sirna表达载体对宫颈癌caski细胞凋亡和增殖的影响

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1、siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响作者:李大可,彭芝兰,周斌兵【摘要】目的:观察HPV16E6siRNA表达载体对宫颈癌Caski细胞凋亡和增殖的影响。方法:利用脂质体将HPV16E6特异性siRNA表达载体转染Caski细胞,通过荧光定量RTPCR检测E6mRNA的变化,流式细胞仪检测E6蛋白和细胞凋亡率的变化,MTT法和细胞克隆法检测细胞增殖的变化。结果:HPV16E6siRNA表达载体可明显抑制Caski细胞E6mRNA和E6蛋白的表达,抑制率分别为89.5%和98.1%;表达载体可明显增加细胞凋亡率,抑制细胞的增殖和克隆的形成

2、。结论:HPV16E6siRNA表达载体可以特异高效地抑制宫颈癌Caski细胞E6基因的表达,增加细胞的凋亡,抑制肿瘤细胞增殖和克隆的形成。【关键词】siRNA表达载体;宫颈癌;细胞增殖;凋亡研究表明,人乳头瘤病毒(HPV)16型E6基因在宫颈癌的发生发展及恶性表型的维持中起着至关重要的作用,因此它已成为宫颈癌基因治疗的理想靶点之一。RNA干扰(RNAi)技术是新近发展起来的一种封闭基因表达的有效方法[12]。已有研究证实,化学合成的小干扰RNA(siRNA)11能有效地抑制目的基因的表达,但作用持续时间短,而siRNA表达载体的方法可能延长作用持续时间[

3、3]。本研究拟通过载体介导的RNAi技术来封闭宫颈癌Caski细胞E6基因的表达,观察HPV16E6siRNA表达载体对Caski细胞增殖的影响。1材料和方法1.1细胞转染Caski细胞为HPV16阳性的宫颈癌细胞株,购自武汉大学典型物培养保藏中心。在研究中用脂质体法将HPV16E6特异性siRNA表达载体E62(由第一作者所在实验室设计构建保存)[4]和空载体P0转染Caski细胞,通过G418(1500μg·ml-1)抗性筛选,至空白对照细胞完全死亡后,降低G418为750μg·ml-1,转染后14d得到抗性克隆细胞,分别命名为CaskiE62、Ca

4、skiP0。收集抗性克隆形成后1周的细胞。1.2荧光定量RTPCR检测HPV16E6mRNA的表达1.2.1细胞总RNA的提取及逆转录操作参照试剂盒[TrizolTMRNAIsolationReagent(GIBCO)和RevertAidTMFirstStrandcDNAsynthesisKit(MBI)]说明书进行。1.2.2荧光定量RTPCR扩增实验设Caski组(空白对照组)、CaskiP0组(空质粒转染组)、CaskiE6112组3组,每项检测重复3次,取平均值。为避免收集细胞和实验过程中RNA的降解、所收集细胞数量的差异以及实验过程中操作带来

5、的误差,计算时用细胞中表达恒定的看家基因GAPDH(3磷酸甘油醛脱氢酶)逆转录扩增产物量的CT值来校正HPV16E6mRNA表达变化。HPV16E6上游引物为5′GAATGTGTGTACTGCAAGCA3′,下游引物为5′CACAGTGGCTTTTGACAGTT3′,TAQman探针为5′CAGCATATGGATTCCCATCTC3′。GAPDH上游引物为5′TGGGTGTGAACCACGAGAA3′,下游引物为5′GGCATGGACTGTGGTCATGA3′,探针为5′CTGCACCACCAACTGCTTAGC3′。其中探针于5

6、′端标记荧光发光基团FAM,3′端标记荧光淬灭基团TAMRA(引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成)。在荧光定量PCR仪上进行PCR,扩增条件如下:94℃1min;94℃10s,55℃30s,72℃1min,45个循环;55℃30s。从PCR动力学曲线读取荧光强度增加到某一特定阈值时的扩增循环数CT值。1.2.3荧光定量RTPCR结果计算11参照文献[5]报道的比较阈值法。从各样品荧光定量PCR动力学曲线中判读其Ct值,用处理组样本基因的Ct值减去处理组参照基因的Ct值,得到ΔCt1,同样,用对照组样本基因的Ct值减去对照组参照基因的Ct值,得到ΔC

7、t2,再用ΔCt1减去ΔCt2,得到ΔΔCt,即ΔΔCt=ΔCt1-ΔCt2。处理组样本基因相对于对照组样本基因的量通过公式:处理组样本基因/对照组样本基因=EX-ΔΔCt。抑制率=(1-EX-ΔΔCt)×100%。1.3流式细胞仪检测HPV16E6蛋白的表达流式细胞仪由四川大学人类疾病生物治疗实验室提供。流式细胞术检测阴性对照组、Caski组、CaskiP0组、CaskiE62组4组细胞中HPV16E6蛋白的表达,每项检测重复3次,取平均值。蛋白抑制率公式:[1-(转染后待测样品的蛋白荧光强度-阴性对照)/(未转染样品的蛋白荧光强度-阴性对照)]×100

8、%。1.4细胞凋亡测定胰酶消化培养好的细胞,得到细胞

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