凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间测定的问题

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凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间测定的问题【摘要】就目前玻片法凝血时间和Duke氏出血时间测定已淘汰，迄今凝血试验中的凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间（APTT)测定已有公认的标准化方案，简要介绍此两种时间测定的方法、标本采集、注意事项、临床意义等。【关键词】凝血酶；时间测定；凝血活酶　　血栓与止血实验室检查的临床重要性与日俱增，检验内容不断扩大，工作量也日益增多，不断出现方法更新和试剂商品化、操作自动化，改变了以往靠手工操作、自配试剂、工作效率低的局面。过去的玻片法凝血时间和Duke氏出血时间测定已淘汰，迄今凝血试验中的凝血酶原时间(PT)和活化部分凝血活酶时间(APTT)测定已有公认的标准化方案［1］，并成为实验室检查的常规项目。　　1玻片法凝血时间和Duke氏出血时间测定已淘汰　　1.1凝血时间凝血时间是检测“内源”凝血系统相关因子缺陷的简易过筛试验。目前国内广泛使用的玻片法很不敏感，国外早在60年代即已淘汰。即使是被认为是较好的试管法，对第Ⅷ、第Ⅸ9 因子缺乏病例的阳性率也不高，而且操作繁琐。某些出血性疾病需要查凝血时间时，现已改用APTT代替［1］。　　1.2出血时间出血时间是一种检测血小板数量、功能和毛细血管功能的过筛试验。目前我国临床常规实验室普遍采用的Duke氏法，甚不敏感。少数出血性疾病，例如血小板减少及功能异常及血管性血友病(vWD)等需要作BT时，应采用出血时间测定器法(改良的Ivy法)；后者要求患者在上臂缚压脉带，充气并维持一定压力，再用特制的刺血刀具(目前这种刀具主要靠进口)，切一标准切口，记录出血时间。操作繁琐、费时，不能列为常规。该法影响因素很多，Crowley等列举的主要因素有:技术操作、切口的方向和部位、皮肤的温度和Hct，特别是后者影响较大［2］。1991年LIND在《BLOOD》杂志上，发表了题为“出血时间不能预测外科出血”的文章［3］。1990年RODGERS和LEVIN也发表了文章，认为出血时间要重新评价［4］。该二文收集了大量评价出血时间临床应用价值的文献资料，认为这种方法(包括出血时间测定器法)对某些出血性疾病，特别是用于手术前预测出血，敏感性和特异性均不强。因此在外科术前不必将出血、凝血时间作为常规［1］。如果少数有出血史或出血体征，需作该项检查时，凝血时间改用APTT，出血时间用正规的出血时间测定器法。下面就简要介绍凝血酶原测定和部分活化凝血活酶测定的方法、原理和注意事项等［1］。9 　　2PT测定　　2.1原理将凝血活酶和钙离子加到枸椽酸钠抗凝血浆中，37℃保温，测定血浆凝固时间(PT)。如果患者凝固时间延长，表示血浆中缺乏(或降低)某一种或几种凝血因子。本法主要用于过筛检测外源凝血途径依赖维生素K的第Ⅱ、第Ⅶ、第Ⅹ因子。另外，第Ⅴ因子和纤维蛋白原缺乏以及存在相关因子的抑制物时，也可出现异常结果。　　2.2血液标本的采集、运送及贮存［1］用一次性塑料采血器或硅化玻璃注射器采静脉血液；采血技术要熟练，不可过多损伤血管及周围组织，致使组织液混入血液中；采血时止血带不可束缚过紧，并不应超过5min；针筒内见到血即应解开止血带，否则某些凝血及纤溶因子会活化，并可使红细胞比积(Hct)升高；血与枸椽酸钠抗凝剂按9∶1混合，轻轻颠倒混匀，防止不洁的试管和不合格橡皮塞的污染。