survivin shrna真核表达载体的构建及其生物学作用_论文

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1、SurvivinshRNA真核表达载体的构建及其生物学作用作者：谢富华，吴小云，王润秀，熊亮，梁念慈【摘要】目的：构建存活素（survivin）基因短发夹RNA(shRNA)的表达质粒，为乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.方法：设计并合成有小发夹结构的8条survivinshRNA对应模板序列，退火并与pShuttleCMV载体重组质粒；将重组质粒转染人乳腺癌细胞MCF7；MTT实验筛选出最有效质粒及其有效浓度，流式细胞术检测细胞周期的变化，经Hoechst染色观察凋亡情况，RTPCR和WesternBlot检测survivin基因的表达情况.结果：成功构建重组质

2、粒并筛选出最有效质粒及其有效浓度；细胞受阻于G2/M期，并通过荧光染色发现有凋亡细胞；survivin基因表达受到抑制.结论：构建的重组质粒能抑制survivin基因的表达，这为研究乳腺癌RNAi介导的基因治疗打下基础.【关键词】survivin；RNA干扰；shRNA　　0引言存活素（survivin）基因几乎表达于所有常见的人类肿瘤组织，尤见于乳腺癌和肺癌［1］.有研究证明将小于30个核苷酸的小干扰RNA（smallinterferencingRNA,10/10siRNA）或短发夹RNA(shRNA)表达载体转入哺乳动物细胞中，同样能产生沉默效应.目前，其载体构建大多是

3、用RNA聚合酶Ⅲ依赖的启动子U6或H1进行表达的［2-3］，但是用RNApolⅡ依赖的巨细胞病毒立即早期启动子同样有效［4］.本实验我们设计针对survivin基因的shRNA表达质粒，将其转染人乳腺癌MCF7细胞，初步探讨其诱导MCF7细胞凋亡情况及对survivin基因表达的影响.　　1材料和方法材料pShuttleCMV载体（产地ambion公司）；Lipofectamine2000转染试剂盒(invitrogen)；各种限制性内切酶和T4DNA连接酶（大连宝生物公司）；总RNA提取试剂盒(加拿大BioBasic公司)；逆转录聚合酶链反应(RTPCR)试剂盒（

4、美国Qiagen公司）.方法的设计根据survivin基因的序列在线设计3个可干扰序列：①5′GGACCACCGCATCTCTACATTCAAGAAC3′,②5′ACAGAGAAAGAGCCAAGAACAAA3′,③5′AATTTGAGGAAACTGCGGAGA3′和一个错义序列5′TATGAGAATGGCAGCGAGATA3′（其碱基组成同序列③，但排列顺序不同），同源分析未见相同序列.重组质粒的构建和鉴定shRNA转录模板DNA链的设计：按pShuttle10/10CMV载体要求以反向重复方式设计发夹结构：正义链：5′CTAGT反向序列TCTCTTG

5、AA正向序列C3′，反义链：5′TCGAG正向序列TTCAAGAGA反向序列A3′.重组质粒的构建：模板链合成并退火，将其定向克隆至穿梭载体pShuttleCMV中；转化DH5α感受态细胞，氨苄青霉素筛选单克隆，分别命名为pShuttlesurvivin(13)和pShuttlecontrol.重组质粒的鉴定：提取质粒分别用XhoⅠ和EcoRⅠ酶切，取初步鉴定的质粒送上海生物工程技术服务有限公司测序.细胞培养与转染乳腺癌细胞株MCF7用含100mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液培养于37℃含50mL/LCO2的培养箱中.转染前24h将约1×105个细胞

6、接种至6孔板，转染时细胞融合度达30%～50%.按Lipofectamine2000操作手册进行转染：用质粒pShuttlesurvivin(13)以50nmol/L的浓度分别转染细胞，设立阴性（加pShuttlecontrol）和空白对照组（加Lipofectamine2000），每组设3个平行孔，培养24h后行MTT检测，筛选出最有效的shRNA表达质粒，将最有效的质粒分别以5，10，50，100，150nmol/L的终浓度转染MCF7细胞，每组设3个平行孔，设立对照组，培养24h后再次行MTT检测［5］.流式细胞术检测接种MCF7细胞于60mm平皿中（2×1

7、06/皿）.接种后24h，以最有效质粒的最佳浓度转染细胞，设阴性和空白对照组.转染后48h收集细胞，1000r/min离心510/10min，弃上清，PBS清洗1次，离心去PBS，加入预冷的700mL/L的乙醇，4℃固定16h以上.离心去乙醇，PBS清洗1次，加mL50mg/LPI（含100mg/LRNaseA）于避光处染色30min，用CoulterEPTCSXL31240流式细胞仪进行检测.荧光染色检测凋亡取普通洁净盖玻片于750mL/L乙醇中浸泡24h以上，风干，将盖玻片置于六孔板内，种入MCF7细胞培养