hhgf促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化实验的研究

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第三军医大学硕士学位论文hHGF促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的实验研究摘要我国有9300万的乙型肝炎病毒携带者，其中2千万人为乙肝患者，酒精性肝病及非酒精性肝病的发病率亦逐年升高，众多慢性肝脏损伤因素导致纤维结缔组织异常增生，引起肝功能失代偿、肝腹水、肝癌、上消化道出血等一系列严重并发症，药物难以医治，肝移植是目前治疗终末期肝病最为有效的方法，但困于肝源缺乏等问题，极大的限制了其临床应用，骨髓间充质干细胞因其无限增殖及多向分化的潜能，有望成为治疗终末期肝病的又一可行方法，并已成为研究热点。源于中胚层的骨髓间充质干细胞具有极强的可塑造性，多项研究表明，其可分化为三个胚层的细胞，如成骨细胞、心肌细胞、软骨细胞、脂肪细胞、肝细胞等。在急慢性肝病中，移植骨髓间充质干细胞进行临床治疗已经在多篇文献中报道，且有多项实验已在动物体内或体外诱导过程中加入各种生长因子，以达到提高干细胞移植疗效的目的，目前尚缺乏转染基因后的骨髓间充质干细胞在体外诱导成肝样细胞的实验研究。有研究表明肝细胞生长因子（HGF）为骨髓间充质干细胞向肝细胞分化最重要的[8]始动因子之一，HGF作用的发挥同细胞膜受体c-met的结合密不可分。HGF蛋白与其受体c-Met结合后导致c-Metβ链的酪氨酸Tyr-1234及Tyr-1235残基自身磷酸化，由此激活了受体内在的酪氨酸激酶活性，导致细胞分裂或分化增加、运动能力增[19]强、细胞间连接消失，从而发挥其生物学作用。目的：本研究应用贴壁培养法，培养骨髓间充质干细胞，应用基因转染技术，将HGF基因转染入人骨髓间充质干细胞，通过G418筛选出转染成功的细胞群后扩增出转染成功的细胞克隆，分别应用激光共聚焦、RT-PCR、WesternBlot对比转染前后细胞中HGF的表达，此后，运用酒精性肝硬化病人血清对转染前后的细胞进行诱导分化，7D及14D后分别检测转染前后的各个细胞组中AFP、ALB表达水平，探讨转染人促肝细胞生长因子（hHGF）对人骨髓间充质干细胞（hBMSCs）向肝样细胞分化的影响。方法：(+)1．克隆hHGF基因，构建携带hHGF基因的真核表达质粒（pcDNA3.1-hHGF），5 第三军医大学硕士学位论文(+)首先应用PCR法获得HGFcDNA，再次应用限制性内切酶将HGFcDNA及pcDNA3.1切成粘性末端，T4连接酶连接，构建重组载体。2．贴壁培养法扩增人骨髓间充质干细胞，每日倒置显微镜观察细胞生长状况，隔日换液，获得了一些贴壁培养细胞的体会与经验，扩增后选择生长状态良好的细胞进行基因转染。(+)3．用脂质体将pcDNA3.1-hHGF转染人骨髓间充质干细胞，G418筛选转染后的阳性克隆，分别通过激光共聚焦、反转录聚合酶链反应（RT-PCR）、免疫蛋白印迹(Westernblot）检测hBMSCs中表达hHGF的水平；4．用酒精性肝硬化患者血清诱导hBMSCs，采用Westernblot分别检测各组细胞内甲胎蛋白（AFP）及白蛋白（ALB）的表达变化。结果：1．琼脂糖电泳提示，扩增的目的基因hHGF的cDNA为2200bp，成功将此cDNA与带有粘性末端的质粒定向连接，构建的重组质粒经酶切鉴定及测序鉴定，hHGF基因读码框架完全正确；2．细胞培养传代成功，细胞生长良好，呈梭形及鱼群样生长，获取较多生长状态良好的人骨髓间充质干细胞；3．通过脂质体将重组质粒成功的导入了人骨髓间充质干细胞，经过G418筛选，激光共聚焦、RT-PCR、Westernblot结果均证实经转染hHGF基因后的人骨髓间充质干细胞中hHGF分子呈高表达；4．人骨髓间充质干细胞经过诱导后逐渐变为上皮细胞样细胞，形态呈三角形或不规则形，未经诱导组细胞变化不明显，Westernblot结果表明诱导7D，14D转染hHGF基因后的人骨髓间充质干细胞中AFP、ALB表达明显高于其他实验组。结论：(+)1．扩增了hHGFcDNA全长序列，且成功构建重组质粒pcDNA3.1-hHGF；2．贴壁培养法可培养出人骨髓间充质干细胞，并在体外进行大量扩增，细胞状态良好；(+)3．重组质粒pcDNA3.1-hHGF可通过脂质体转染，hHGF基因在转染的细胞内可以成功表达目的蛋白；4．人骨髓间充质干细胞经酒精性肝硬化血清诱导后可向肝样细胞分化，hHGF基因转染后的细胞向肝样细胞分化的能力增高，表明hHGF基因在细胞内成功表达后可以提高人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力。6 第三军医大学硕士学位论文(+)综上，人骨髓间充质干细胞转染pcDNA3.1-hHGF后可显著提高细胞中HGF因子的表达，经诱导后可提高AFP、ALB的表达水平促进向肝样细胞分化，为终末期肝病的治疗提供了新思路及实验依据。