贮血应用清洁塑料管或硅化玻璃管或其他不沾湿的容器，避免接触活化凝血因子；取得血液后应尽快送到血液检验室。在运送中应避免剧烈振动和日光直射；一般要求自采血到测定不得超过4h，不可久贮；如在室温中贮存过久，第Ⅴ因子会破坏;另一方面，在4℃贮存过久，会导致第Ⅶ因子活化。实验室在取得血样后应尽快分离血浆并尽快测定；血液如发现凝固，应弃去不用。9 　　2.3标本制备PT和APTT试验都必须用乏血小板血浆（PPP），分离血浆时要求相对离心力（2000～2500）Xg，离心30min。用浊度法测定终点的自动化凝血仪，溶血和较明显的黄疸及脂血均会影响测定结果。　　2.4造成结果错误的原因［1］　　2.4.1与标本或样品有关的问题血标本收集管注入血液过多或不足；患者红细胞比积>55%时未校正枸椽酸盐液体积；用了非规定的抗凝剂(如EDTA或草酸盐)或未加抗凝剂，或抗凝剂浓度不准确；用了已凝固、溶血、黄疸或脂血样品；血标本混匀不当或剧烈的混匀；采血器或贮血管不洁，已受到污染；污染了肝素。　　2.4.2分析前的问题血标本送验延误或用了不合规定的容器和方法运送、处理或贮存血标本。　　2.4.3与试剂有关的问题试剂己被污染；复溶时水或稀释剂加量不准确；复溶时未用规定的溶液；试剂在运输、贮存过程中由于处理不当而变质；试剂复溶后超过了规定的稳定期或试剂己超过有效期。　　2.4.4分析过程的错误9 如保温时间不准确、温度、加试剂量以及操作步骤不准确等。　　3活化APTT推荐方法　　APTT是检测“内源”途径凝血因子缺陷的过筛试验，也是当前用于凝血因子治疗、肝素抗凝治疗监控以及检测狼疮抗凝物(一种抗磷脂自身抗体)的主要手段。其临床应用频率仅次于PT或与之相当。APTT是从复钙时间和部分凝血活酶时间(PTT)改良而来。它用脑磷脂(比PT测定用的凝血活酶少了蛋白质部分，故名部分凝血活酶)作为血小板代替物，加到PPP中，同时加入了活化第Ⅻ因子的激活剂。较之PTT，其凝固时间缩短，并且排除了血小板数量和功能对血浆凝固的影响。迄今为止，ICSH和ICTH尚未有APTT测定标准化或试剂标准化的方案，仅NCCLS于1992年提出了一个编号H29T的暂行规范［5］。以下是我国APTT测定标准化初步方案［1］。　　3.1原理将一种脑磷脂(血小板替代物，即部分凝血活酶)和激活剂加到血浆中，经过保温后，加入适当浓度的钙离子。其纤维蛋白凝块形成的时间(以秒计)，即为APTT。本法主要用于过筛测定内源途径和共同途径凝血因子的缺陷，如因子Ⅻ、Ⅶ、Ⅸ、Ⅺ、PK、HMWK以及纤维蛋白原等。同时也用于上述因子的抑制物测定和肝素治疗的监控。　　3.2测定步骤9 　　3.2.1样品采集样品的采取、贮存、运送与PT测定相同。注意：应用清洁的塑料或硅化玻璃采血器采血及贮血，防止凝血因子接触活化。　　3.2.2标本制备标本(乏血小板的血浆)的制备与PT相同。注意：必须用PPP测定。　　3.2.3温度水浴箱或电热块的温度为(37±1)℃，要经常检查温度是否准确。　　3.2.4接触活化时间加激活剂活化Ⅻ因子的时间要保持一致。各仪器和试剂生产厂家的规定可能不一样，应严格按说明书要求进行。　　3.2.5操作已预温(不超过30min)的APTT试剂一份，与预温(不超过10min)的待测血浆一份混合，立即开动秒表计时。至规定的接触活化时间(各商品要求不同)终了时，加入预温37℃的CaC12液一份，混匀，同时开动秒表。至出现血浆凝固时，停表记录血浆凝固时间(以秒计)。　　4PT和APTT的临床意义［7］9 　　4.1血浆PT测定正常参考范围：正常PT为11s～14s，超过正常对照3s为异常。