中共有高达17157条lncRNAs可被检测到。在六对组织中，相对相应的癌旁组织，平均可检测到3837条出现两倍及以上差异表达的lncRNAs。在五对及以上的组织中共有916条lncRNAs出现两倍以上的差异表达，其中401条上调，515条下调。qTR-PCR结果与芯片结果有良好的一致性。在构建的lncRNAs基因及编码基因共表达网络中有数百条lncRNAs及数百条mRNA存在共表达关系。结论相对正常组织，在人透明细胞癌中存在广泛差异表达的lncRNAs，这些异常调控的lncRNAs中，可能存在一些参与肾透明细胞癌发生、发展关键分子事件的具有抑癌或促癌作用lncRNAs。【关键词】肾透明细胞癌；长链非编码RNA；表达谱芯片9 华中科技大学博士学位论文PartILongnoncodingRNAsexpressionsignaturesofhumanrenalclearcellcarcinomaAbstractObjectiveToanalyzethegenome-wideexpressionpatternsoflongnoncodingRNAs(lncRNAs)inhumanrenalclearcellcarcinoma(RCCC).MethodsExpressionprofilesoflncRNAsin6pairsofhumanrenalclearcellcarcinoma(RCCC)andthecorrespondingadjacentnontumoroustissues(NT)weredetectedbymicroarray.ThedifferentialexpressionlncRNAswerescreenedoutafterthehomogenizationofthelawdataandthepreliminarilyanalysiswasproposed.ValidationofthemicroarraydatabyquantitativereversetranscriptasePCR(qRT-PCR)inprimarytumourandadjacentnormaltissues.Constructionofthecoding-non-codinggeneco-expressionnetworkwaspreformedtopresentthesignatureoftheexpressionrelationshipbetweenlncRNAandmRNA.ResultsThenumberoflncRNAsthatexpressedatacertainlevelcouldbedetectedis17157.TherewerethousandsoflncRNAsthatdifferentiallyexpressed(≥2fold-change)inRCCCtissuescomparedwithNTand916lncRNAsdifferentiallyexpressedinfiveormoreofsixRCCCsampleswith401upregulatedand515downregulated.ItsupportedastrongconsistencybetweentheqRT-PCRresultandmicroarraydata.Amongthisco-expressionnetworkhundredsoflncRNAandmRNAwerecorrelatedwitheachother.ConclusionClustersoflncRNAswereaberrantlyexpressedinRCCCcomparedwithNTsamples,whichrevealedthatlncRNAsdifferentiallyexpressedintumortissuesandnormaltissuesmayexertapartialorkeyroleintumordevelopmentandprogression.【Keywords】Renalclearcellcarcinoma,LongnoncodingRNA,LncRNAmicroarray10 华中科技大学博士学位论文前言在世界范围内，泌尿系统肿瘤中肾癌的发病率仅次于前列腺癌及膀胱癌；而在我国则仅次于膀胱癌，是泌尿系统最常见的肿瘤之一，约占成人恶性肿瘤的2%-3%，其发病率呈逐年上升的趋势[1,2]。肾癌中最常见的病理组织类型是肾透明细胞癌，约占全部肾癌的60%-85%[3]。肾癌主要通过手术治疗，对化疗及放疗均不敏感，其疾病特异性死亡率高于前列腺癌及膀胱癌[3]。近年来出现的肾癌靶向治疗为肾癌的治疗带来了一丝希望，但随着治疗的深入运用，其效果仍不能令人满意[4,5]。现有研究表明肾癌的发生、发展中仍有许多分子事件有待阐述[6]。故深入探索肾癌发生、发展的分子事件，为肾癌的治疗提供新思路及新途径具有重要的意义。生物体基因组可以编码大量不翻译蛋白质的，长度大于200nt的长链非编码RNA(lncRNA)[7]。此前研究已经证实，lncRNA在生物体的正常及异常的生命过程中均具有重要的作用[8]。在人类各种疾病中，特别是癌症的作用已得到证实[9]。我们研究了lncRNA在肾透明细胞癌肿的表达调控情况，为进一步探索lncRNA在肾癌中的作用提供研究基础及其研究思路。材料与方法1、组织样本六对肾透明细胞癌及其相应癌旁组织均来取自2011年5月至11月于华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科进行手术治疗的肾癌患者，经术后病理证实为肾透明细胞癌。组织的收取均得到同意并严格规范按进行。2、主要实验试剂DEPC(美国Sigma公司)TRIzol(美国Invitrogen公司)RNaseyMiniKit(美国Qiagen公司)Baseline-ZERODNase(美国EPICENTRE公司)QuickAmpLabelingKit,One-Color(美国Agilent公司)AgilentGeneExpressionHybridizationKit(美国Agilent公司)11 华中科技大学博士学位论文GeneExpressionWashBuffer1(美国Agilent公司)GeneExpressionWashBuffer2(美国Agilent公司)FermentasRTreagentKit(美国Fermentas公司)SYBRPremixExTaq(日本Takara公司)3、实验器材超净工作台（美国Thermo公司）台式低温离心机（美国BD公司）恒温水浴箱（南京先欧公司）低温冰箱（青岛Haier公司）NanoDropND-1000(美国NanoDrop公司)Magneticstirbar(美国Corning公司)Magneticstirplate(美国Corning公司)Slide-stainingdish,withsliderack(美国Thermo公司)AgilentMicroarrayScanner(美国Agilent公司)HybridizationChamber,stainless(美国Agilent公司)HybridizationChambergasketslides(美国Agilent公司)Hybridizationoven(美国Agilent公司)HybridizationovenrotatorforAgilentMicroarrayHybridizationChambers(美国Agilent公司)MX3000P定量PCR仪（美国Thermo公司）VeritiPCR仪（美国Thermo公司）4、lncRNA芯片ArraystarHumanLncRNAMicroarrayv2.0(8x60K,Arraystar)：Arraystar公司的lncRNA芯片能够检测高达33045条来自NCBIRefseq、UCSCKnownGene、NRED、RNAdb等权威数据库的lncRNA，几乎覆盖了现发现的所有lncRNA。同时芯片能检12 华中科技大学博士学位论文测高达30215条mRNA。芯片针对每一个基因转录本的特异性序列设计了～60met的长寡核苷酸探针，这些特别设计的探针在严格杂交条件下可有极高的灵敏度及特异性。针对每条序列都设计了多条探针，增加检测的可靠度，同时设有阳性对照和阴性对照探针，保证理想的实验结果。芯片由上海上海康成生物工程有限公司提供并协助进行检测及数据分析。5、主要实验方法5.1组织样本的收集组织在离体20分钟内收集。在有经验临床医师指导下辨认肿瘤组织，切下肿瘤组织及癌旁正常组织后迅速用PBS溶液冲洗，将样本剪切成约0.4*0.4*1.0cm的块状装入预先标记好的冻存管中并迅速置入液氮罐中。同时均留取部分组织中性福尔马林固定送病理分析。收集的组织样本置于-80℃低温冰箱保存，并采集完整的临床和随访资料。5.2组织总RNA的提取（1）取约50mg冰冻组织置入预处理的研钵中，加入液氮，在存在液氮下迅速研磨组织至粉末状加入1mlTrizol试剂对组织进行裂解；（2）将上述组织Trizol裂解液转入无RNasefreeEP管中，室温下裂解5分钟；（3）在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，手动用力震荡15秒，室温下放置3分钟，12000g，4℃，离心15分钟；（4）小心转移上层水相至新RNasefreeEP管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温下放置10分钟，12000g，4℃，离心10分钟；（5）弃上清，加入1ml75%乙醇轻轻洗涤沉淀，7500g，4℃，离心5分钟，弃上清；（6）室温放置约10分钟挥发多余乙醇，避免完全干燥，加入80ulRNasefree水溶解RNA；（7）55°C水浴锅中变性10分钟，-80℃保存。13 华中科技大学博士学位论文5.3RNA的纯化及质量检测（1）根据RNaseyMiniKit(Qiagen公司)操作流程，按下述体系加入自带小离心管中：RNA≤85ul10ul5ul10×ReactionbufferBaseline-ZERODNaseRNasefree水Xul总体积100ul（2）37℃孵育30分钟，加入350μlBufferRLT，充分混匀；（3）加入250μl无水乙醇，用移液器充分混匀，马上转移700μl样品至RNeasyMinispin离心柱中并套入2ml收集管中，≥8000g离心15秒，丢去废液；（4）加入500μlBufferRPE至离心柱中，≥8000g离心15秒，丢去废液；（5）加入500μlBufferRPE至离心柱中，≥8000g离心2分钟；（6）把离心柱套入新的2ml收集管中，最高速离心1分钟；（7）把离心柱套入新的1.5ml收集管中，直接加入适量RNasefree水至离心柱的滤膜中，≥8000g离心1分钟，收集RNA；（8）用NanoDropND-1000检测RNA在260、280及230nm处的吸光度，并分析A260/A280的比值，同时检测RNA的浓度；（9）使用常规甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。5.4RNA标记前反应（cRNA制备）（1）按QuickAmpLabelingKit,One-Color(美国Agilent公司)操作流程，加入1μl总RNA至1.5ml离心管中；（2）加入1.2μlT7启动子引物，加入nuclease-free水至11.51μl；（3）恒温水槽中65℃孵育10分钟；冰上孵育5分钟；（4）按下述体系（每个反应量）预先制好cDNAMasterMix置冰上备用：14 华中科技大学博士学位论文5×FirstStrandBuffer0.1MDTT4μl2μl10mMdNTPmixMMLV-RT1μl1μlRNaseOut0.5μl8.5μl总体积（5）加入8.5μLofcDNAMasterMix至每个样品1.5ml离心管中，轻轻上下颠倒混匀；（6）恒温水槽中40℃孵育2小时，转至65℃恒温水槽中孵育15分钟；（7）转至冰上孵育5分钟，迅时离心；（8）按下述体系（每个反应量）预先制好TranscriptionMasterMix备用：Nuclease-freewater4XTranscriptionBuffer0.1MDTT15.3μL20μL6μLNTPmix8μL50%PEG6.4μL0.5μL0.6μL0.8μL2.4μL60μLRNaseOUTInorganicpyrophosphataseT7RNAPolymeraseCyanine-3-CTP总体积（9）加入60μLTranscriptionMasterMix至每个样品1.5ml离心管中，移液器轻轻混匀；（10）恒温水槽中40℃孵育2小时。15 华中科技大学博士学位论文5.5标记扩增RNA的纯化及标记cRNA质量检测（1）根据RNaseyMiniKit(Qiagen公司)操作流程，加入20μlnuclease-free至每个cRNA样品中，总体积为100μl；（2）加入350μlBufferRLT，用移液器充分混匀；（3）加入250μl无水乙醇，用移液器充分混匀，转移700μl样品至RNeasyMini离心柱中并套入2ml收集管中，13000pm，4℃，离心30秒，丢去收集管；（4）加入500μlBufferRPE至离心柱中，套入新的2ml收集管中，13000pm，4℃，离心30秒，丢去收集管废液；（5）加入500μlBufferRPE至离心柱中，13000pm，4℃，离心60秒，丢去收集管；（6）把离心柱套入新的1.5ml收集管中，直接加入适量RNasefree水至离心柱的滤膜中，13000pm，4℃，离心30秒，收集cRNA，冰上暂时保存；（7）用NanoDropND-1000检测cRNA在A260nm(DNA),A550nm(cyanine3)处的吸光度，计算其标记效率。5.6芯片杂交、清洗及数据采集和分析根据AgilentGeneExpressionHybridizationKit(美国Agilent公司)试剂盒操作规程进行杂交。用GeneExpressionWashBuffer(美国Agilent公司)冲洗缓冲液1及2按操作规程进行冲洗。用AgilentMicroarrayScanner(美国Agilent公司)进行扫描及图像采集。用分析软件AgilentFeatureExtraction(美国Agilent公司)进行数据提取及初步加工。运用Excel、Cytoscape软件进行后续分析。5.7RNA逆转录反应根据FermentasRTreagentKit试剂盒操作规程进行。加样在冰上进行，逆转录反应设置为引物延伸25℃，10分钟；cNDA合成40℃，30分钟；终止反应85℃，5分钟；降至4℃保存。反应体系如下：16 华中科技大学博士学位论文TemplateRNA10mMdNTPmixOligo(dT)primerRNase-freewater总体积xµl(upto1µg)1µl1µlxµl10μl5.8Q-PCR检测反应TRIzol试剂提取组织总RNA进行质量检测后进逆转录反应。逆转录反应按照FermentasRTreagentKit试剂盒操作规程进行。逆转录完成后再MX3000P上使用SYBRPremixExTaq试剂进行qPCR反应。qPCR反应设置为预变性95℃，10分钟；PCR反应为95℃5秒，63℃30秒，72℃30秒进行40个循环，最后72℃作用5分钟，设备自动进行溶解曲线分析。PCR反应以GAPDH作为内参。PCR反应引物及反应体系如下：名称GAPDH上游引物下游引物tgggtgtgaaccatgagaagctcaggcaagaaataaccaagccacctgtttatcggagttgacacagccaacttcttcaaaccactcactcgctgaaaaggacactgctatgtgactgttgaccctttccgcctgctgacttccttacttcatctttcccctgtcatctgttgtgctgttattgtggttgtgagcctccacaaaacttcactgtgtgtcgctgttgaagtcagaagcacacaaagggaacaagaagcgttctgtgctttctgttctcatagccagtgtcatcagggtgtgtggggagatagcacactgagggctcctggctgtttagttttcagtgccaaccttccaaagtcacactttctggtttgcttctgccttctcatactttgccattcacccttgattccaccaatagtcAK123483.1ENST00000456816X91348.1uc002the.2ENST00000460407uc003lbm.4BC029135.1ENST00000423200.1NR_00279817 华中科技大学博士学位论文SYBRPremixExTaq(2x)ForwardPrimer(10mM)ReversePrimer(10mM)cDNA12.5μl1μl1μl2μlDouble-distilledwater总体积8.5μl25μl5.9LncRNA基因及编码基因共表达网络的构建（1）数据预处理：编码基因部分相同基因的不同转录本水平取中位数值代表基因的表达值。lncRNA基因表达值部分不用特别处理。（2）数据筛选：按照差异表达的lncRNA列表和mRNA列表，取出数据子集。（3）计算Pearson相关系数：利用R计算lncRNA表达水平与编码基因表达水平之间的Pearson相关系数。（4）对Pearson相关系数进行筛选：挑选PCC>=0.99的部分作为有相互关系的非编码基因及编码基因对。（5）利用cytoscape工具绘图：粉红色节点代表上调lncRNA，蓝色节点代表下调lncRNA；红色节点代表上调mRNA，绿色节点代表下调mRNA。圆形节点表示mRNA，平行四边形节点表示lncRNA。实线代表连接的两个node间为正相关，虚线表示负相关。6、统计学方法数据使用SPSSl6.0软件包进行统计分析。