人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究

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1、山西医科大学硕士学位论文人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究姓名：焦强申请学位级别：硕士专业：骨科学指导教师：卫小春20040515山西医科大学硕士学位论文人骨髓间充质干细胞向软骨细胞分化的实验研究摘要目的建立一种体外分离和培养人骨髓间充质干细胞(BoneMarrow—derivedMesenchymalStemCeils，BMSCs)的方法；探讨BMSCs在单层培养中向软骨细胞定向分化的条件，为软骨组织工程提供种子细胞。方法分别采集3例志愿者骨髓各6ml，用Percoll细胞分离液分离，收集单个核细胞，在含10％胎牛血清的低

2、糖DMEM培养液中培养扩增，流式细胞仪分析BMSCs的表面标志。将培养第3代细胞分为4组：A组为对照组，B组为无血清诱导培养基组(含10ng／ml的rhTGF．D1、丙酮酸钠lmM、地塞米松1o一7M、牛胰岛素6．2509／ml、转铁蛋白6．2599／ml的高糖DMEM培养液)；C组为含5％胎牛血清的诱导培养基组；D组为含10％胎牛血清的诱导培养基组。倒置显微镜下观察细胞生长状况，免疫组化检测II型胶原分泌，原位杂交检测lI型胶原mRNA表达，甲苯胺蓝染色检测蛋白多糖的分泌，，H标记的胸腺嘧啶脱氧核苷(3H—TdR)掺入实验检测细胞

3、的增殖情况。结果经密度梯度离心后，活细胞比例在96％以上。贴壁后的细胞形态均一，由梭形向多角形转变，并一致表达CD9，而CD34、CD38、CD45、CD61呈阴性。B、C组细胞在诱导培养7天后II型胶原免疫组化均为阳性，原位杂交可检测到II型胶原mRNA的表达，甲苯胺蓝染色阳性，而A、D两组分别为阴性和弱阳性。D组细胞增殖最强，而B组细胞最弱，四组细胞3H—TdR摄入量的大小顺序为D>C>A>B。结论密度梯度离心法是一种有效获取人骨髓问充质干细胞的方法，细胞在体外生长稳定，表型均一；10ng／ml的TGF一0l可诱导人骨髓问充质干

4、细胞向软骨细胞方向分化，但在无血清培养基中无法有效的促进细胞的增殖；低浓度的胎牛血清(5％)和10ng／ml的TGF．e1联合作用既可促进入骨髓间充质干细胞的增殖，又可诱导其向软骨细胞方向分化，而高浓度胎牛血清仅对细胞的增殖有促进作用。关键词骨髓，洲充质二{：细胞，转化生长因子B，，分化，软骨细胞山西医科大学硕士学位论文ExperimentalStudyofInVitroChondrogenicDif托rentiationofHumanBoneMarrow．DerivedMesenchymalStemCellsAbstactObje

5、ctivesToestablishamethodofisolatingandculturinghumanbonemarrow—derivedmesenchymalstemcells(BMSCs)；toinvestigatethefeasibilityofinvitrochondrogenicdifferentiationofBMSCsinmonolayercultureaspotentialseedingcellsincartilagetissueengineering．MethodsAvolumeof6mlbonemarrowwa

6、scollectedfromthreevolunteerdonorsrespectively．MSCswereisolatedfromthePereollfractionofmononuclearcellsandculturedintheDulbecco’sModifiedEagle’SMedium(DMEM)withlowglucosecontaining10％fetalbovineserum，flowc”ometricanalysiswasperformedtoexaminetheexpressionofcellsurf-ace

7、moleculesonBMSCs，BMSCsfromthethirdpassageweregrownincompletemedium(A)，inductivesemm-freemedium(B)，inductivemediumwith5％fetalbovineserum(C)．inductivemediumwithlO％fetalbovineserum(D)respectively．ThegrowthoftheculturedBMSCswasobserved．Immunohistochemistryandinsituhybridiz

8、ationwereappliedtodetecttheexpressionofcollagentypeII．Thesyntheticproteoglycansweredetectedbytoluidinebluestaining．Th