临床意义：PT延长见于先天性因子Ⅱ、Ⅴ、Ⅶ、Ⅹ缺乏症和低或无纤维蛋白原血症；获得性见于DIC、肝病、阻塞性黄疸、维生素Ｋ缺乏症、血循环中有抗凝物质或口服避孕药等。PT缩短见于高凝状态和血栓性疾病。　　4.2活化APTT测定正常参考范围：35s～45s，临床意义：APTT较正常对照延长10s以上有意义。本试验较CT敏感，凡参与血浆凝血活酶生成的各种因子缺乏时，均可引起APTT延长，尤其Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ因子含量减少所致的各种血友病时多见延长，能检出因子Ⅷ：C＜２５％的轻型血友病。凝血酶原、纤维蛋白原严重减少以及有抗凝物质存在时亦可延长。也可作为血友病治疗和抗凝药物治疗过程中的观察指标之一。APTT缩短见于DIC高凝期、血小板增多症等。　　5活化的APTT和血浆PT可见下列4种情况［6］　　5.1APTT和PT都正常除正常人外，仅见于遗传性和继发性因子Ⅹ、Ⅲ缺乏症。获得性者常由于严重肝脏疾病、肝脏肿瘤、恶性淋巴瘤、包括白血病、抗因子Ⅹ、Ⅲ抗体、自身免疫性溶血性贫血和恶性贫血等引起。　　5.2APTT延长伴PT正常9 多数是由于内源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病，如血友病A、血友病B、因子Ⅺ缺陷症；血循环中有抗因子Ⅷ、抗因子Ⅸ或抗因子Ⅺ抗体存在；DIC时可见因子Ⅷ、Ⅸ、Ⅺ减低，肝脏疾病时可见因子Ⅸ、Ⅺ减少，口服抗凝剂时可见因子Ⅸ减低、vWD等。　　5.3APTT正常伴PT延长多数是由于外源凝血途径缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅶ缺陷症，获得性者常见于肝脏疾病、DIC、血循环中有抗因子Ⅶ抗体存在和口服抗凝剂等。　　5.4APTT和PT都延长多数是由于共同途径凝血缺陷所引起的出血性疾病。如遗传性和获得性因子Ⅹ、Ⅴ、凝血酶原（因子Ⅱ）和纤维蛋白原（因子Ⅰ）缺陷症，获得性者主要见于肝脏疾病和DIC，口服抗凝剂时可有因子Ⅹ和凝血酶原减低。此外，血循环中有抗因子Ⅹ、抗因子Ⅴ和抗因子Ⅱ抗体存在时，它们也相应地延长。临床应用肝素治疗时，APTT和PT也都会延长。【参考文献】　　［1］朱忠勇.凝血酶原时间和活化部分凝血活酶时间测定标准化［J］.中华医学检验杂志，1998，21(5)：308312.9 　　［2］CrowlyJP，MetzgerJB，ValeriCR.TheVolumeofBloodShedDuringtheBleedingTimeCorrelateswiththePeripheralVenousHematocrit.AmJClinPathol，1997，108:579584.　　［3］LindSE.TheBleedingTimeDoesNotPredictSurgicalBleeding.Blood，1991，77:25472552.　　［4］RodgersRPC，LevinJ.ACriticalReappraisaloftheBleedingTime.SeminThrombHaemost，1990，16:120.　　［5］NCCLS.DocumentH29T(tentativeguideline).ActivatedPartialThromboplastinTest(APTT)，1992，12：22.　　［6］王鸿利.出血的实验诊断［J］.上海第二医科大学瑞金医院上海血液学研究所.　　［7］杨春生，宋乃国.临床检验学［M］.天津科学技术出版社，1998，(1)：3943.9