实验进行三次的重复。两组间比较根据数据类型使用t检验或卡方检验，相关分析使用Pearson相关性检验。p<0.05被视为有统计学意义。18 华中科技大学博士学位论文结果1、lncRNA在肾透明细胞癌及癌旁组织中的表达根据实验条件及数据分析要求，最终有六对肾透明细胞癌及其相应癌旁组织完成芯片杂交及数据分析，样本临床资料见表1，所有芯片荧光信号质量良好(图1)。在六对癌与癌旁组织中共有高达17157条lncRNAs可被检测到（图2）。从lncRNA表达水平标准化后数据所制的箱型图可以发现肾透明细胞癌及相应癌旁组织lncRNA表达的总体分布较为稳定，其中位数在8左右浮动，这不仅反映芯片检测可靠，也反映了lncRNA在表达中的特点，则表达无差异或差异不明显的部分占最大的比例，这也从侧面反映了可能存在在肾透明细胞癌的发生、发展中起关键作用的lncRNA（图3）。六对组织中lncRNA表达水平的散点图同样反映了这一点（图4）。出现两倍及以上差异表达lncRNA中，有四对组织在癌组织中低表达的数量较高表达的为多，在另外两对则反之。同时从lncRNA表达水平的散点图可以发现表达差异最明显的lncRNA集中在中等表达水平的部分，这与现有的其他有关lncRNA的表达研究相符。通过具体的数据分析统计，在六对组织中，相对相应的癌旁组织，出现两倍及以上具有统计学意义差异表达lncRNA的数量为2262–5532条，平均为3837条，在不同组织对中异常表达lncRNA的数量有较大的差异，反映lncRNA的表达有较大的个体差异，虽然其总体分布是类似的（图3-5）。同时我们对在六对组织中差异表达的lncRNA的差异水平作了具体分层，其具体数量的分布可见表2。当然最值得关注的是在多对组织中均出现下调或上调的lncRNAs，这可以作为初步筛选的条件，在五对及以上的组织中共有916条lncRNAs出现两倍以上的差异表达，其中401条上调，515条下调，在六对组织中均出现，相对相应的癌旁组织下调及上调最为显著的lncRNAs的列表见表3。表3中可以看出ENST00000429695(Log2FoldchangeT/N=-4.175355)是下调最显著的lncRNAs，而ENST00000456816(Log2FoldchangeT/N=6.312544)是上调最显著的lncRNAs。这些初步筛选的的lncRNAs为进一步的研究打下基础。19 华中科技大学博士学位论文患者编号样本编号103N103T104N104T109N109T110N110T119N119T120N120T年龄采样手术方式后腹腔镜开放手术开放手术开放手术后腹腔镜开放手术病理类型病理分期N性别男（岁）时间2011正常肾皮质10310410911011912058年肾透明细胞癌T1bN0M02011正常肾皮质N男41年肾透明细胞癌T1bN0M02011正常肾皮质N男61年肾透明细胞癌T1bN0M02011正常肾皮质N男61年肾透明细胞癌T1bN0M02011正常肾皮质N男42年肾透明细胞癌T1bN0M02011正常肾皮质N男57年肾透明细胞癌T1bN0M0表1LncRNA芯片检测样本基本临床资料。20 华中科技大学博士学位论文图1LncRNA芯片杂交清洗后扫描图像。图像质量良好，整体未见显著差异。图2芯片结果的层次聚类分析图。图中每一竖行代表一种lncRNA，图像颜色反映相对表达水平，图中右侧颜色指示从上到下表达水平逐渐降低。21 华中科技大学博士学位论文图3各芯片数据的箱型图。箱型图能放映芯片数据的总体分布，图中每个矩形盒的两端边的位置分别对应数据批中表达水平处于上下四分位数的lncRNA的表达强度，矩形盒内部直线代表表达水平处于中位数的lncRNA的表达强度，从图中可初步看出各组数据的分布是类似的，这放映了样本及芯片检测过程质量良好。22 华中科技大学博士学位论文图4各对组织中lncRNA表达水平的散点图。每个散点图中的每个点对应一种lncRNA，对应的纵坐标值为在癌组织中的标准化表达水平，对应横坐标值为在癌旁组织中的标准化表达水平，在上斜线以上的点代表在癌组织中具有2Log2Foldchange以上高表达的lncRNA，而下斜线以下的点代表在癌组织中具有2Log2Foldchange以上低表达的lncRNA。23 华中科技大学博士学位论文样品编号103T改变2-4倍4-6倍>6倍小计总计上调下调1979240024258913411623553105546030562190327146593854104T109T110T119T120T上调下调上调下调上调下调上调下调上调下调13111297751172115110677487155714999135211631426115816072482119621074712771683158819032756147923751752151762332071478221512041176121表2样本中，各癌组织中相对相应癌旁组织异常表达lncRNA的分布情况。图5样本中各癌组织相对对应癌旁组织异常表达lncRNA数目的统计图。24 华中科技大学博士学位论文癌组织中下调Log2Fold癌组织中上调Log2FoldlncRNAschange(T/N)ENST000004568166.312544lncRNAschange(T/N)-4.175355-4.164936-4.138873-4.017295-3.924731-3.684683-3.664962-3.552973-3.482764-3.440134-3.252417-3.241383-3.208385-3.187289-3.021129-3.004994-2.826513-2.791417-2.756638-2.722405ENST00000429695NR_024418X913485.6601484.520894uc004coq.3uc009yby.1NR_024371ENST000005140344.37416ENST000004506873.567205ENST000004124273.750126ENST00000452496ENST00000435496ENST00000423174ENST00000418694ENST00000439462BC029135uc002the.2NR_001458NR_0268163.7112113.6509283.582491ENST000004604073.31089ENST000004390422.990333ENST00000460134ENST00000421118BC031314NR_0274842.903099ENST000004581752.885053ENST000004202872.871806ENST000003767922.859402ENST00000501056NR_024158ENST00000503579uc002dhi.1BX647686NR_024373BC012900NR_0154212.8417562.8395262.8319412.830491ENST00000421424ENST00000421314NR_023920ENST000004455352.827482表3在六对组织中均出现，相对相应的癌旁组织下调及上调最为显著的lncRNAs。Falsediscoveryrate(FDR)<0.1%，p<0.01。25 华中科技大学博士学位论文2、芯片的实时定量PCR验证为了实际验证芯片检测数据的可靠性及其差异性表达在肾癌及其癌旁正常组织中的普遍性存在，我们对四条lncRNAs(ENST00000456816，X91348，BC029135及NR_024418)的在芯片所检测样品及额外的57对癌与癌旁正常组织中的表达水平进行了qPCR检测。检测结果显示相对于癌旁正常组织ENST00000456816与X91348在癌组织中明显上调，BC029135及NR_024418则在癌组织中明显下调（P均小于0.001），结果与芯片结果有良好的一致性，同时提示芯片检测结果较为可信以及差异性表达的普遍性存在（图6）。在更大量的样本验证数据提示，在同样类型的不同组织样品中上述lncRNAs的表达存在一定的变异性，但是在癌与癌旁组织仍有明显的具有统计学意义的差异（图7）。同时我们也在部分组织中初步验证了部分已报道的在其他癌症中异常表的lncRNAs在肾透明细胞的表达情况（表4）。初步分析提示在其他肿瘤异常表达的lncRNAs可能为lncRNAs在肾透明细胞癌中的研究提供线索。图6用RT-qPCR在六对组织中检测lncRNAENST00000456816，X91348，BC029135及NR_024418在癌组织中相对癌旁组织表达情况与芯片结果的比较。从图中可以看出虽然两者该的程度不一致，但上调及下调的趋势是一致的，因为检测方法的差异，这也足以说明两者结果相符，芯片检测较为可靠。26 华中科技大学博士学位论文图7LncRNAENST00000456816，X91348，BC029135及NR_024418在63对组织中的表达情况。图中可以看出lncRNA在同类组织中的表达具有一定的的变异性，但是在癌与癌旁组织中仍有明显的差异。27 华中科技大学博士学位论文LncRNAs已报道癌症中的表达情况乳腺癌中低表达[10]在肾癌中的表达情况GAS5MEG3低表达低表达肝癌中低表达[11]PTENP1HOTAIRUCA1前列腺癌、肝癌等中低表达[12]乳腺癌、肝癌中高表达[13,14]膀胱癌中高表达[15]低表达高表达无明显改变无明显改变HULC肝癌中高表达[16]表4部分已报道在癌症中异常表达lncRNAs在肾透明细胞的表达情况。3、LncRNA基因及编码基因共表达网络的构建现有许多研究表明lncRNA基因对编码基因的表达有着接着或间接的调控作用，这一些lncRNAs基因的表达水平与其调控的编码基因的表达水平具有相关性。故分析lncRNA的表达水平与编码基因的表达的相关性有助于相关lncRNAs的功能及其相关靶点的预测及研究。本研究中所使用的lncRNAs表达谱芯片同时可检测几乎现已知的编码基因的mRNA表达水平。充分利用这些芯片的特点，更好地探索lncRNA在肾透明细胞癌中的特点，我们构建了基于lncRNA表达水平与mRNA表达水平相关性的共表达网络（图8）。在这些共表达网络中，没个相关的节点的Pearson相关系数均大于0.99。在网络中共有591个网络节点，1039对相关lncRNAs及mRNAs，包含了323种lncRNAs及196种mRNAs。而且可以发现网络中出现的下调lncRNAs远较上调lncRNAs为多，同时主要与编码基因呈现正相关，这种现象能否反映lncRNAs在肾癌中的特点或者可能与筛选的条件有关，仍需要进一步的深入研究。28 华中科技大学博士学位论文图8LncRNA基因及编码基因共表达共表达网络。图中圆形节点表示mRNA，平行四边形节点表示lncRNA，实线代表连接的两个节点间为正相关，虚线表示负相关。29 华中科技大学博士学位论文讨论LncRNA是近年来生物学领域的研究热点，其研究进展日新月异，在大量疾病特别是肿瘤中研究工作开展迅速，出现越来越多的相关论文[1,17-19]胞癌中研究极少，还没有完整描述肾透明细胞癌肿的lncRNA表达谱，我们的本次研究则是第一次在肾透明细胞癌作出基因组范围内的lncRNA表达谱描述[20-22]。然而有关肾透明细。肾透明细胞癌与其他肿瘤一样是与基因及其表达调控异常相关的疾病，是一系列基因相关事件的结果[23,24]。这些基因包括编码蛋白质的基因以及非编码基因。近年来基因芯片技术、测序技术以及计算机技术的高速发展，令基因的相关研究得到质的飞跃，能够从整体出发，同时检测近乎所有已知基因，得到海量的数据，并运用生物信息学方法进行分析、筛选及预测，极大方便了研究人员，获得了大量的重大发现[25,26]。这些方法工具已在深入研究肿瘤发生、发展中的分子事件，寻找可能的诊断标志及治疗靶点的研究工作中发挥无法代替的作用[27]。正是研究方法手段的快速发展，使得早期难于，甚至无法开展的有关早已被发现的lncRNA的研究得以飞跃进步。大量的研究已经证实在疾病中，特别是在癌症中存在异常表达的lncRNA，而一些一些lncRNA则在肿瘤的发生和进展中发挥着关键的作用[19,28,29]。本研究的目的在于通过基因芯片技术的特点及优势全面展示肾透明细胞癌中lncRNA的表达谱，筛选出异常表达的lncRNA，并初步分析其整体特性，同时在跟多的样本中进行qPCR验证，是进一步研究lncRNA在肾癌中的作用及其分子机制的必要基础。本试验使用的芯片所包含的特异性探针能够检测出高达33045种lncRNA以及30215种mRNA，故能全面展示表达谱的同时在每一对组织中均检测出数以千计的异常表达的lncRNA。在所有六对组织中，相对癌旁组织，共发现480种lncRNA均表达下调，146种lncRNA均表达下调，而且这些lncRNA的相关功能特性几乎均还未有报道，这是何等巨大的宝藏。通过具体的分析，本试验组选择表达差异最为显著的四种lncRNA(ENST00000456816，X91348，BC029135及NR_024418)进行进一步的验证和分析。其中ENST00000456816是基因ENSG00000214145(RP11–513G11.1)的三种转录本之一，长度为796bp，令外两种转录本在本次试验样品中没有被检测到。值得注意的是基因ENSG00000214145(RP11–513G11.1)定位在染色体3q上，这个位置30 华中科技大学博士学位论文对肾癌来说是一个特殊的位置[6,30]。肾癌中做重要的突变，VHL基因就是定位在这个位置上的基因，另一些地位在VHL基因附近的基因如PBRM1，已经被证实在肾透明细胞癌中发挥重要的作用[31]。通过总结，有研究者认为在这个位置，特别是在VHL基因附近的一些异常基因最有可能在肾透明细胞癌中发挥作用[6,30]。虽然ENSG00000214145基因的定位距离VHL基因或者PBRM1基因较远，但是现有研究已经表明lncRNA不仅可以通过顺式作用影响附近的基因，也可以通过反式作用影响距离较远的基因，故ENST00000456816的作用仍值得深入研究[32]。X91348是转录自DiGeorgesyndromecriticalregiongene5(DGCR5)的一条长达1284bp的非编码RNA。DGCR5基因定位于22号染色体，其转录的另外六条RNA同样没有蛋白质产物。这些转录本的转录被一个有关DiGeorge综合症的平行易位所阻断[33]。虽然这早在1996年被Sutherland,H等发现，但是这些改变的生物学作用仍未确定[33]。BC029135是转录自10号染色体的一个长为723bp的转录本，而NR_024418是转录自5号染色体的一个长为1722bp的转录本，两者的特性及生物学功能均未知。上述四种lncRNA在组织中表达水平的qPCR验证证实了芯片的可靠性。同时更多种lncRNA在更多样本中表达水平的qPCR检测提示lncRNA在组织中表达的变异性，但相对癌旁组织，癌组织中的表达水平仍有显著的差异，这提示肾癌中lncRNA有作为诊断标记的潜能。在多种体液如血清、尿液等中已有lncRNA被鉴定为可能的肿瘤分子标记，并正进行更深入的研究[34,35]。虽然根据现有的研究数据，判定存在可以作为肾透明细胞癌的分子标志的lncRNA仍为时过早，但现有的数据对进一步研究是能够有所贡献的，本研究组也计划进行相关研究的可行性分析。另外我们在部分组织中初步验证了部分已报道的在其他癌症中异常表的lncRNAs在肾透明细胞的表达情况。结果表明在部分lncRNAs在肿瘤中的作用可能具有共性，不过仍需具体分析及验证，但是lncRNAs在其他肿瘤的研究能够为其在肾透明细胞癌中的研究提供线索和提示，有助于研究的开展。在计算lncRNA表达水平与编码基因表达水平之间的Pearson相关系数时，本研究组发现许多lncRNA的表达水平可与数百个编码基因的表达水平显著相关。从理论上讲，lncRNA可以通过顺式作用影响附近基因的表达，也可以通过反式作用影响距31 华中科技大学博士学位论文离较远基因的表达，顺式作用已经被研究所证实，而反式作用仍需更大的研究证据进行确认[36,37]。运用表达相关性预测功能，寻找作用靶点的方法已有报道，也已证实是一种便捷有效的研究方法[38,39]。这提示肾癌中这些lncRNA的作用可能与这些与其表达有相关性的编码基因有关，结合现有研究证实的在肾癌中有重要作用的编码基因，是进一步筛选研究的一个突破点。LncRNA的分类主要基于其转录位置，一般认为这种分类没有严谨的生物学意义[8]。随着lncRNA研究的进展及认识的深入，一些特殊类型的lncRNA被特别提出来，这些lncRNA有着特殊的一类功能或者作用，一些基于位置关系并具有类似的功能，如转录自人同源盒转录因子（humanhomeoboxtranscriptionfactors，HOX）基因簇的一类lncRNA，能够影响同源盒基因家族的时空表达而决定相关分子事件的开始；一些基于特殊的具有共同作用方式及功能，如增强子样lncRNA，具有类似基因增强子的功能，能够促进附近基因的表达等[40-42]。这一更科学的分类或归纳既是lncRNA深入研究、增强认识的结果，也对对进一步深入研究及认识lncRNA有重要的意义。基于本次芯片检测的数据，我们也发现了异常表达的特殊类型的lncRNA，但仍需更深入的统计及分析。通过本次研究，我们获得了大量在肾透明细胞癌中异常表达的lncRNA，这无疑是一个巨大的宝库。但是这毕竟只是宏观上的整体情况，在大量的lncRNA中那些真正具有关键作用，其功能如何，通过怎样的分子机制发挥功能，是否具有诊断及治疗的潜在价值，这一些都需要进一步大量的研究工作。期待lncRNA在肾癌的研究能够取得突破。32 华中科技大学博士学位论文参考文献：[1]陈万青,郑荣寿,张思维,等.2003～2007年中国癌症发病分析[J].中国肿瘤,2012(03):161-170.