大口静灰球体外抑菌实验研究

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1、大口静灰球体外抑菌实验研究作者：翁丽丽，王淑敏，朱娜，宋启印【摘要】目的观察大口静灰球不同溶剂浸提液体外抑菌效果。方法以金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、绿脓假单胞菌、枯草芽孢杆菌为受试菌，采用对倍稀释法测定大口静灰球不同溶剂浸提液体外最低抑菌浓度(MIC)，并通过测定平板内抑菌圈直径观察其体外抑菌效果。结果实验表明，95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷浸提液对以上4种细菌均有不同程度的抑制作用。结论大口静灰球具有一定的抑菌作用，可用于抗菌药物的研究开发。【关键词】大口静灰球;体外抑菌　马勃是一种常见的用于消肿、解毒和止血

2、功用的药用真菌，近年来，马勃在抗菌和抗癌方面的作用，也受到广泛关注[1]。《中国药典》规定大马勃Calvatiagigantea(BatschexPers.)Lloyd.、紫色马勃Calvatialilacina(Mont.etBerk.)Lloyd和脱皮马勃LasiosphaerafenzliiReich.[2]为中药马勃的来源。全国很多地区也用大口静灰球BovistellasinensisLloyd.子实体作马勃入药。大口静灰球来源于马勃科、静灰球菌属，分布地区主要是河北、河南、山东、吉林、江苏等地，含有多种

3、氨基酸、无机盐、麦角甾醇、类脂质及马勃素等成分。7　　1材料与仪器　　1.1药材实验用大口静灰球干燥子实体BovistellasinensisLloyd购于吉林省仙草药材公司。　　1.2供试细菌菌种金黄色葡萄球菌Staphylococcusaureus，ATCC25923;大肠埃希氏菌Escherichiacoli，ATCC44186;绿脓假单胞菌Pseudomonasaeruginosa，ATCC10105;枯草芽孢杆菌Bacillussubtilis，History←ISF←AS1.21，由长春中医药大学微生

4、物实验室提供。　　1.3药品和试剂95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷、牛肉膏、蛋白胨、氯化钠、氢氧化钠、盐酸、琼脂粉、医用酒精等(皆为分析纯)。　　1.4仪器YXQ-I，S.50SII立式高压蒸气灭菌器;METTLETOLEDO型电子天平;HG303.4K电热恒温培养箱;DHG.9070A型电热恒温鼓风干燥箱;BCN.1360型生物洁净工作台;KQ-250DB型数控超声波清洗器;PHB-4便携式酸度计。　　2方法7　　2.1供试细菌培养　　2.1.1牛肉膏蛋白胨琼脂培养基制备液体培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0

5、g，NaCl5.0g，蒸馏水1000ml加热溶解，调节pH7.0～7.2。固体培养基：牛肉膏3.0g，蛋白胨10.0g，NaCl5.0g，蒸馏水1000ml，琼脂20g，加热溶解，调节pH7.0～7.2，于121℃高压蒸气灭菌30min后制备细菌平板培养基[3，4]。　　2.1.2供试菌液的制备将各菌种分别接种到已标好菌种名称、株号、日期的斜面试管上，然后于37℃恒温培养箱中培养24～48h。挑选生长在琼脂上的纯菌落，直接用0.9%生理盐水稀释比浊到3号麦氏比浊管，浓度(9×108cfu/ml)，再1∶10稀释，

6、制备好的供试菌液备用。　　2.24种溶剂浸提液抑菌原液的制备将干燥的大口静灰球子实体剪去根部，保留不孕基部，粉碎后分别称取5g分装于250ml的三角烧瓶中，分别用100ml的水、95%乙醇、醋酸乙酯、三氯甲烷浸渍24h，超声(温度40℃、频率60Hz)30min后抽滤，重复浸提3次，合并相同溶剂浸提液，回收溶剂至剩余量大约5ml，移入已称重的小安瓿瓶中，于60℃水浴浓缩，后60℃烘干，称重，计算大口静灰球子实体以不同溶剂超声浸提的得率，分别为3.056%，2.901%，1.212%，0.936%。分别吸取27ml

7、相应的溶剂，作为子实体抑菌原液备用。以上4种溶剂浸提液的抑菌浓度分别是76.40，72.53，30.30，23.40mg/ml。以无菌水、95%乙醇、醋酸乙酯及三氯甲烷各2ml为阴性对照。　　2.3抑菌圈法测定大口静灰球4种溶剂浸提液的抑菌效果将已制好的菌悬液0.1ml接种于平板上，用无菌刮铲涂匀,盖好平皿，做好标记，放置5min，待平板表面水分吸收后，用直径5mm无菌金属打孔器在平皿内打孔，每皿3个孔,除去洞内琼脂，分别用微量移液器吸取40μl4种大口静灰球浸提液及相应阴性对照空白溶剂至孔中，以溶剂充满整个孔为

8、宜，每皿3个孔为相同大口静灰球浸提液或者空白溶剂，并重复实验两次。将培养皿置于37℃恒温培养箱中培养24～48h后，取出观察，用游标卡尺测量并记录抑菌圈直径，试验重复3次，计算各样品抑菌圈直径平均值[5]。　　2.4最低抑菌浓度(MIC)的测定取无菌小试管40支排于试管架，于每行第1管加入牛肉膏蛋白胨液体培养基0.8ml，2～10管各加0.5ml，于121℃高压蒸气灭菌3