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1、西尼罗热病毒RT—PCR检测方法的建立一25一文章编号:1005—944x(2005)05一OO25—03西尼罗热病毒RT—PCR检测方法的建立姜焱★张常印陈国强(江苏出入境检验检疫局210001)摘要:参考Genebank发表的西尼罗热病毒(WestNilevirus,WNV)E糖蛋白基因序列,自行设计合成一对引物,对WNv进行RT—PCR扩增,产物经琼脂糖电泳分析,呈现一条约400bp的条带,将其克隆入pMD18一T—Vector载体中,并进行序列测定,与已发表的WNV基因比较发现,核苷酸的同源性为99.7%,证实为Ⅵ的E基因,通过对样品多次检测,都能扩增出一
2、条约4O0bp的条带,表明该方法比较稳定.关键词:西尼罗热;E基因;RT—PCR;克隆;序列测定西尼罗热(WestNileFever,WNF)是由西尼罗病毒(westnilevirus,Ⅵ)感染引起的一种急性传染病"】.Ⅵ是一种虫媒病毒,黄病毒科,为40—60nln的20面体立体对称型单股正链RNA病毒,有囊膜,与日本乙型脑炎病毒,圣路易脑炎病毒,墨累河谷脑炎病毒和Kun-jiIl病毒等黄病毒在抗原方面有着密切的关系.WNv于1937年在乌干达的西尼罗地区从一位发热妇女的血液中首次分离到"】,20世纪5o年代在埃及从病人,鸟和蚊子也分离到病毒b】.Ⅵw~,沿"鸟一
3、蚊一鸟"途径在自然界中循环,鸟类是Ⅵw~,的扩散宿主,蚊子(尤其是库蚊)是主要的传播媒介,携带西尼罗病毒的蚊子叮咬人是本病的自然传染途径[210由引起的是黄病毒中流行最广的一种疾病,其分布在非洲和欧亚大陆的许多国家.一般症状较轻,很少侵犯中枢神经系统,病死率低.在20世纪90年代中期之前除1951—1954年和1957年在以色列及1974年在南非外,WNF很少暴发流行.20世纪9o年代中期以后,WNF的暴发范围和强度明显增加,病情严重,病死率高.自1994年至今,WNF在北非,中东,欧洲和北美等地区高速流行,1999年首次在西半球的美洲国家,主要是在美国发生流行,
4、并引起马和鸟类等动物发病死亡[5-121.西尼罗热确诊有赖于实验室诊断.血清学检验是最常用的实验室临床检验方法.由于乙脑等病毒与西尼罗病毒间存在免疫交叉反应,因此,进行血清学诊断时,必须结合病人居住地疫情和有无疫区旅行史,病人的免疫状况和预防黄病毒(如乙脑,黄热病等)接种史,病人的发病及标本采集时间和临床疑似诊断等情况,依据特异的鉴别试验(如病毒中和试验)作出确诊[1310西尼罗病毒的分离对实验条件要求很高,非一般临床实验室所能进行.以RT—PCR进行西尼罗病毒RNA检验是目前最快速,特异,敏感的方法.本研究通过分析Ⅵ的E基因,设计并合成了一对引物,通过对RT—P
5、CR条件的优化及对样品的多次检测,构建了特异,敏感,快速的检测WNv的RT—PCR方法.l材料和方法1.1材料1.1.1病毒州购自美国FortDodgeAn-污物可根据条件和需要,或堆积泥封发酵后肥田,或加工成饲料,或用作食用菌的培养基,或制沼气等.3.3病死畜禽无害化处理农村散养死亡的畜禽,由于条件所限和太分散零星,一般很难处理后再利用.建议利用废弃的水井,地窖或根据居民居住密集情况,酌情定点深挖土井,上面盖上水泥盖等,每有病死畜禽即投入其中后,撒上石灰,盖上井盖,再定期浇上汽油,柴油等焚烧,待填至离地平面1米时,再填土深埋.严禁随意丢弃和食用病死畜禽,特别是严
6、禁在沟渠河流内丢弃病死畜禽.3.4加强集市屠宰场管理集市屠宰畜禽,一般多是禽类的宰杀脱毛.可将这些经营户固定集中于一处,不可到处经营.兽医卫生管理人员和市场管理人员,可每天将羽毛,角皮,肠等污物集中消毒处理,对宰杀场地冲洗干净后,喷洒消毒.对加工畜禽熟制品的地点,要对加工废弃物进行无害化处理,设立废水处理池,对废水处理池进行无害化处理.农村的兽医卫生管理,绝不单单是畜牧兽医部门的工作,这需要全社会的共同努力.只有在南水北调工程未实施之前,提前做好兽医卫生管理工作,搞好沿湖地区的公共卫生,才能确保南水北调工程的调水质量,有效控制畜禽或人畜共患传染病的发生和流行,保证
7、当地和京津地区人们的身体健康,促进畜牧业的发展.这不仅是微山湖地区所应做好的事情,也是整个南水北调工程沿线地区都应切实关注的工作.CHINESEJOURNALOFANIMALQUARANTINE2005,22(5)一26—1.1.4引物设计参照Genebank公开发表的E基因序列,自行设计了如下引物,扩增长度为400bp,引物由上海皓嘉公司合成.5'一弓I物5'一ACTGAATIEACGT-GACCCGGCI'CCCCG一3'3'一弓I物5'一CGGGATCCGCCG-GTAG【1[G几℃C一3'1.2方法1.2.1的RNA提取参照TRIZOL说明书进行总RNA的
8、提取.取5