[2]JemalA,BrayF,CenterMM,etal.Globalcancerstatistics[J].CACancerJClin,2011,61(2):69-90.[3]MotzerRJ,JonaschE,AgarwalN,etal.Kidneycancer,version2.2014[J].JNatlComprCancNetw,2014,12(2):175-182.[4]vanderVeldtAA,HaanenJB,vandenEertweghAJ,etal.Targetedtherapyforrenalcellcancer:currentperspectives[J].DiscovMed,2010,10(54):394-405.[5]IacovelliR,AlesiniD,PalazzoA,etal.Targetedtherapiesandcompleteresponsesinfirstlinetreatmentofmetastaticrenalcellcarcinoma.Ameta-analysisofpublishedtrials[J].CancerTreatRev,2014,40(2):271-275.[6]OosterwijkE,RathmellWK,JunkerK,etal.Basicresearchinkidneycancer[J].EurUrol,2011,60(4):622-633.[7]PontingCP,OliverPL,ReikW.EvolutionandfunctionsoflongnoncodingRNAs[J].Cell,2009,136(4):629-641.[8]MercerTR,DingerME,MattickJS.Longnon-codingRNAs:insightsintofunctions[J].NatRevGenet,2009,10(3):155-159.[9]WapinskiO,ChangHY.LongnoncodingRNAsandhumandisease[J].TrendsCellBiol,2011,21(6):354-361.[10]Mourtada-MaarabouniM,PickardMR,HedgeVL,etal.GAS5,anon-protein-codingRNA,controlsapoptosisandisdownregulatedinbreastcancer[J].Oncogene,2009,28(2):195-208.[11]BraconiC,KogureT,ValeriN,etal.microRNA-29canregulateexpressionofthelongnon-codingRNAgeneMEG3inhepatocellularcancer[J].Oncogene,2011,30(47):4750-4756.[12]PolisenoL,SalmenaL,ZhangJ,etal.Acoding-independentfunctionofgeneandpseudogenemRNAsregulatestumourbiology[J].Nature,2010,465(7301):1033-1038.[13]GuptaRA,ShahN,WangKC,etal.Longnon-codingRNAHOTAIRreprograms33 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华中科技大学博士学位论文第二部分长链非编码RNAPTENP1在肾透明细胞癌中的表达调控及功能研究摘要目的探索长链非编码RNAPTENP1在肾癌中的表达调控及生物学功能。方法用qRT-PCR检测PTENP1在肾透明细胞癌细胞系及组织中的表达情况。通过甲基化特异性PCR及检测细胞系5-Aza处理前后PTENP1表达水平的改变分析PTENP1基因甲基化状态。通过体外实验研究PTENP1对肾透明细胞癌增殖、迁移、侵袭的影响；通过体内实验研究PTENP1对肾透明细胞癌肿瘤生长、转移的影响。结果相对于对应得正常对照，在肾透明细胞癌细胞系ACHN,OS-RC-2,CaKi-1及SN12-PM6及组织中PTENP1呈现低表达。甲基化特异性PCR提示在低表达的细胞系及组织中存在PTENP1基因甲基化，5-Aza处理细胞系后PTENP1的异常低表达可以恢复。PTENP1能够抑制肾透明细胞癌增殖及肿瘤生长，能够抑制肾透明细胞癌的迁徙和肿瘤转移。结论肾透明细胞癌中PTENP1由于基因DNA甲基化而呈现低表达。PTENP1在人肾透明细胞癌起抑癌基因样作用，在其发生发展中具有重要的作用。【关键词】肾透明细胞癌；PTENP1；DNA甲基化；抑癌基因37 华中科技大学博士学位论文PartⅡTheexpressionandfunctionoflncRNAPTENP1inrenalclearcellcarcinomaAbstractObjectiveTostudytheexpression,regulationandfunctionoflongnoncodingRNA(lncRNA)PTENP1inhumanrenalclearcellcarcinoma(RCCC).MethodsExpressionofPTENP1wasexaminedbyquantitativereversetranscriptasePCR(qRT-PCR)andmethylationspecificpolymerasechainreaction(MSP)wasperformedin6renalcelllinesbeforeandaftertreatmentwith5-aza-2’-deoxycytidine(5-Aza).MSPwasappliedin12pairsofprimarytumorsandadjacentnormaltissues.ThebiologicalfunctionassaysofPTENP1incellproliferation,migrationandinvasionandtumourgrowthandmetastasiswereperformedinvitroandvivo.ResultsPTENP1wasdownregulatedinfouroffiveRCCCcelllines(ACHN,OS-RC-2,CaKi-1andSN12-PM6)andprimarytumortissues.TheaberrantlowexpressionofPTENP1couldberestoredafterdemethylationby5-Azatreatment.AberrantmethylationofPTENP1genewasdetectedinRCCCcelllinesandprimarytumortissueswithlowPTENP1expression.PTENP1suppressesproliferation,migrationandinvasionofRCCCcelllinesinvitroandsuppressesRCCCgrowthandmetastasisinvivo.ConclusionLncRNAPTENP1isoftendown-regulatedRCCCcelllinesandprimarytumorswhichisdueDNAmethylation.ThetumoursuppressorfunctionofPTENP1inRCCCconfirmedthatitmayplayanimportantroleinthepathogenesisofhumanrenalcellcarcinoma.【Keywords】Renalclearcellcarcinoma,PTENP1,DNAmethylation,Tumorsuppressgene38 华中科技大学博士学位论文前言肾透明细胞癌，是泌尿系常见肾癌肿瘤的主要组织类型[1]。肾透明细胞癌具有放疗及化疗均不敏感的生物学特性，患者一旦出现无法切除的肿瘤灶癌则预后不良[2]。目前临床上进展及晚期肾透明细胞癌的治疗仍缺乏有效方法，治疗效果令人失望[2]。全世界的泌尿系肿瘤研究人员一致认为需要更加深入研究肾透明细胞癌相关的分子事件，为更好地治疗肾癌寻找更好的途径和靶点[3]。非编码RNA是近十年来生物学研究中最重要的进展之一，特别是长链非编码RNA（lncRNA）更是取得了令人鼓舞的进展[4]。研究表明在多种人类疾病，特别是在癌症中lncRNA发挥着关键的作用，是进一步认识癌症从而战胜癌症的一个高峰[5]。在前期工作中我们通过用lncRNAs表达谱芯片及组织中qTR-PCR验证，发现了部分在肾透明细胞癌中异常表达的lncRNAs。也证实了部分在其他肿瘤中异常表达且具有一定功能的lncRNA在肾透明细胞癌肿具有一致的表达情况，如GAS5、MEG3、HOTAIR及PTENP1。由于lncRNA研究方面的经验有限，从这些已有文献的lncRNAs入手可以帮助我们积累lncRNA在肾透明细胞癌中功能机制研究的经验。其中PTENP1是经典抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源基因（Phosphataseandtensinhomolog，PTEN）的假基因（pseudogene）。定位于10q23.3的PTEN基因已经被证实在多种癌症中存在突变，动物实验也证明PTEN的表达异常可以导致多种癌症，包括肾癌、乳腺癌、肝癌、胃癌等。研究证明PTEN基因编码一种磷酸酶，能够通过负向调节PI3-K/Akt/mTOR信号通路而发挥抑癌作用[6-8]。转录于9p13.3的长链非编码RNAPTENP1作为PTEN的假基因与PTEN有高度同源性，在PTENP1的3’的非编码区（3’UTR）存在与PTEN3’UTR高度同源(～95%)的区域。有研究表明在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等细胞系中PTENP1具有抑癌功能[9]。同时有研究发现在多种癌细胞系PTENP1基因存在甲基化[10]。本研究正是通过研究PTENP1在肾透明细胞癌中的表达及基因DNA甲基化情况，建立其在肾透明细胞癌中的基本认识，进而探索其在肾透明细胞癌中的功能，加深对肾透明细胞癌的认识，为全面认识肾透明细胞癌从而攻克肾透明细胞癌贡献力量。39 华中科技大学博士学位论文材料与方法1、组织样本肾透明细胞癌及其相应癌旁组织均来取自2011年4月至12月于华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科进行手术治疗的肾癌患者，经术后病理证实为肾透明细胞癌。组织的收取均得到同意并严格规范按进行。2、主要实验试剂DEPC(美国Sigma公司)TRIzol(美国Invitrogen公司)5-Aza(美国Sigma公司)RNaseyMiniKit(美国Qiagen公司)FermentasRTreagentKit(美国Fermentas公司)SYBRPremixExTaq(日本Takara公司)QIAampDNAMiniKit(美国Qiagen公司)EpitectBisulfiteKit(美国Qiagen公司)E.Z.N.A.BacterialDNAKit(美国Omega公司)pPACKH1™LentivectorPackagingKit(美国SystemBiosciences公司)Dulbecco’smodifiedEagle’smedium（DMEM）培养基(美国GIBCO公司)胎牛血清（FBS）(美国Invitrogen公司)胰蛋白酶（Trypsin）(美国GIBCO公司)3、实验器材Transwellchamber（Corning）超净工作台（美国Thermo公司）生物安全柜(美国HealForce公司)台式低温离心机（美国BD公司）40 华中科技大学博士学位论文恒温水浴箱（南京先欧公司）低温冰箱（青岛Haier公司）恒温二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）IX71倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）NanoDropND-1000MX3000P定量PCR仪（美国Thermo公司）VeritiPCR仪（美国Thermo公司）4、细胞系及培养透明细胞癌细胞系ACHN、786-O、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6及人肾近端小管上皮细胞系HK-2(购自CTTCC)。细胞系常规培养于含10%FBS的DMEM培养液中，37℃、5%CO2培养箱培养，根据细胞生长情况,每2-3天传代培养。5、主要实验方法5.1组织样本的收集组织在离体20分钟内收集。在有经验临床医师指导下辨认肿瘤组织，切下肿瘤组织及正常癌旁组织后迅速用PBS溶液冲洗，将样本剪切成约0.4*0.4*1.0cm的块状装入预先标记好的冻存管中并迅速置入液氮罐中。同时均留取部分组织中性福尔马林固定送病理分析。收集的组织样本置于-80℃低温冰箱保存。采集完整的临床和随访资料。5.2培养细胞的去甲基化处理临用时用双蒸水溶解5-Aza，加入细胞培养基中至终浓度为10µM，用于细胞培养，每日更换，共三天，三天后收集细胞进行下一步实验。5.3组织总RNA的提取（8）取约50mg冰冻组织置入预处理的研钵中，加入液氮，在存在液氮下迅速研磨组织至粉末状加入1mlTrizol试剂对组织进行裂解；41 华中科技大学博士学位论文（9）将上述组织Trizol裂解液转入无RNasefreeEP管中，室温下裂解5分钟；（10）在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，手动用力震荡15秒，室温下放置3分钟，12000g，4℃，离心15分钟；（11）小心转移上层水相至新RNasefreeEP管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温下放置10分钟，12000g，4℃，离心10分钟；（12）弃上清，加入1ml75%乙醇轻轻洗涤沉淀，7500g，4℃，离心5分钟，弃上清；（13）室温放置约10分钟挥发多余乙醇，避免完全干燥，加入80ulRNasefree水溶解RNA；（14）55°C水浴锅中变性10分钟，-80℃保存。（15）用NanoDropND-1000检测RNA在260、280及230nm处的吸光度，并分析A260/A280的比值，同时检测RNA的浓度；（16）使用常规甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。5.4RNA逆转录反应根据FermentasRTreagentKit试剂盒操作规程进行。反应体系如下TemplateRNA10mMdNTPmixOligo(dT)primerRNase-freewater总体积xµl(upto1µg)1µl1µlxµl10μl加样在冰上进行，逆转录反应设置为引物延伸25℃，10分钟；cNDA合成40℃，30分钟；终止反应85℃，5分钟；降至4℃保存。5.5组织DNA的提取（1）使用QIAampDNAMiniKit提取，取约25mg组织剪刀尽量剪碎，置入1.5mlEP管中，加入180μlBufferATL；42 华中科技大学博士学位论文（2）加入20μl蛋白酶K，漩涡混匀，56℃孵育，间断漩涡震荡，直至组织裂解；（3）短暂离心，使全都液体置EP管底部；（4）加入4μlRNaseA(100mg/ml)，脉冲漩涡震荡20秒，室温孵育2分钟，加入200μlBufferAL，脉冲漩涡震荡20秒，70℃孵育10分钟，短暂离心；（5）加入200μl无水乙醇，脉冲漩涡震荡20秒，短暂离心；（6）将上述溶液加入套好2ml收集管的离心柱中，≥6000g离心≥1分钟，丢去废液；（7）加入500μlBufferAW1至套好2ml收集管的离心柱中，≥6000g离心≥1分钟，丢去废液；（8）加入500μlBufferAW2至套好2ml收集管的离心柱中，最高速离心≥3分钟，丢去废液；（9）把离心柱套入新的2ml收集管中，最高速离心≥1分钟，丢去废液；（10）把离心柱套入新的1.5ml收集管中，直接加入200μlElutionBuffer(AE)至离心柱的滤膜中，室温放置1分钟，≥6000g离心1分钟，收集DNA；（11）可以重复第10步；（12）用NanoDropND-1000检测DNA在260、280处的吸光度，同时检测DNA的浓度。5.6细胞DNA的提取（1）常规收集约5*106数量的细胞，离心去上去清，用200μlPBS缓冲液重悬细胞；（2）加入20μl蛋白酶K，加入200μlBufferAL，脉冲漩涡震荡20秒；（3）56℃孵育10分钟，短暂离心；（4）加入200μl无水乙醇，脉冲漩涡震荡20秒，短暂离心；43 华中科技大学博士学位论文（5）将上述溶液加入套好2ml收集管的离心柱中，≥6000g离心≥1分钟，丢去废液；（6）加入500μlBufferAW1至套好2ml收集管的离心柱中，≥6000g离心≥1分钟，丢去废液；（7）加入500μlBufferAW2至套好2ml收集管的离心柱中，最高速离心≥3分钟，丢去废液；（8）把离心柱套入新的2ml收集管中，最高速离心≥1分钟，丢去废液；（9）把离心柱套入新的1.5ml收集管中，直接加入200μlElutionBuffer(AE)至离心柱的滤膜中，室温放置1分钟，≥6000g离心1分钟，收集DNA；（10）可以重复第10步；（11）用NanoDropND-1000检测DNA在260、280处的吸光度，同时检测DNA的浓度。5.7DNA的亚硫酸氢盐转化和DNA回收（1）每管BisulfiteMix加入800μlRNase-free水，旋涡震荡，直到完全溶解混合；（2）根据下述体系在200μL的PCR管中设立亚硫酸氢盐反应；DNA溶液RNase-free水BisulfiteMix溶液DNAProtectBuffer总体积500ng-2μg，最多20μlXμl85μl35μl140μl（3）盖上PCR管，彻底混合亚硫酸氢钠反应体系至DNA保护缓冲液变成蓝色；（4）VeritiPCR仪按下表进行热循环重亚硫酸盐转化；44 华中科技大学博士学位论文步骤变性孵化变性孵化变性孵化保持温度95℃60℃95℃60℃95℃60℃20℃持续时间5分钟25分钟5分钟85分钟5分钟175分钟不限（5）将PCR管短暂离心，转移反应液至干净的1.5mlEP管；（6）每管加入310μlBufferBL，漩涡混匀，短暂离心；（7）每管加入200μl无水乙醇，脉冲漩涡震荡15秒，短暂离心；（8）将上述溶液加入套好2ml收集管的离心柱中，最高速离心1分钟，丢去废液；（9）加入500μlBufferBW到离心柱中，最高速离心1分钟，丢去废液；（10）加入500μlBufferBD到离心柱中，盖上管盖，室温静置15分钟，最高速离心1分钟，丢去废液；（11）加入500μlBufferBW到离心柱中，最高速离心1分钟，丢去废液，重复一次；（12）每管加入250μl无水乙醇，最高速离心1分钟；（13）把离心柱套入新的2ml收集管中，最高速离心≥1分钟，丢去废液；（14）把离心柱套入新的1.5ml收集管中，直接加入15μlBufferEB至离心柱的滤膜中心，室温放置1分钟，15000g离心1分钟，收集DNA；（15）-20℃保存。5.8Q-PCR检测反应MX3000P上使用SYBRPremixExTaq试剂进行qPCR反应。qPCR反应设置为预变性95℃，10分钟；PCR反应为95℃5秒，61℃30秒，72℃30秒进行40个循45 华中科技大学博士学位论文环，最后72℃作用5分钟，设备自动进行溶解曲线分析。PCR反应以GAPDH作为内参。反应体系及PCR反应引物如下：SYBRPremixExTaq(2x)ForwardPrimer(10mM)ReversePrimer(10mM)cDNA12.5μl1μl1μl2μlDouble-distilledwater总体积8.5μl25μl名称GAPDH上游引物下游引物tgggtgtgaaccatgagaagtcagaacatggcatacaccaatagtgagaatatttggatatagggggagaatatttggatataggtgggtttaccggcatcaaatgtgtcgctgttgaagtcagatgatgacgtccgatttttcaPTENP1UnmethylatedPTENP1MethylatedPTENP1PTENaatttactacaccgattaactcgtcaatttactacaccaattaactcatccccccactttagtgcagt5.9DNA琼脂糖电泳的检测（1）2%琼脂糖凝胶液的配制：54gTris碱、27.5g硼酸、20ml0.5mol/LEDTA（pH8.0）加入1000ml双蒸水中配制成将5×TBE缓冲液，使用时稀释成1×TBE缓冲液。称取0.4g琼脂糖，置于锥型瓶中，加入50ml1×TBE缓冲液，微波炉加热至琼脂糖全部熔化，趁热取出摇匀。向完全熔化的琼脂糖凝胶液中加入溴化乙锭溶液使其终浓度为0.5μg/ml。（2）凝胶的制备：将配套梳子和胶板按规则在事先洗净吹干的塑料胶槽上安装好。将上述制备的琼脂糖凝胶缓缓倒入胶槽内，使胶液在胶槽上分布均匀，注意避免产生气泡。静置30min，待胶层完全凝固后轻轻垂直拔出梳子。（3）加样：将上述制备的凝胶放入电泳槽中，轻轻倒入TBE稀释液，加入量为电泳液没过凝胶，注意不要遗留气泡于凝胶上的加样孔中。取0.6μl的1046 华中科技大学博士学位论文×Loadingbuffer加入6μlDNA中，移液器混合，轻轻将DNA样品点入凝胶上的加样孔中，注意样品不要溢出或穿破加样孔。（4）电泳：合上电泳槽盖，接通电源，设置电压保持在100-120V，电泳20-30min，观察溴酚蓝条带向前移动约3cm时即可停止电泳。（5）在UVP凝胶成像系统中观察DNA条带，观察DNA条带，分析质量并记录。5.10大肠杆菌的培养扩增大肠杆菌培养基配置如下：氯化钠胰蛋白胨酵母提取物加水至10g10g5g1L培养基高压蒸汽灭菌，降温后分装至玻璃试管中，每20ml培养基加入适量菌液及20μl0.1g/ml的氨苄青霉素，塞上试管口塞子好后置恒温摇床37℃，220rpm，扩增14小时后提取质粒。5.11质粒的提取（1）大肠杆菌扩增后，5000g离心10分钟，去上清，加入500μlSolutionⅠ，充分混匀，转入2mlEP中；（2）加入加入500μlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀，室温放置5分钟；（3）加入加入500μl预冷的BufferN3，轻轻颠倒混匀，出现絮状沉淀；（4）4℃，12000g离心3分钟，转移上清至新1.5mlEP中；（5）加入0.1倍体积的ERTSolution，轻轻颠倒7-10次混匀；（6）冰浴10分钟，期间颠倒混匀数次；（7）42℃水浴孵育5分钟，室温12000g离心3分钟，转移上清至新2mlEP中；（8）加入0.5倍体积的无水乙醇；47 华中科技大学博士学位论文（9）将700μl上述溶液加入套好2ml收集管的离心柱中，室温10000g离心1分钟，丢去废液；（10）重复上述步骤至全部溶液经过离心柱；（11）加入500μlBufferHB，室温10000g离心1分钟，丢去废液；（12）加入700μl已加入乙醇的DNAwashBuffer，室温10000g离心1分钟，丢去废液，重复一次；（13）≥13000g离心3分钟，干燥离心柱；（14）加入100μlTE，室温放置2分钟，室温10000g离心1分钟，洗脱质粒，必要时重复一次；（15）用NanoDropND-1000检测DNA在260、280处的吸光度，同时检测DNA的浓度。5.12慢病毒的包装：慢病毒包装试剂盒pPACKH1™LentivectorPackagingKit包含所需293TN细胞系；包装质粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV及pVSV-G；阳性对照质粒pSIH1-H1-siLuc-copGFP；表达载体pCDHlentivector，需表达基因构建至pCDHlentivector（由武汉转导生物完成）；具体包装步骤如下：（1）提前18-24小时传代293TN细胞至10cm细胞培养板中，使细胞密度约为60%-70%；（2）在EP管中加入1ml无血清DMEM培养基，加入包装质粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV及pVSV-G各3.75μg，及表达载体2.25μg；（3）加入27.5µlPureFection，漩涡混匀10秒钟，室温孵育15分钟；（4）加入上述混合物至含10ml培养基的10cm细胞培养板中继续培养293TN细胞；（5）转染12小时后换液一次；48 华中科技大学博士学位论文（6）转染后48及72小时分别收集培养细胞上清，室温3000g离心3分钟，转移上清至新离心管中，加入1/4体积的4℃PEG-itVirusPrecipitationSolution，放置沉淀过夜；（7）4℃，1500g离心30分钟，转移上清至新离心管中备用，继续1500g离心分钟，加入1/20原溶液体积的PBS溶解沉淀；（8）-80℃低温冰箱保存备用。5.13慢病毒的感染：在传代有目标细胞的96孔板中加入适量慢病毒，作浓度梯度，加入1/1000体积的感染增强剂Polybrene，感染8小时后换液一次，后常规换液及传代，第3-4天荧光显微镜观察感染情况，确定合适感染浓度，并提取RNA和/或蛋白质作验证。5.14细胞增殖实验：（1）各实验组细胞分别接种于96孔板，每孔1000细胞，各组每次6个副孔，进行相关处理；（2）在检测时间点，更换培养基，每孔加入10µLCCK-8孵育1-3小时；（3）在酶标仪上于450nm测量每孔吸光度值，减去空白对照后计算增殖情况。5.15细胞迁移及侵袭实验：（1）使用适用于24孔板Transwell小室，按说明书要求预处理Transwell小室，迁移实验至含培养基24孔板放置培养箱30分钟，侵袭实验Transwell小室上室包被基质胶；（2）收集各组细胞，PBS洗涤两次，精确计数后用200µL无血清DMEM培养基重悬各组细胞，ACHN细胞数目为1×105，SN12PM6细胞数目为5×104；（3）上述细胞悬液加入Transwell小室上室，置入每孔有600µL含10%FBS的DMEM培养基中，每组设置3个副孔，共培养12-18小时；49 华中科技大学博士学位论文（4）用棉签轻轻擦去上室内未迁移或侵袭的细胞，入细胞染色液，染色20min，流水中轻轻漂洗干净，风干；（5）倒置显微镜观察，拍照记录，细胞计数并分析。5.16裸鼠肿瘤异体移植实验：（1）构建稳定表达PTENP1及感染空载慢病毒的ACHN细胞系；（2）两组裸鼠，每组六只，每只裸鼠使用细胞数目为5×106，统一无血清培养基重悬细胞，左侧腋下皮下注射，每三天测量、统计一次肿瘤大小，荷41天后处死裸鼠，取出肿瘤并测量；（3）处死前利用活体成像技术检测、分析肿瘤转移情况，并运用相关技术进行定量分析。6、统计学方法数据使用SPSSl6.0软件包进行统计分析。实验进行三次重复。两组间比较根据数据类型使用t检验或卡方检验，相关分析采用Pearson相关性检验。p<0.05被视为具有统计学意义。结果1、长链非编码RNAPTNEP1在肾透明细胞癌中低表达运用qPCR在五种人肾透明细胞癌细胞系ACHN、786-O、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6和对照细胞系人近端肾小管上皮细胞系HK-2中检测PTENP1的表达水平。检测结果证实，相对于HK-2细胞系，PTENP1在四种细胞系中ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6低表达，差异具有显著的统计学意义（图1）。但是在786-O细胞系中PTENP1出现相反的情况，PTENP1呈现明显的高表达（图1）。在原发肿瘤中12例肾透明细胞癌组织相对相应癌旁组织均呈现出有统计学意义的低表达(图1)。上述结果表明PTENP1在肾透明细胞癌中存在异常调控，可能在肾癌的发生发展中发挥着重要的调节功能。50 华中科技大学博士学位论文图1PTENP1在肾透明细胞癌原发肿瘤组织中低表达，四种细胞系ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6中低表达（**P<0.05）。T代表原发肿瘤，N代表相应癌旁组织，HK-2为正常人肾近端小管上皮细胞。2、肾透明细胞癌中PTENP1基因存在异常甲基化针对PTENP1基因启动子区域设计了甲基化特异性PCR引物。甲基化特异性PCR后行凝胶电泳，检测表明在PTENP1低表达的细胞系ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6中PTENP1基因存在异常的甲基化（图2）。而在PTENP1高表达的细胞系786-O中则未检测到甲基化。在临床样本中，检测到了一致的结果，则在肾透明细胞癌中PTENP1基因存在异常的甲基化（图2）。在细胞系中，经过去甲基化药物5-Aza处理三天后，PTENP1在细胞系ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6中的异常低表达可以恢复（图3）。上述结果提示，在肾透明细胞癌中基因DNA甲基化是引起PTENP1低表达的原因。这是一种常见的表观遗传调控方式。51 华中科技大学博士学位论文图2肾透明细胞癌中PTENP1的甲基化情况。图2a中NC，非甲基化DNA阴性对照；PC，甲基化DNA阳性对照；MOCK，空白对照。图2b为四种肾透明细胞癌细胞系ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6中PTENP1的甲基化情况，图中可以看出细胞系DNA亚硫酸氢盐转化后甲基化特异性引物扩增产物电泳相对非甲基化引物扩增产物有明显的条带，说明存在甲基化。图3c为在肾透明细胞癌组织中PTENP1的甲基化情况，同样可以看出癌组织中存在PTENP1DNA甲基化。NC，非甲基化DNA；PC，甲基化DNA；M，甲基化；U，非甲基化。52 华中科技大学博士学位论文图3肾透明细胞癌细胞系去甲基化药物5-Aza处理后PTENP1表达水平的变化情况。图中可以看出细胞系ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6去甲基化处理后PTENP1的表达明显增加（**P<0.05），提示存在PTENP1DNA甲基化。PTENP1表达水平的改变在786-O中较为特殊，前期研究表明PTENP1在786-O中是高表达的，可能是特殊的例外情况。3、PTENP1能够抑制肾透明细胞癌细胞的增殖及肿瘤生长包装、提取能够表达PTENP1的慢病毒，通过感染慢病毒，构建稳定过表达PTENP1的细胞系ACHN、SN12-PM6及感染空载慢病毒的细胞系ACHN、SN12-PM6（图4）。CCK-8增殖实验表明过表达PTENP1能够抑制肾透明细胞癌细胞的增殖，抑制程度具有统计学意义（图5）。在体内实验中，使用稳定表达PTENP1及感染空载慢病毒的ACHN在裸鼠上进行异体移植试验。两组裸鼠，每组六只，每三天测量、统计一次肿瘤大小，荷瘤41天后处死裸鼠，取出肿瘤。研究表明稳定表达PTENP1能够降低ACHN异体瘤的生长速度及最终的肿瘤体积（图6），虽然成瘤率并无显著的差异。上述研究结果表明PTENP1在肾透明细胞癌中具有抑癌作用。53 华中科技大学博士学位论文图4细胞系ACHN、SN12-PM6感染表达PTENP1慢病毒后PTENP1的表达水平明显提高（**P<0.01）。图5稳定过表达PTENP1能够抑制肾癌细胞系ACHN和SN12-PM6的增殖（*P<0.05）。54 华中科技大学博士学位论文图6稳定过表达PTENP1能够降低ACHN异体瘤的生长速度（*P<0.05）。4、PTENP1能够抑制肾透明细胞癌细胞的迁移、侵袭及肿瘤转移运用稳定表达PTENP1的细胞系ACHN、SN12-PM6利用Transwell小室进行体外迁移、侵袭试验。在Transwell小室中共培养12-18小时后发现，稳定表达PTENP1能够抑制细胞系ACHN、SN12-PM6的迁移及侵袭（图7）。上述肿瘤异体移植裸鼠在处死前利用活体成像技术检测、分析肿瘤转移情况，并运用相关技术进行定量分析，检测结果表明稳定表达PTENP1能够减少ACHN异体瘤在裸鼠中的转移（图8）。综合上述结果，PTENP1在肾透明细胞癌中具有着肿瘤抑制功能，其在肾透明细胞癌中失活是DNA异常甲基化的结果。55 华中科技大学博士学位论文图7稳定表达PTENP1能够抑制肾癌细胞系ACHN和SN12-PM6的迁移及侵袭（*P<0.05）。图8稳定表达PTENP1能够显著降低ACHN异体瘤转移（*P<0.05）。56 华中科技大学博士学位论文讨论一般认为肿瘤是多基因表达调控异常而导致的疾病[11,12]。在肿瘤的研究中寻找肿瘤抑制性基因并研究其失活原因是肿瘤基础研究的一个重要方面[13]。经过多年的研究已经在多种肿瘤中发现了大量癌基因及抑癌基因，为人类认识肿瘤、治疗肿瘤作出了重大的贡献[13]的是抑癌基因VHL的突变或缺失，导致功能性VHL蛋白缺失或不足导致缺氧诱导因子（HIF）α异常堆积，引起一系列生长因子的异常表达[3,14,15]经开发出了靶向治疗药物，这是肾癌近年来最重要的治疗进展[16]。在肾透明细胞癌的研究中已经发现可许多的异常基因，其中最为重要。针对这一通路异常已。但是进展期肾癌治疗效果仍远不能令人满意，提示在肾癌的研究中仍需要进行更多的工作，深入解析肾癌，寻找更有效的治疗途径和靶点[16]。既往在癌基因及抑癌基因的研究中，研究者均把目光放在蛋白质编码基因上，这也简化了研究并取得和巨大的成就[13]。但是随着后基因组时代的来临，研究人员发现，仅从编码基因及其产物领域出发无法解释复杂的生物过程[4]。故非编码基因及其产物非编码RNA等再次得到研究人员的重视，而事实证明，这是具有重大意义的转折[4]。非编码RNA从其长度出发，简单的分为小分子非编码RNA及长度大于200nt的长链非编码RNA。小分子非编码RNA最为人熟知的是micro-RNA，大量的研究已经证实其功能作用并已阐述机制[17]。LncRNA是一类由RNA聚合酶II转录的，长度大于200nt的RNA分子，具有mRNA相似的结构，可有不同的剪接，可形成polyA尾巴及启动子结构，不能翻译蛋白质或几乎不能翻译蛋白质[18]。虽然起初被认为是无功能的RNA聚合酶II转录副产物，但现在其在正常及异常生物过程中的重要地位已经得到承认[18,19]。LncRNA能够通过多种途径对各个生物学过程产生影响。在多种人类疾病，特别是在肿瘤中已经对lncRNA进行了大量的研究，证实了大量重要发现[20]。研究表明，lncRNA在肝癌、肺癌、乳腺癌、前列腺癌等的发生、发展中均有重要作用[20]。LncRNA功能及其作用机制的不断揭示，为肿瘤的研究开辟了一个新天地，有希望成为肿瘤研究取得重大突破点。随着lncRNA在肿瘤中研究的兴起，lncRNA在肾透明细胞癌中的研究也得以开展，如研究发现lncRNAH19、GAS5在肾癌中具有抑癌功能，而KCNQ1OT1及57 华中科技大学博士学位论文MALAT1则具有促癌功能[21-24]。PTENP1是经典抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源基因（PTEN，Phosphataseandtensinhomolog）的假基因（pseudogene）。有研究表明PTENP1在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等细胞系中呈低表达并具有抑癌功能[9]。本实验组在lncRNA表达谱芯片检测的基础上，结合文献资料，探索了lncRNAPTENP1在肾透明细胞癌中的表达调控及功能。我们发现在PTENP1在肾透明细胞癌原发肿瘤中呈低表达，这与在其他癌症中的表达一致。同时在肾透明细胞癌细胞系ACHN、OS-RC-2、CaKi-1及SN12-PM6中相对正常肾近端小管上皮细胞HK-2，PTENP1亦呈低表达。PTENP1在肾透明细胞癌中低表达促使我们考虑其低表达的原因，可能为基因突变、基因甲基化等。通过文献阅读发现，曾有PTENP1基因甲基化的报道[10]。故我们检测了PTENP1基因甲基化的情况。甲基化特异性PCR结果证实在PTENP1低表达的原发肿瘤及细胞系中PTENP1基因存在不同程度的甲基化。用去甲基化药物5-Aza处理PTENP1低表达的细胞系后，PTENP1的表达能有所恢复。检测结果表明基因甲基化是PTENP1低表达的一个原因。表观遗传学研究证明，DNA甲基化是基因失活的一个重要原因，特别是肿瘤中抑癌基因失活的一个重要原因，在肿瘤的发生和发展中具有重要作用[25]。近期研究证实了DNA甲基化同样可以调控非编码基因的表达[26]。根据文献资料及PTENP1在肾透明细胞癌中低表达、DNA甲基化的研究结果，我们认为PTENP1在肾透明细胞癌中可能具有抑癌功能。我们通过细胞功能实验，发现PTENP1能够抑制肾透明细胞癌的增殖、迁移及侵袭，证实了我们的猜想。通过本研究，我们初步证实了PTENP1在肾透明细胞癌中具有生物学功能，可能在肾透明细胞癌的发生及发展中具有重要作用。当然，这些发现还需要更大的临床样本进行进一步的确认，而且对于PTENP1在肾透明细胞癌中的研究还远远不足，PTENP1在肾癌中是否存在其他调控方式，其作用机制是什么，对临床肿瘤的进展或预后有无影响，是否具有诊断及治疗价值等都需要进一步的研究。我们期待随着lncRNA在肾癌中研究的不断深入，能够让我们更深入地了解肾癌，揭示其发生、发展的本质，进一步丰富肾癌的分子生物学理论和实践，促进肾癌治疗的发展与飞跃。58 华中科技大学博士学位论文参考文献：[1]MotzerRJ,JonaschE,AgarwalN,etal.Kidneycancer,version2.2014[J].JNatlComprCancNetw,2014,12(2):175-182.[2]KenneyPA,WoodCG.Integrationofsurgeryandsystemictherapyforrenalcellcarcinoma[J].UrolClinNorthAm,2012,39(2):211-231.[3]Comprehensivemolecularcharacterizationofclearcellrenalcellcarcinoma[J].Nature,2013,499(7456):43-49.[4]AkhtarA,FuchsE,MitchisonT,etal.Adecadeofmolecularcellbiology:achievementsandchallenges[J].NatRevMolCellBiol,2011,12(10):669-674.[5]ShiX,SunM,LiuH,etal.Longnon-codingRNAs:anewfrontierinthestudyofhumandiseases[J].CancerLett,2013,339(2):159-166.[6]SalmenaL,CarracedoA,PandolfiPP.TenetsofPTENtumorsuppression[J].Cell,2008,133(3):403-414.[7]AlimontiA,CarracedoA,ClohessyJG,etal.SubtlevariationsinPtendosedeterminecancersusceptibility[J].NatGenet,2010,42(5):454-458.[8]SongMS,SalmenaL,PandolfiPP.ThefunctionsandregulationofthePTENtumoursuppressor[J].NatRevMolCellBiol,2012,13(5):283-296.[9]PolisenoL,SalmenaL,ZhangJ,etal.Acoding-independentfunctionofgeneandpseudogenemRNAsregulatestumourbiology[J].Nature,2010,465(7301):1033-1038.[10]HessonLB,PackhamD,PontzerE,etal.AreinvestigationofsomatichypermethylationatthePTENCpGislandincancercelllines[J].BiolProcedOnline,2012,14(1):5.[11]WillettW.Nutritionandcancer:thesearchcontinues[J].NutrCancer,2008,60(5):557-559.[12]SupicG,JagodicM,MagicZ.Epigenetics:anewlinkbetweennutritionandcancer[J].NutrCancer,2013,65(6):781-792.[13]NagaiH,HaradaH,EmiM.[Oncogeneandtumorsuppressorgene][J].NihonRinsho,2000,58Suppl:25-29.[14]GnarraJR,ToryK,WengY,etal.MutationsoftheVHLtumoursuppressorgenein59 华中科技大学博士学位论文renalcarcinoma[J].NatGenet,1994,7(1):85-90.[15]SchramlP,StruckmannK,HatzF,etal.VHLmutationsandtheircorrelationwithtumourcellproliferation,microvesseldensity,andpatientprognosisinclearcellrenalcellcarcinoma[J].JPathol,2002,196(2):186-193.[16]DutcherJP.Recentdevelopmentsinthetreatmentofrenalcellcarcinoma[J].TherAdvUrol,2013,5(6):338-353.[17]HuangY,ZhangJL,YuXL,etal.MolecularfunctionsofsmallregulatorynoncodingRNA[J].Biochemistry(Mosc),2013,78(3):221-230.[18]PontingCP,OliverPL,ReikW.EvolutionandfunctionsoflongnoncodingRNAs[J].Cell,2009,136(4):629-641.[19]BatistaPJ,ChangHY.LongnoncodingRNAs:cellularaddresscodesindevelopmentanddisease[J].Cell,2013,152(6):1298-1307.[20]WapinskiO,ChangHY.LongnoncodingRNAsandhumandisease[J].TrendsCellBiol,2011,21(6):354-361.[21]KeniryA,OxleyD,MonnierP,etal.TheH19lincRNAisadevelopmentalreservoirofmiR-675thatsuppressesgrowthandIgf1r[J].NatCellBiol,2012,14(7):659-665.[22]QiaoHP,GaoWS,HuoJX,etal.Longnon-codingRNAGAS5functionsasatumorsuppressorinrenalcellcarcinoma[J].AsianPacJCancerPrev,2013,14(2):1077-1082.[23]ChiesaN,DeCrescenzoA,MishraK,etal.TheKCNQ1OT1imprintingcontrolregionandnon-codingRNA:newpropertiesderivedfromthestudyofBeckwith-WiedemannsyndromeandSilver-Russellsyndromecases[J].HumMolGenet,2012,21(1):10-25.[24]KuiperRP,SchepensM,ThijssenJ,etal.UpregulationofthetranscriptionfactorTFEBint(6;11)(p21;q13)-positiverenalcellcarcinomasduetopromotersubstitution[J].HumMolGenet,2003,12(14):1661-1669.[25]EstellerM.Dormanthypermethylatedtumoursuppressorgenes:questionsandanswers[J].JPathol,2005,205(2):172-180.[26]XhemalceB.FromhistonestoRNA:roleofmethylationincancer[J].BriefFunctGenomics,2013,12(3):244-253.60 华中科技大学博士学位论文第三部分长链非编码RNAPTENP1在肾透明细胞癌中的分子机制研究摘要目的长链探索非编码RNAPTENP1在肾癌中的抑癌功能的分子机制。方法用qRT-PCR检测PTENP1及PTEN在肾透明细胞癌组织中的表达情况并分析其关系。通过Westernblot检测肾透明细胞癌细胞系ACHN和SN12-PM6中过表达PTENP1后PTEN表达水平的改变。用qRT-PCR检测miR-21在肾透明细胞癌中的表达情况。利用荧光素酶报告试验验证miR-21对PTENP1及PTEN的靶向作用。利用过表达及共表达方法，构建过表达及共表达细胞系进行功能实验，探索mir-21及PTEN在肾透明细胞癌中的功能并分析miR-21及PTEN对PTENP1在肾透明细胞癌中功能的影响。结果在肾透明细胞癌组织中PTENP1及PTEN具有正性共表达关系。在肾透明细胞癌细胞系ACHN和SN12-PM6中过表达PTENP1能够在蛋白质水平增加PTEN的表达。PTEN在肾透明细胞癌中具有与PTENP1相似的抑癌功能。在肾透明细胞癌中miR-21能够靶向作用PTENP1及PTEN。MiR-21在肾透明细胞癌中具有促癌功能。在肾透明细胞癌细胞系ACHN和SN12-PM6中mir-21能够抑制PTENP1的抑癌功能。结论肾透明细胞癌中PTENP1作为竞争性内源RNA（competingendogenousRNA）通过竞争性地结合miR-21来影响miR-21对抑癌基因PTEN的表达可能是PTENP1在肾透明细胞癌中发挥抑癌功能的分子机制。【关键词】肾透明细胞癌；PTENP1；分子机制；PTEN；Micro-21；竞争性内源RNA61 华中科技大学博士学位论文PartⅢThemolecularmechanismofthebiologicalfunctionoflncRNAPTENP1inrenalclearcellcarcinomaAbstractObjectiveToexplorestudythemolecularmechanismofthebiologicalfunctionoflncRNAPTENP1inhumanrenalclearcellcarcinoma(RCCC).MethodsExpressionsofPTENP1andPTENwereexaminedbyquantitativereversetranscriptasePCR(qRT-PCR)inRCCCtissuesandthecorrelationofthemwasanalyzed.TheexpressionofPTENwasexaminedbyWesternblotinRCCCcelllinesACHNandSN12-PM6withtheoverexpressionofPTENP1.LuciferasereporterassaywasperformedtoconfirmthetargetingofmiR-21toPTENP1andPTEN.ThebiologicalfunctionassaysofPTNEandmiR-21wereperformedinvitroandvivo.TheeffectofPTNEandmiR-21onthefunctionofPTENP1inRCCCwasperformed.ResultsPTENP1andPTENweredownregulatedinRCCCtissuesandthiswasadirectcorrelationbetweenPTENP1andPTENexpressions.OverexpressionofPTENP1inRCCCcelllinesACHNandSN12-PM6couldimprovetheexpressionofPTENprotein.PTENpresentedtumoursuppressorfunctioninRCCC.Mir-21wasupregulatedinRCCCandtargetingbothPTENP1andPTEN.Mir-21presentedtumourpromotingfunctioninRCCC.Mir-21couldsuppressthetumoursuppressorfunctionofPTENP1inRCCCinvitroandinvivo.ConclusionLncRNAPTENP1functionsasPTENcompetingendogenousRNA(ceRNA)withthedependencyofmiR-21tosuppressclearcellrenalcellcarcinomaprogression.【Keywords】Renalclearcellcarcinoma,PTENP1,Molecularmechanism,PTEN,Micro-21,CompetingendogenousRNA62 华中科技大学博士学位论文前言我们的前期研究证明lncRNAPTENP1在肾透明细胞癌中低表达，而且能够抑制肾透明细胞癌细胞增殖及肿瘤生长，能够抑制肾透明细胞癌的迁徙和肿瘤转移，PTENP1在肾透明细胞癌中是抑癌基因。在功能研究的基础上，我们进一步思考其作用机制。转录于9p13.3的长链非编码RNAPTENP1作为PTEN的假基因与PTEN有高度同源性，在PTENP1的3’的非编码区（3’UTR）存在与PTEN3’UTR高度同源(～95%)的区域[1]。同时研究表明在肝癌、乳腺癌、前列腺癌等细胞系中靶向PTEN的MicroRNA如miR-17,miR-21,miR-214,miR-19和miR-26等也可以靶向PTENP1，PTENP1能够通过竞争靶向PTEN的MicroRNA而调节PTEN的表达水平从而在癌症的发生发展中发挥作用[2]。PTENP1在肾透明细胞癌中是否存在同样或类似的作用机制？带着这样的疑问，我们进行了PTENP1在肾透明细胞癌中作用机制研究。材料与方法1、组织样本：肾透明细胞癌及其相应癌旁组织均来取自2011年5月至11月于华中科技大学同济医学院附属同济医院泌尿外科进行手术治疗的肾癌患者，经术后病理证实为肾透明细胞癌。组织的收取均得到同意并严格规范按进行。2、主要实验试剂：DEPC(美国Sigma公司)TRIzol(美国Invitrogen公司)5-Aza(美国Sigma公司)RNaseyMiniKit(美国Qiagen公司)FermentasRTreagentKit(美国Fermentas公司)SYBRPremixExTaq(日本Takara公司)E.Z.N.A.BacterialDNAKit(美国Omega公司)63 华中科技大学博士学位论文pPACKH1™LentivectorPackagingKit(美国SystemBiosciences公司)Dulbecco’smodifiedEagle’smedium（DMEM）培养基(美国GIBCO公司)胎牛血清（FBS）(美国Invitrogen公司)胰蛋白酶（Trypsin）(美国GIBCO公司)Micro-21mimics(广州锐博生物)Micro-21inhibitor(广州锐博生物)Micro-21qRT-PCRPrimerSet(广州锐博生物)U6qRT-PCRPrimerSet(广州锐博生物)X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent(瑞士Roche公司)3、实验器材：超净工作台（美国Thermo公司）生物安全柜(美国HealForce公司)台式低温离心机（美国BD公司）恒温水浴箱（南京先欧公司）低温冰箱（青岛Haier公司）恒温二氧化碳培养箱（美国Thermo公司）IX71倒置荧光显微镜（日本奥林巴斯公司）NanoDropND-1000MX3000P定量PCR仪（美国Thermo公司）VeritiPCR仪（美国Thermo公司）DYY-6D型电泳仪(北京六一仪器厂)Syngene化学发光成像系统(英国Syngene公司)4、细胞系及培养：透明细胞癌细胞系ACHN、786-O、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6及人肾近端小管上皮细胞系HK-2(购自CTTCC)。细胞系常规培养于含10%FBS的DMEM培养液64 华中科技大学博士学位论文中，37℃、5%CO2培养箱培养，根据细胞生长情况,每2-3天传代培养。5、主要实验方法：5.1组织样本的收集组织在离体20分钟内收集。在有经验临床医师指导下辨认肿瘤组织，切下肿瘤组织及正常癌旁组织后迅速用PBS溶液冲洗，将样本剪切成约0.4*0.4*1.0cm的块状装入预先标记好的冻存管中并迅速置入液氮罐中。同时均留取部分组织中性福尔马林固定送病理分析。收集的组织样本置于-80℃低温冰箱保存。采集完整的临床和随访资料。5.2组织总RNA的提取（17）取约50mg冰冻组织置入预处理的研钵中，加入液氮，在存在液氮下迅速研磨组织至粉末状加入1mlTrizol试剂对组织进行裂解；（18）将上述组织Trizol裂解液转入无RNasefreeEP管中，室温下裂解5分钟；（19）在上述EP管中，加入0.2ml氯仿，盖上EP管盖子，手动用力震荡15秒，室温下放置3分钟，12000g，4℃，离心15分钟；（20）小心转移上层水相至新RNasefreeEP管中，加入0.5ml异丙醇，轻轻混匀，室温下放置10分钟，12000g，4℃，离心10分钟；（21）弃上清，加入1ml75%乙醇轻轻洗涤沉淀，7500g，4℃，离心5分钟，弃上清；（22）室温放置约10分钟挥发多余乙醇，避免完全干燥，加入80ulRNasefree水溶解RNA；（23）55°C水浴锅中变性10分钟，-80℃保存。（24）用NanoDropND-1000检测RNA在260、280及230nm处的吸光度，并分析A260/A280的比值，同时检测RNA的浓度；（25）使用常规甲醛变性琼脂糖凝胶电泳检测RNA纯度和完整性。65 华中科技大学博士学位论文5.3RNA逆转录反应根据FermentasRTreagentKit试剂盒操作规程进行。反应体系如下TemplateRNA10mMdNTPmixOligo(dT)primerRNase-freewater总体积xµl(upto1µg)1µl1µlxµl10μl加样在冰上进行，逆转录反应设置为引物延伸25℃，10分钟；cNDA合成40℃，30分钟；终止反应85℃，5分钟；降至4℃保存。5.4Q-PCR检测反应MX3000P上使用SYBRPremixExTaq试剂进行qPCR反应。qPCR反应设置为预变性95℃，10分钟；PCR反应为95℃5秒，61℃30秒，72℃30秒进行40个循环，最后72℃作用5分钟，设备自动进行溶解曲线分析。PCR反应以GAPDH作为内参。反应体系及PCR反应引物如下：SYBRPremixExTaq(2x)ForwardPrimer(10mM)ReversePrimer(10mM)cDNA12.5μl1μl1μl2μlDouble-distilledwater总体积8.5μl25μl名称上游引物下游引物GAPDHPTENP1PTENtgggtgtgaaccatgagaagtcagaacatggcatacaccaagtttaccggcatcaaatgtgtcgctgttgaagtcagatgatgacgtccgatttttcacccccactttagtgcagt66 华中科技大学博士学位论文5.5Micro-RNA的检测（1）逆转录反应（RT）：MiR-21及内参引物购自广州锐博生物有限公司。引物使用前瞬时离心，每nmol引物加入200μl灭菌双蒸水配制成5μM引物储存液，-20℃保存。取5μMRT引物工作液5μl，加入45μlRNase-free水，配置成500nMRT引物工作液。按下述体系配制RT反应工作液：RNAxμl(1μg)1μl5μMRT引物工作液加RNase-free水至5.5μl以上体系混匀后，瞬时离心，70℃放置10min，冰育2min，再加入以下试剂进行RT反应，RT反应程序：42℃60min，70℃10min：RTbuffer5X10mMdNTPmix2.5µl0.5µl0.5µl0.25µl12.5μlRNaseinhibitor(20U/mL)RT酶(200U/mL)加RNase-free水至RT反应结束后请立即将cDNA产物取出，快速置冰上冷却，-20℃保存。（2）qPCR反应：反应体系如下SYBRPremixExTaq(2x)ForwardPrimer(5μM)ReversePrimer(5μM)RTproduct9μl1μl1μl2μl加RNase-free水至20μlqPCR反应设置如下，qPCR的检测反应结束后立即进行融解曲线分析，检测温度为70℃~95℃，升温速率为0.4℃/次，恒温时间为1秒/次。67 华中科技大学博士学位论文循环步骤预变性变性温度95℃95℃60℃70℃持续时间20秒1X10秒40X退火20秒延伸5秒5.6Micro-RNAmimics和inhibitor的转染：（1）mimics和inhibitor瞬时离心，均每nmol引物加入50μl灭菌双蒸水配制成20μM储存液，-20℃保存。（2）转染前夜准备细胞，接种细胞数为使转染时细胞密度为50%-70%。（3）以六孔板1孔为例，转染体系为无血清OPTI-DMEM培养基50μl加入20μMmimics或inhibitor储存液8μl轻轻混匀，无血清OPTI-DMEM培养基50μl加入转染试剂X-tremeGENEsiRNATransfectionReagent8μl，轻轻混匀，两者均室温放置5分钟后两者混匀，室温放置15分钟后加入培养基中，继续培养细胞。（4）6-8小时后换液，转染12-24小时后可以进行功能实验。5.7大肠杆菌的培养扩增大肠杆菌培养基配置如下：氯化钠胰蛋白胨酵母提取物加水至10g10g5g1L培养基高压蒸汽灭菌，降温后分装至玻璃试管中，每20ml培养基加入适量菌液及20μl0.1g/ml的氨苄青霉素，塞上试管口塞子好后置恒温摇床37℃，220rpm，扩增14小时后提取质粒。68 华中科技大学博士学位论文5.8质粒的提取（16）大肠杆菌扩增后，5000g离心10分钟，去上清，加入500μlSolutionⅠ，充分混匀，转入2mlEP中；（17）加入加入500μlSolutionⅡ，轻轻颠倒混匀，室温放置5分钟；（18）加入加入500μl预冷的BufferN3，轻轻颠倒混匀，出现絮状沉淀；（19）4℃，12000g离心3分钟，转移上清至新1.5mlEP中；（20）加入0.1倍体积的ERTSolution，轻轻颠倒7-10次混匀；（21）冰浴10分钟，期间颠倒混匀数次；（22）42℃水浴孵育5分钟；（23）室温12000g离心3分钟，转移上清至新2mlEP中；（24）加入0.5倍体积的无水乙醇；（25）将700μl上述溶液加入套好2ml收集管的离心柱中，室温10000g离心1分钟，丢去废液；（26）重复上述步骤至全部溶液经过离心柱；（27）加入500μlBufferHB，室温10000g离心1分钟，丢去废液；（28）加入700μl已加入乙醇的DNAwashBuffer，室温10000g离心1分钟，丢去废液，重复一次；（29）≥13000g离心3分钟，干燥离心柱；（30）加入100μlTE，室温放置2分钟，室温10000g离心1分钟，洗脱质粒，必要时重复一次；（31）用NanoDropND-1000检测DNA在260、280处的吸光度，同时检测DNA的浓度。5.9慢病毒的包装：慢病毒包装试剂盒pPACKH1™LentivectorPackagingKit包含所需293TN细胞系；包装质粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV及pVSV-G；阳性对照质粒pSIH1-H1-siLuc-copGFP；表达载体pCDHlentivector，需表达基因构建至pCDH69 华中科技大学博士学位论文lentivector（由武汉转导生物完成）；具体包装步骤如下：（9）提前18-24小时传代293TN细胞至10cm细胞培养板中，使细胞密度约为60%-70%；（10）在EP管中加入1ml无血清DMEM培养基，加入包装质粒pPACKH1-GAG，pPACKH1-REV及pVSV-G各3.75μg，及表达载体2.25μg；（11）加入27.5µlPureFection，漩涡混匀10秒钟，室温孵育15分钟；（12）加入上述混合物至含10ml培养基的10cm细胞培养板中继续培养293TN细胞，转染12小时后换液一次；（13）转染后48及72小时分别收集培养细胞上清，室温3000g离心3分钟，转移上清至新离心管中，加入1/4体积的4℃PEG-itVirusPrecipitationSolution，放置沉淀过夜；（14）4℃，1500g离心30分钟，转移上清至新离心管中备用，继续1500g离心分钟；（15）加入1/20原溶液体积的PBS溶解沉淀；（16）-80℃低温冰箱保存备用。5.10慢病毒的感染：在传代有目标细胞的96孔板中加入适量慢病毒，作浓度梯度，加入1/1000体积的感染增强剂Polybrene，感染8小时后换液一次，后常规换液及传代，第3-4天荧光显微镜观察感染情况，确定合适感染浓度，并提取RNA和/或蛋白质作验证。5.12细胞蛋白质提取：（1）常规胰酶消化收集细胞，PBS洗涤两次；（2）加入适量MP-40裂解液和1%体积的PMSF蛋白酶抑制剂；（3）冰上裂解15分钟，期间间断吹打；（4）4℃，12,000g，离心10分钟，取上清液-80℃保存备用。5.13蛋白质浓度测定：70 华中科技大学博士学位论文（1）用BCA蛋白浓度测定试剂测定，50体积的试剂A加入1体积的试剂B配制适量BCA工作液；（2）用小牛白蛋白配制浓度为0.5mg/mL的标准蛋白；（3）将标准蛋白按体积梯度0,1,2,4,8,12,16,20μl分别加入到96孔板中，每孔补充适量双蒸水至20μl；（4）加入待测蛋白10μl至其他孔中，加入10μl双蒸水至20μl；（5）每孔加入BCA工作液200μl，37℃避光孵育30分钟；（6）用酶标仪测定各孔560nm处的吸光度，根据梯度稀释的标准蛋白绘制标准曲线，计算所测样品的蛋白浓度。5.14Westernblot检测：（1）电泳所用凝胶及缓冲液配制如下：成分5%浓缩胶4.1ml1.0ml7.5μlN10%分离胶4ml去离子水30%Acr-BispH6.81MTrispH8.81MTris10%SDS5.0mlN7.5μl150ul150ul6ul60μl10%AP60μlTEMED6μl成分Tris5×电泳缓冲液7.57g5×转膜缓冲液14.52g甘氨酸SDS46.92g7.32g2.5g0.94g双蒸水500ml400ml1×转膜缓冲液临用前取80ml，加DDW320ml,甲醇100ml，混匀即可。71 华中科技大学博士学位论文（2）取蛋白样品加入1/4体积的5×Loadingbuffer水浴煮沸5分钟变性，用加样枪加marker及30μg样品于凝胶上孔中。（3）恒压65V，待溴酚蓝迁移至分离胶和浓缩胶交界处时换电压到110V，溴酚蓝至分离胶底部终止电泳。（4）根据所需裁剪所需的六层滤纸和PVDF膜，转膜缓冲液中将滤纸和膜浸湿后，从负极到正极依次安放海绵、三层滤纸、凝胶、PVDF膜、三层滤纸、海绵，200mA恒流转膜2小时。（5）PVDF膜放入脱脂牛奶中，37℃封闭30min。将PVDF膜放入用PE手套自制的口袋中，加入1：1000稀释一抗，封口，4℃过夜。（6）将PVDF膜用1×TBST洗涤三次，每次10min，用二抗稀释液室温孵育1h。（7）将PVDF膜用1×TBST洗三次，每次10min，用Syngene化学发光成像系统成像并记录分析。5.15细胞增殖实验：（4）各实验组细胞分别接种于96孔板，每孔1000细胞，各组每次6个副孔，进行相关处理；（5）在检测时间点，更换培养基，每孔加入10µLCCK-8孵育1-3小时；（6）在酶标仪上于450nm测量每孔吸光度值，减去空白对照后计算增殖情况。5.16细胞迁移及侵袭实验：（6）使用适用于24孔板Transwell小室，按说明书要求预处理Transwell小室，迁移实验至含培养基24孔板放置培养箱30分钟，侵袭实验Transwell小室上室包被基质胶；（7）收集各组细胞，PBS洗涤两次，精确计数后用200µL无血清DMEM培养基重悬各组细胞，ACHN细胞数目为1×105，SN12PM6细胞数目为5×104；72 华中科技大学博士学位论文（8）上述细胞悬液加入Transwell小室上室，置入每孔有600µL含10%FBS的DMEM培养基中，每组设置3个副孔，共培养12-18小时；（9）用棉签轻轻擦去上室内未迁移或侵袭的细胞，入细胞染色液，染色20min，流水中轻轻漂洗干净，风干；（10）倒置显微镜观察，拍照记录，细胞计数并分析。5.17裸鼠肿瘤异体移植实验：（4）构建稳定表达PTENP1及感染空载慢病毒的ACHM细胞系；（5）两组裸鼠，每组六只，每只裸鼠使用细胞数目为5×106，统一无血清培养基重悬细胞，左侧腋下皮下注射，每三天测量、统计一次肿瘤大小，荷41天后处死裸鼠，取出肿瘤并测量；（6）处死前利用活体成像技术检测、分析肿瘤转移情况，并运用相关技术进行定量分析。6、统计学方法数据使用SPSSl6.0统计软件包进行统计分析。实验进行三次重复。两组间比较根据数据类型使用t检验或卡方检验，相关分析采用Pearson相关性检验。p<0.05被视为具有统计学意义。结果1、PTEN在肾透明细胞癌中的表达水平与PTENP1的表达水平呈正相关运用qRT-PCR检测原发肾透明细胞癌组织中相PTEN及PTENP1相对相应癌旁组织的表达水平。检测结果证实，在肾透明细胞癌组织中PTEN及PTENP1均呈低表达，并且两者的表达水平呈正相关(图1)。上述结果表明PTEN及PTENP1在肾透明细胞癌中可能存在有意义的相关作用。73 华中科技大学博士学位论文图1肾透明细胞癌原发肿瘤组织中PTEN及PTENP1相对癌旁组织的表达水平。图中可以看出PTEN及PTENP1均在大多数癌组织中低表达，两者现对表达水平呈正相关（P<0.01）。2、肾透明细胞癌细胞系中过表达PTENP1能增加PTEN的表达水平前期研究发现在PTENP1在肾透明细胞癌细胞系中ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6呈低表达。通过慢病毒感染在细胞系ACHN及SN12-PM6中稳定表达PTENP1，然后检测PTEN的表达水平的改变。Westernblot检测结果表明，在细胞系中过表达PTENP1能够在蛋白质水平提高PTEN的表达水平（图2）。上述结果提示，在肾透明细胞癌PTENP1能够影响PTEN的表达，PTENP1可能通过影响PTEN的表达发挥抑癌作用。74 华中科技大学博士学位论文图2在细胞系ACHN及SN12-PM6中过表达PTENP1可以增加PTEN的表达水平。3、Micro-21在肾透明细胞癌中高表达并能同时靶向PTENP1及PTEN通过特异性PCR检测miR-21在肾透明细胞癌中的表达水平。检测结果发现miR-21在12例肾透明细胞癌组织相对相应癌旁组织均呈现出有统计学意义的高表达（图3）同时相对对照HK-2细胞系，miR-21在四种细胞系中ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6高表达，差异具有显著的统计学意义（图3）。我们构建了包含野生型及突变型PTENP1及PTEN的3’非编码区（3’UTR）的荧光素酶报告系统。在系统中过表达miR-21能够降低含PTENP1及PTEN野生型3’UTR载体的荧光素酶的表达而对含PTENP1及PTEN突变型3’UTR的载体无影响；而在系统中用Inhibitor降低miR-21的表达水平能够增加含PTENP1及PTEN野生型3’UTR载体的荧光素酶的表达而对含PTENP1及PTEN突变型3’UTR的载体无影响（图4、图5）。上述结果表明miR-21能够同时靶向PTENP1及PTEN。有意思的是在含PTEN的3’UTR的荧光素酶报告系统中过表达PTENP1能够抑制miR-21对PTEN的3’UTR的影响（图4）。这说明了在肾透明细胞癌PTENP1与PTEN存在相互作用，作用的桥梁是miR-21。75 华中科技大学博士学位论文图3MiR-21在肾透明细胞癌原发肿瘤组织中主要呈高表达（11/12例），四种细胞系ACHN、OS-RC-2、CaKi-1、SN12-PM6中低表达（**P<0.05）。T代表原发肿瘤，N代表相应癌旁组织，HK-2为正常人肾近端小管上皮细胞。76 华中科技大学博士学位论文图4PTEN的3’非编码区（3’UTR）的荧光素酶报告系统检测结果。图中可以看出miR-21能够降低含PTEN野生型3’UTR载体的荧光素酶的表达而对含突变型3’UTR的载体无影响，说明miR-21能特异性靶向PTEN。图5PTENP1的3’非编码区（3’UTR）的荧光素酶报告系统检测结果。图中可以看出miR-21能够降低含PTENP1野生型3’UTR载体的荧光素酶的表达而对含突变型3’UTR的载体无影响，说明miR-21能特异性靶向PTENP1。4、肾透明细胞癌中PTEN在具有抑癌作用,miR-21具有促癌作用在细胞系ACHN及SN12-PM6中通过慢病毒稳定表达PTEN，通过miR-21minics过表达miR-21，进行体外功能实验。实验证实过表达PTEN能抑制ACHN及SN12-PM6的增殖、迁移及侵袭；相反，过表达miR-21能促进肿瘤细胞的增殖、迁移及侵袭（图6、图7）。用ACHN在裸鼠上进行异体移植试验中证实PTEN能够抑制肿瘤的生长及转移，而miR-21能够促进肿瘤的生长及转移，与体外研究结果一致（图8）。结果表明在肾透明细胞癌中PTEN在具有抑癌作用,miR-21具有促癌作用。77 华中科技大学博士学位论文图6过表达miR-21能够促进肾癌细胞系ACHN和SN12-PM6的增殖（P<0.05）。过表达PTEN能够抑制肾癌细胞系ACHN和SN12-PM6的增殖（P<0.05）。78 华中科技大学博士学位论文图7过表达miR-21能够促进肾癌细胞系ACHN和SN12-PM6的迁移及侵袭（P<0.05）。过表达PTEN能够抑制肾癌细胞系ACHN和SN12-PM6的迁移及侵袭（P<0.05）。79 华中科技大学博士学位论文图8ACHN裸鼠异体移植试验。图8A表明PTEN能够抑制肿瘤的生长，而miR-21能够促进肿瘤的生长；图8A表明PTEN能够抑制肿瘤的转移，而miR-21能够促进肿瘤的转移。5、肾透明细胞癌中PTENP1作为竞争性内源RNA发挥作用总结上述研究结果，在肾透明细胞癌中PTENP1的功能作用及其与PTEN及miR-21的相互作用关系符合近年来提出的竞争性内源RNA（competingendogenousRNA，ceRNA）的作用机制，则通过共同的miRNA反应元件（micro-RNAresponse80 华中科技大学博士学位论文elements，MRE)，进行RNA-RNA相互调控。通过miR-21，PTENP1在肾透明细胞癌中共表达进行功能实验的结果也支持这一理论（图9、图11）。总结整个实验，我们认为PTENP1作为ceRNA通过miR-21调控PTEN的mRNA水平从而调控PTEN的蛋白质表达水平而发挥抑癌作用是其在肾透明细胞癌中的作用机制（图12）。图9体内及体外研究表明肾癌细胞系ACHN和SN12-PM6，PTENP1及PTEN能够抑制细胞的增殖，miR-21能够促进细胞的增殖；而在过表达PTENP1的细胞中过表达miR-21能够减低PTENP1对细胞增殖的抑制作用。81 华中科技大学博士学位论文图10体内及体外研究表明肾癌细胞系ACHN和SN12-PM6，PTENP1及PTEN能够抑制细胞的迁移及侵袭，miR-21能够促进细胞的迁移及侵袭；而在过表达PTENP1的细胞中过表达miR-21能够减低PTENP1对细胞迁移及侵袭的抑制作用。82 华中科技大学博士学位论文图11PTENP1在肾癌中功能及作用机制简要模式。PTENP1由于DNA甲基化而低表，通过ceRNA调控机制与PTEN竞争miR-21而调控PTEN的表达进而发挥抑癌功能。讨论我们在证实PTENP1在肾透明细胞癌中具有抑癌功能的研究基础上探索了PTENP1在肾透明细胞癌中的作用机制。生物分子的作用机制研究对医学及分子生物学的发展具有极其重要的意义[3,4]。对功能分子作用机制的研究，阐明其涉及的通路，明确通路中相关分子的位置及地位，不仅能够更好地解释生物现象，而且可以针对重要靶点设计相关药物，增强或阻断相关通路，从而产生相关影响，达到改变生物学过程的目的[5]。这对疾病的药物治疗进展具有重要的意义，可使药物的开发从先筛选、疗效研究再进行机制研究的过程改进为根据相关研究机制，针对关键靶点设计、筛选药物在进行疗效研究，这不仅可以大大减少药物开发的工作量，而且相关的药物往往更有效并具有更少的不良反应发生率[6,7]。肾癌的靶向治疗进展就很好地阐释了这一83 华中科技大学博士学位论文过程。VHL突变、PI3-K/Akt/mTOR通路异常激活及局部微环境的改变导致的缺氧诱导因子α（HIFα）异常堆积，基因染色体重构等，引起以血管内皮生长因子(vascularendothelialgrowthfactor,VEGF)为主的一系列生长因子的异常表达是肾透明细胞癌的发生发展中的重要分子机制[8,9]。研究人员针对血管生成相关机制，转化开发出相应的靶向治疗药物，如血管内皮生长因子配体结合抗体贝伐珠单抗（bevacizumab）；血管内皮生长因子络氨酸激酶拮抗剂(tyrosinekinaseinhibitors，TKIs)索拉菲尼（sorafenib）、舒尼替尼（sunitinib）、帕唑帕尼（pazopanib）、阿西替尼（axitinib）；哺乳动物雷帕霉素靶蛋白(mammaliantargetofrapamycin，mTOR)抑制剂替西罗莫司（temsirolimus）、依维莫司（everolimus）等[10,11]者的无疾病进展生存期(progression-freesurvival，PFS)，是进展期肾癌治疗的重要进展[10,11]。这些药物能够有效延长进展期患。进一步研究肾癌发生、发展中相关分子的作用机制，不仅能更深入地阐析肾癌，也可能寻找到更有效的治疗靶点。LncRNA在生物分子事件中的重要作用已经得到证实，其在肿瘤发生、发展中的作用也毋庸置疑[12,13]。同样，要进一步研究对肾癌的发生、发展有关键作用的分子事件及机制也离不开对lncRNA的研究。现有研究表明lncRNA能够通过多种方式，经不同机制发挥作用[14]。本研究探索了lncRNAPTENP1在肾透明细胞癌中的作用机制。研究发现在肾透明细胞癌中PTENP1能够被同时靶向抑癌基因PTEN的miR-21靶向作用，PTENP1通过miR-21与PTEN相互作用，影响PTEN蛋白的表达而发挥作用。PTEN是经典的抑癌基因，在多种癌症中表达缺失，其能够编码一种磷酸酶，能够通过负向调节PI3-K/Akt/mTOR信号通路而发挥抑癌作用[15,16]。实际上在肾癌中PTEN已多有研究，已经证实是一个重要的抑癌基因[17,18]。同时研究也证实，miR-21在肾癌中具有促癌功能，其靶点包括多种不同的基因[19-21]。这与PTENP1在其他肿瘤细胞中的作用机制相符[2]。这种近年来发现的作用方式被称为竞争性内源RNA（ceRNA）调控机制，即RNA与RNA可以借助通过竞争共同的miRNA反应元件相互“对话”从而相互调控[22]。MiRNA是长约22nt的小分子非编码RNA，能够通过种子序列与多种转录本不完全互补配对结合并形成沉默复合体(silencingcomplex，RISC)而抑制目的RNA的翻译或降解目的RNA，从而负性调节目的基因的表达[23,24]。通过miRNA84 华中科技大学博士学位论文进行相互调控的RNA，可以是编码蛋白的mRNA也可以是不能编码蛋白的lncRNA，而miRNA能与多种不同的转录体结合，而每个转录体也能与多个不同的miRNA结合，这样大量的RNA通过大量的miRNA进行相互调控，从而构成庞大的ceRNA网络[25-27]。ceRNA作用使得mRNA不仅蛋白编码功能，还具备反式调节其他mRNA的作用，同时lncRNA也参与了这种RNA之间的作用，这在转录组学水平赋予了mRNAs、lncRNA新的生物学功能，扩大了基因组中的功能性遗传信息，是近年来的分子生物学上的一个重要进展[28]。大量的研究已经证实了这一发现，同时研究发现在肿瘤的分子机制中，ceRNA作用具有重要的意义，如在结肠癌细胞系中，KRAS和ZEB2均可通过ceRNA方式与PTEN相互作用；在胶质母细胞瘤及前列腺癌中，VAPA和CNOT6L均可通过ceRNA方式与PTEN相互作用；在黑色素瘤中，CNOT6L可通过ceRNA方式与PTEN相互作用[29,30]。同时研究人员通过生物信息学方法，提出了cerRNA网络的分析和预测数据库，为ceRNA的研究提供了有力的工具，将极大地促进其发展[31,32]。相关的另外研究表明，PTENP1在肿瘤中还存在其他的调控机制，同时由于理论上ceRNA网络的存在，PTENP1在肾透明细胞癌中是否存在其他的作用靶点及作用机制均需要进一步的研究[33]。实际上我们也实验了部分其他靶向PTEN的miRNAs如miR-214、miR-19b等在肾透明细胞癌中对PTENP1表达的影响，但是我们没有观察到明显的效应，这可能需要进一步的研究分析。总之，我们通过一系列的研究，证明了lncRNAPTENP1在肾透明细胞癌中具有抑癌功能，PTENP1作为ceRNA调控PTEN的表达至少是其作用机制之一。LncRNA在肾癌中的研究才刚刚开始，我们期待随着研究的不断深入，能够发现更多的关键分子事件，发现新的关键靶点，提高对肾癌的认识，推进肾癌诊断及治疗的发展。85 华中科技大学博士学位论文参考文献：[1]FujiiGH,MorimotoAM,BersonAE,etal.TranscriptionalanalysisofthePTEN/MMAC1pseudogene,psiPTEN[J].Oncogene,1999,18(9):1765-1769.[2]PolisenoL,SalmenaL,ZhangJ,etal.Acoding-independentfunctionofgeneandpseudogenemRNAsregulatestumourbiology[J].Nature,2010,465(7301):1033-1038.[3]PortelaA,EstellerM.Epigeneticmodificationsandhumandisease[J].NatBiotechnol,2010,28(10):1057-1068.[4]VidalM,CusickME,BarabasiAL.Interactomenetworksandhumandisease[J].Cell,2011,144(6):986-998.[5]CartwrightBR,GoodmanJM.Seipin:fromhumandiseasetomolecularmechanism[J].JLipidRes,2012,53(6):1042-1055.[6]McGonagleD,DeBariC,ArnoldP,etal.Lessonsfrommusculoskeletalstemcellresearch:thekeytosuccessfulregenerativemedicinedevelopment[J].ArthritisRheum,2007,56(3):714-721.[7]SaijoN.[Moleculartargettherapyincancer][J].NihonRinsho,2010,68(10):1779-1786.[8]SchramlP,StruckmannK,HatzF,etal.VHLmutationsandtheircorrelationwithtumourcellproliferation,microvesseldensity,andpatientprognosisinclearcellrenalcellcarcinoma[J].JPathol,2002,196(2):186-193.[9]OosterwijkE,RathmellWK,JunkerK,etal.Basicresearchinkidneycancer[J].EurUrol,2011,60(4):622-633.[10]EscudierB,AlbigesL,SonpavdeG.Optimalmanagementofmetastaticrenalcellcarcinoma:currentstatus[J].Drugs,2013,73(5):427-438.[11]JonesR,DeSantisM.Accesstotargetedtherapiesinrenalcellcancer[J].SeminOncol,2013,40(4):521-528.[12]MattickJS.LongnoncodingRNAsincellanddevelopmentalbiology[J].SeminCellDevBiol,2011,22(4):327.[13]TangJY,LeeJC,ChangYT,etal.LongnoncodingRNAs-relateddiseases,cancers,anddrugs[J].ScientificWorldJournal,2013,2013:943539.86 华中科技大学博士学位论文[14]GuttmanM,RinnJL.Modularregulatoryprinciplesoflargenon-codingRNAs[J].Nature,2012,482(7385):339-346.[15]SongMS,SalmenaL,PandolfiPP.ThefunctionsandregulationofthePTENtumoursuppressor[J].NatRevMolCellBiol,2012,13(5):283-296.[16]Ortega-MolinaA,SerranoM.PTENincancer,metabolism,andaging[J].TrendsEndocrinolMetab,2013,24(4):184-189.[17]HagerM,HaufeH,KemmerlingR,etal.PTENexpressioninrenalcellcarcinomaandoncocytomaandprognosis[J].Pathology,2007,39(5):482-485.[18]CamposEC,FonsecaFP,ZequSD,etal.AnalysisofPTENgenebyfluorescentinsituhybridizationinrenalcellcarcinoma[J].RevColBrasCir,2013,40(6):471-475.[19]FaragallaH,YoussefYM,ScorilasA,etal.TheclinicalutilityofmiR-21asadiagnosticandprognosticmarkerforrenalcellcarcinoma[J].JMolDiagn,2012,14(4):385-392.[20]ZhangA,LiuY,ShenY,etal.miR-21modulatescellapoptosisbytargetingmultiplegenesinrenalcellcarcinoma[J].Urology,2011,78(2):413-474.[21]VerghoD,KneitzS,RosenwaldA,etal.CombinationofexpressionlevelsofmiR-21andmiR-126isassociatedwithcancer-specificsurvivalinclear-cellrenalcellcarcinoma[J].BMCCancer,2014,14:25.[22]SalmenaL,PolisenoL,TayY,etal.AceRNAhypothesis:theRosettaStoneofahiddenRNAlanguage?[J].Cell,2011,146(3):353-358.[23]BartelDP.MicroRNAs:targetrecognitionandregulatoryfunctions[J].Cell,2009,136(2):215-233.[24]ShuklaGC,SinghJ,BarikS.MicroRNAs:Processing,Maturation,TargetRecognitionandRegulatoryFunctions[J].MolCellPharmacol,2011,3(3):83-92.[25]BosiaC,PagnaniA,ZecchinaR.ModellingCompetingEndogenousRNANetworks[J].PLoSOne,2013,8(6):e66609.[26]LiuK,YanZ,LiY,etal.Linc2GO:ahumanLincRNAfunctionannotationresourcebasedonceRNAhypothesis[J].Bioinformatics,2013,29(17):2221-2222.[27]SuX,XingJ,WangZ,etal.microRNAsandceRNAs:RNAnetworksinpathogenesis87 华中科技大学博士学位论文ofcancer[J].ChinJCancerRes,2013,25(2):235-239.[28]TayY,RinnJ,PandolfiPP.ThemultilayeredcomplexityofceRNAcrosstalkandcompetition[J].Nature,2014,505(7483):344-352.[29]AlaU,KarrethFA,BosiaC,etal.IntegratedtranscriptionalandcompetitiveendogenousRNAnetworksarecross-regulatedinpermissivemolecularenvironments[J].ProcNatlAcadSciUSA,2013,110(18):7154-7159.[30]TayY,KatsL,SalmenaL,etal.Coding-independentregulationofthetumorsuppressorPTENbycompetingendogenousmRNAs[J].Cell,2011,147(2):344-357.[31]NoorbakhshJ,LangAH,MehtaP.IntrinsicnoiseofmicroRNA-regulatedgenesandtheceRNAhypothesis[J].PLoSOne,2013,8(8):e72676.[32]BosiaC,PagnaniA,ZecchinaR.ModellingCompetingEndogenousRNANetworks[J].PLoSOne,2013,8(6):e66609.[33]JohnssonP,AckleyA,VidarsdottirL,etal.Apseudogenelong-noncoding-RNAnetworkregulatesPTENtranscriptionandtranslationinhumancells[J].NatStructMolBiol,2013,20(4):440-446.88 华中科技大学博士学位论文综述长链非编码RNA在泌尿系肿瘤中的研究进展随着人类人类基因组计划的完成，研究人员发现人类基因组中基因的数量远远少于预期，这说明复杂的生命过程存在大量的复杂调控及修饰[1]。后基因组时代的来临，研究人员加大了对基因相关调控及修饰的研究，关注既往忽视或无法研究的领域。其中非编码RNA的研究是一个重要方面，通过大量的研究得到大量重要发现，是近十余年生命科学研究最重要的进展之一[2]。非编码RNA从其长度出发，简单的分为小分子非编码RNA及长度大于200nt的长链非编码RNA（longnoncodingRNA,lncRNA）[3]。其中lncRNA的类型、功能、作用方式及机制最为复杂，能够通过多种方式及途径参与正常及异常生物学过程各个阶段的分子事件[4,5]。研究表明lncRNA在多种疾病的异常分子调控中发挥重要作用，特别是在肿瘤的发生发展中的作用远远超过人们的预期有望成为肿瘤研究的一个重要突破。现根据文献资料，对lncRNA在常见泌尿系肿瘤肾癌、膀胱癌及前列腺癌中的研究进展作综述。1LncRNA概述长链非编码RNA（longnoncodingRNA,lncRNA）是一类由RNA聚合酶II转录的，长度大于200nt的RNA分子，具有mRNA相似的结构，可有不同的剪接，可形成polyA尾巴及启动子结构[3]。LncRNA不翻译或几乎不翻译蛋白质，可以是前体分子剪接修饰的产物，也可以其他RNA分子的前体。研究表明高达90%以上的人类基因可以有效转录，蛋白质编码基因所占比例不超过2%，而超过4%-9%的基因组序列产生的转录本是lncRNA[3]。因为开始对lncRNA认识还不够深入，故主要按照转录相对编码蛋白基因的位置对lncRNA进行分类，主要有三种方式，根据转录链与附近蛋白编码基因链的关系分为正义（sense）与反义（antisense），根据与最近蛋白编码基因的转录方向关系分为反向（divergent）与趋同（convergent），根据转录定位与蛋白编码基因的关系分为基因内（intronic）与基因间（intergenic）[6]。LncRNA起初89 华中科技大学博士学位论文被认为是基因组转录的“噪音”，是RNA聚合酶II转录的副产物，不具有生物学功能。然而，近年来的研究表明，大多数的lncRNA在正常及异常生物学过程中具有时空表达特异性，参与了几乎所有分子过程。LncRNA广泛参与生物学过程，其功能作用形式很多，可以作为信号（signals）、诱饵（decoys）、向导（guides）及骨架（scaffolds）执行分子功能[4]。LncRNA的功能涉及染色体修饰、转录调控、转录后调控的整个生物过程[6]。2LncRNA与肾癌位于11号染色体的H19是一个重要的印迹基因，在哺乳动物的发育中高度保守，其基因成熟产物是一种lncRNA，表达其上游的差异甲基化区受（differentiallymethylatedregion，DMR）调控[7,8]。Mathias等研究发现在人肾Wilms瘤中H19因DMR双等位基因的超甲基化而表达下调[9]。Andre等进一步研究发现在肾癌H19通过调控miR-675而发挥生长抑制功能，H19表达的缺失会导致细胞异常增殖[10]GrowthArrest-SpecificTranscript5(GAS5)转录产物无蛋白翻译能力，但能够通过介导产生多种小分子RNA而发挥功能，研究表明GAS5在多种肿瘤中具有抑癌功能[11-13]。。苏州大学医学院的Qiao等研究发现在肾癌中lncRNAGrowthArrest-SpecificTranscript5(GAS5)具有抑癌功能[14]。他们检测了12对肾癌及其癌旁组织中GAS5的表达水平，结果表明GAS5在肾癌中明显低表达。研究同时发现在肾癌细胞系A498中GAS5的表达较正常肾近端小管细胞HK-2明显降低。进一步通过细胞功能实验发现在A498中过表达GAS5能够通过诱导凋亡和阻遏细胞周期而抑制肿瘤细胞的增殖，同时GAS5对A498细胞的迁徙及侵袭均匀抑制作用。缺氧诱导因子1α(hypoxiainduciblefactoralpha,HIF1α)在肾癌的发生中具有重要的作用[15]。其编码基因反义RNA5'aHIF-1α及3'aHIF-1α不具备翻译功能，但研究发现5'aHIF-1α及3'aHIF-1α均在肾癌中高表达，虽然它们的功能仍待研究，但它们的表达与肾癌相关，是潜在的肾癌分子诊断标记物[16,17]。Aclusterofimprintedgenesatchromosome染色体11p15.5位点存在一系列与生长障碍有关的印迹基因，能转录多种lncRNA，其中KCNQ1oppositestrand/antisensetranscript1(KCNQ1OT1)是一种与Beckwith-Wiedemann综合症有关的lncRNA，Pandey90 华中科技大学博士学位论文及Chiesa研究发现异常活化的KCNQ1OT1可伴随细胞周期依赖性蛋白激酶(cyclin-dependentkinaseinhibitor1C,CDKN1C，一种细胞生长抑制分子)的下调，可以促进在包括肾癌细胞的多种细胞的增殖，具有癌基因的功能[18,19]。Metastasisassociatedlungadenocarcinomatranscript1(MALAT1)是一种lncRNA，但在肾癌中它是转录因子TFEB的融合伴侣基因[20,21]。TFEB是转录因子家族成员，能够通过多种细胞途径促进发育[22]。在肾癌中异常高表达的MALAT1可以导致TFEB显著高表达而产生促癌作用[20,21]。Delta-like1homolog(DLK1)是转录自印迹区14q32.3的一种lncRNA，Takahiro等研究发现DLK1在高达78%肾癌中表达缺失，而在正常肾组织中均有表达，同时通过细胞功能研究证实DLK1在肾癌中具有抑癌功能[22]。3LncRNA与膀胱癌H19在膀胱癌中也进行了大量深入的研究，但是与肾癌相反，H19在膀胱癌中具有促癌作用。Takai等首先报道在膀胱癌中H19因为基因低甲基化而高表达[23]。Barsyte-Lovejoy等研究发现基因c-MYC能够诱导H19的表达[24]。Luo及其团队研究发现在膀胱癌中H19能通过反式阻遏细胞间黏附蛋白E-钙粘蛋白及WNT信号通路抑制物nakedcuticlehomolog1(NKD1)的转录[25]。细胞黏附的减少及WNT信号通路的间接激活促进了癌细胞的上皮细胞-间充质转化(epithelial-mesenchymaltransition，EMT)导致癌细胞转移。进一步研究发现H19能够通过活化inhibitorofDNAbinding2(ID2)，一种具有负性调控分化的DNA结合蛋白抑制体，而促进膀胱癌细胞增殖[26]另外Ariel等曾尝试通过荧光原位杂技的方法在活检组织中检测H19而对膀胱癌的复发作早期诊断，研究发现在84%(47/56例)的癌症活检组织中超过5%的细胞表达H19，并发现肿瘤级别越高表达H19细胞的比例越高，故研究者认为H19在膀胱癌的诊断中可能具有一定价值[27]。也有人在动物实验中尝试利用含能够调节H19表达的序列。的载体进行膀胱癌的分子治疗，研究表明治疗能抑制动物模型中的肿瘤生长[28]Maternallyexpressed3(MEG3)是转录自印迹区14q32.3的一种lncRNA，Zhou等最先报道MEG3能够通过活化抑癌基因P53发挥抑癌功能[29]。。研究发现在膀胱癌及前列腺癌中MEG3表达缺失，从而导致细胞异常增殖，促进癌症的发生和进展[30,31]。91 华中科技大学博士学位论文Ying等发现MALAT1在膀胱癌中异常高表达[32]。与在肾癌中的作用机制不同，MALAT1在膀胱癌中可以促进细胞的增殖及生存，并通过激活WNT信号通路诱导EMT而促进肿瘤转移[32,33]。Han等研究发现在膀胱癌中转录自taurineupregulatedgene1(TUG1)基因的lncRNA在膀胱癌中明显高表达，表达水平与肿瘤级别及分期呈正相关[34]。进一步研究表明干扰TUG1的表达可以抑制膀胱癌细胞的增殖并诱导凋亡，证明TUG1是膀胱癌的癌基因[34]。UCA1是另一种在膀胱癌中高表达的lncRNA，而且UCA1在癌组织中的表达具有较高的特异性，具有潜在的诊断标记价值[35]研究证实在膀胱癌中UCA1可以增强ERK1/2MAPK及PI3-K/AKT激酶的活性，导致转录辅助激活蛋白p300的上调，从而促进细胞增殖、血管形成及细胞侵袭[36,37]。等。同时UCA1可能与膀胱癌的化疗抵抗有关[38]。4LncRNA与前列腺癌Prostatecancerantigen3(PCA3)最早研究发现lncRNA之一，是前列腺癌中最早发现的lncRNA，PCA3在前列腺癌组织及前列腺癌患者尿液中明显高表达，研究发现它比经典前列腺癌诊断标记PSA具有更高的灵敏度及特异性，同时期表达水平与前列腺癌的危险程度、预后的具有一定的相关性，是极有运用潜力的前列腺癌诊断标记[39-42]。在X染色体失活中具有重要作用的XIST基因其功能产物是lncRNA，有研究发现XIST基因启动子的低甲基化水平与前列腺癌的进展相关[43,44]。与在肾癌中类似，研究同样发现GAS5在前列腺癌中也具有抑癌功能，其作用可能与阻遏糖皮质激素受体并抑制孕酮受体与雄激素受体转录有关，并具有一定的治疗运用潜力[45]。PlncRNA-1是转录自carbonylreductase3(CBR3)基因反义链的lncRNA，有研究表明PlncRNA-1自前列腺癌中明显高表达[46]。进一步研究发现，干扰PlncRNA-1的表达能够下调雄激素依赖及雄激素非依赖前列腺癌细胞中的雄激素受体，抑制细胞增殖并诱导凋亡[46]。转录自C-terminalbindingprotein1(CTBP1)基因反义链的CTBP1-AS也是一种在前列腺癌中明显高表达的反义lncRNA。研究表明CTBP1-AS能够通过下调雄激素受体阻遏体C-terminalbindingprotein1(CTBP1)的表达间接增强雄激素相关通路，从而促进激素依赖性及非依赖性前列腺癌细胞的生长[47]。Prostatecancerassociatedtranscript92 华中科技大学博士学位论文1(PCAT1)是一种在转移性前列腺癌组织中显著高表达的lncRNA[48]。研究表明PCAT1能够与染色体重塑相关蛋白polycombrepressorcomplex2(PRC2)形成复合体，结合其组织表达特异性，研究者认为PCAT1与肿瘤进展有关[48]。Prostatecancernon-codingRNA1(PRNCR1)和prostatespecifictranscript1(PCGEM1)均是具有促进转录活性的lncRNA。PRNCR1和PCGEM1均在前列腺癌中高表达，且PRNCR1的表达水平与癌细胞的活力呈正相关[49,50]。Yang等研究发现PRNCR1和PCGEM1能够和雄激素受体相互作用，PRNCR1和PCGEM1能够激活雄激素敏感基因的表达而促进细胞增殖[51]UltraconservedRNAs(ucRNAs)是一系列转录自基因组超保守区的lncRNA，研究表明这些lncRNAs在多种生物学过程中具有重要作用，并可能与肿瘤发生易感性有关[52]。。Hudson等研究发现，在前列腺癌中，部分ucRNAs的表达水平与肿瘤分级及细胞侵略性有关，在前列腺癌中可能具有重要的功能[53]。PTENP1是经典抑癌基因磷酸酶和张力蛋白同源基因（Phosphataseandtensinhomolog，PTEN）的假基因（pseudogene）。转录于9p13.3的长链非编码RNAPTENP1作为PTEN的假基因与PTEN有高度同源性，在PTENP1的3’的非编码区（3’UTR）存在与PTEN3’UTR高度同源(～95%)的区域[54]。有研究表明在PTENP1肝癌、乳腺癌、前列腺癌等细胞系能够通过竞争性内源RNA（competingendogenousRNA，ceRNA）机制，竞争多种共同靶向miR-RNA调控PTEN的表达水平而发挥抑癌功能[54,55]。5展望LncRNA在正常生长发育及疾病发生及发展中的关键作用使其成为正在兴起的全球研究热点。因为恶性肿瘤生物学的特殊性及现实需求，研究人员在癌症进行了大量有关lncRNA的研究，取得了很多重要的发现。泌尿系肿瘤是全身肿瘤的一部分，具有类似的特点及作用机制。LncRNA在泌尿系肿瘤中的研究已经取得了一定进展，发现了一些具有重要功能和具有临床运用潜力的lncRNA。相信随着lncRAN生物学的研究进展，lncRNA在泌尿系肿瘤中研究的推进，泌尿系肿瘤的本质将被揭示并发展出更有效的诊断及治疗方法。93 华中科技大学博士学位论文参考文献：[1]LanderES,LintonLM,BirrenB,etal.Initialsequencingandanalysisofthehumangenome[J].Nature,2001,409(6822):860-921.[2]AkhtarA,FuchsE,MitchisonT,etal.Adecadeofmolecularcellbiology:achievementsandchallenges[J].NatRevMolCellBiol,2011,12(10):669-674.[3]PontingCP,OliverPL,ReikW.EvolutionandfunctionsoflongnoncodingRNAs[J].Cell,2009,136(4):629-641.[4]GuttmanM,RinnJL.Modularregulatoryprinciplesoflargenon-codingRNAs[J].Nature,2012,482(7385):339-346.[5]WangKC,ChangHY.MolecularmechanismsoflongnoncodingRNAs[J].MolCell,2011,43(6):904-914.[6]MercerTR,DingerME,MattickJS.Longnon-codingRNAs:insightsintofunctions[J].NatRevGenet,2009,10(3):155-159.[7]BrannanCI,DeesEC,IngramRS,etal.TheproductoftheH19genemayfunctionasanRNA[J].MolCellBiol,1990,10(1):28-36.[8]TanosV,PrusD,AyeshS,etal.ExpressionoftheimprintedH19oncofetalRNAinepithelialovariancancer[J].EurJObstetGynecolReprodBiol,1999,85(1):7-11.[9]FrevelMA,SowerbySJ,PetersenGB,etal.MethylationsequencinganalysisrefinestheregionofH19epimutationinWilmstumor[J].JBiolChem,1999,274(41):29331-29340.[10]KeniryA,OxleyD,MonnierP,etal.TheH19lincRNAisadevelopmentalreservoirofmiR-675thatsuppressesgrowthandIgf1r[J].NatCellBiol,2012,14(7):659-665.[11]SmithCM,SteitzJA.Classificationofgas5asamulti-small-nucleolar-RNA(snoRNA)hostgeneandamemberofthe5'-terminaloligopyrimidinegenefamilyrevealscommonfeaturesofsnoRNAhostgenes[J].MolCellBiol,1998,18(12):6897-6909.[12]SmedleyD,SidharS,BirdsallS,etal.Characterizationofchromosome1abnormalitiesinmalignantmelanomas[J].GenesChromosomesCancer,2000,28(1):121-125.94 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华中科技大学博士学位论文附录：在读期间已发表的论文LncRNAsExpressionSignaturesofRenalClearCellCarcinomaRevealedbyMicroarray.（PLOSONE，IF=4.092，共同第一作者）Laparoscopicrenalcryoablationversuslaparoscopicpartialnephrectomyforthetreatmentofsmallrenalmasses:asystematicreviewandmeta-analysisofcomparativestudies.（JournalofLaparoendoscopic&AdvancedSurgicalTechniques，IF=1.066，共同第一作者）99 华中科技大学博士学位论文致谢光阴似箭，日月如梭，不自觉中我到武汉求学已经十年了，而在同济医院泌尿外科进行研究生学习也整整过去五年。回首过去，我发现自己是万分幸运的，因为我得到太多人的关心和帮助了！对此，我深怀感激！衷心感谢我尊敬的导师----叶章群教授！您的胸怀、学识、风尚已广为人知！您那谦和的生活态度、严谨的学术风范、精湛的医术和高尚的医德一直是我的榜样，我的目标！您的每个形象我都历历在目、铭记于心！您对我的悉心栽培和谆谆教诲，无论是在工作上还是生活上都让我受益匪浅、永生难忘！感谢您对我的教导，这是我一生中最重要的财富！衷心感谢陈志强教授、徐华教授一直以来对我的悉心栽培和无私爱护，你们的认真热情的工作作风及严谨求实的治学态度一直深深地激励着我！衷心感谢周四维教授、何玮护士长、陈忠教授、余虓教授、郭小林教授、王涛教授、刘征老师、王志华老师、詹鹰老师、陈园老师、谢建良老师、杨帆老师等各位老师对我工作及生活上的悉心指导！衷心感谢夏丁师兄、杨欢师兄、胡嘏师兄、王博涵师兄、曾星师兄、陈科师兄、肖魏师兄、彭鄂军师兄、陈瑞宝师兄的悉心关怀和指导！感谢余淦、李恒、戴劲、胡峻辉、吴柏霖、肖海兵、曹磊、王琪、杨洋、杨涛、石润林、唐昆、周辉、曾谨等兄弟的热情帮助，我在你们身上学到许多优秀的品格！感谢我的室友和同学给予我的帮助！感谢我的父母，是你们养育了我，默默地支持我，你们的付出我无以回报！感谢所有关心我的人！100