关键词：人骨髓间充质干细胞；人促肝细胞生长因子；肝样细胞；甲胎蛋白；白蛋白7 第三军医大学硕士学位论文Up-regulatedhHGFpromoteshumanbonemarrowstemcellstodevelopintohepatocyte-likecellsAbstractChinahas9.3millioncarriersofhepatitisBvirus，and2millionofthemareHepatitispatient，TheincidenceofNon-alcoholicliverdiseaseandalcoholicliverdiseasehaveincreasedyearbyyear.Anumberofliverdamagefactorshaveledtotissuedysplasia，liverfunctiondecompensated，Ascites,livercancer,uppergastrointestinalbleedingandaseriesofseriouscomplications.Drugsisdifficulttotreat，Livertransplantationisthemosteffectivetreatmentoftheend-stageliverdiseaseatpresent,buttrappedinlackofsources,greatlylimiteditsclinicalapplication.Onaccountoftheinfinitevalueandmultilineagedifferentiationpotential,theboneMesenchymalstemcellshavebecomeahotstudyissue..Bonemarrowstemcellshavebeenshowntocontributetoallthreegermlayersandcanbedifferentiatedintoallcelltypespresentinthebody:Osteoblast、cardiomyocyte、Chondrocyte、Fatcellsandlivercells.Usetransplantatingstemcellstotreatliverdieaseinclinliciswidlyaccepted，andanumberofexperimentsaddmediumwithvariousgrowthfactorstoenhancetheeffectofstemcelltransplantationinvivoorinvitro，butthereislackofgenetransfectedmesenchymalstemcellsinducedintoliver-likecellsinvitroexperimentalstudy.ResearcheshaveshownthatHGFwasoneofthemostimportantfactorininitiating[8]frombonemarrowmesenchymalstemcellsintolivercells.Itisreasonabletoassumethatc-metplayedaimportantroleinHGF’sfunction.HGFanditsreceptorc-Metproteinbindingleadstoc-Metβ-chaintyrosineTyr-1234andTyr-1235autophosphorylation，Thusactivatedreceptorintrinsictyrosinekinaseactivity.Resultinincreasedcelldivisionordifferentiation,cellseparationandincreasedexercisecapacity,tofulfillitsbiological[19]role.2 第三军医大学硕士学位论文Objective:WeculturedthebonemarrowstemcellwithAdherentmethods,Accordingtothegenetransfertechnology,theHGFgenewastransferedintohumanbonemarrowmesenchymalstemcells.G418selectedtransfectedcellsafterthehHGFgenewastransfectedintohBMSCsmediatedbyLipofectamine2000.TheexpressionofhHGFwasconfirmedtobe(+)up-regulatedinthepcDNA3.1-hHGFtransfectedhBMSCsbyconfocallaser,RT-PCR(+)andwesternblotrespectively.ThenthepcDNA3.1-hHGFtransfectedhBMSCswereculturedwiththeserumofalcoholiclivercirrhosispatientfor7and14days.Westernblotwasperformedtodetectthealterationofα-fetoprotein(AFP)andalbumin(ALB)expression.Toinvestigatetheeffectsofhumanhepatocytegrowthfactor（hHGF）geneonthehumanbonemarrowstemcells(hBMSCs)developingintohepatocyte-likecells.Themainresultsandconclusionsareasfollows:Method:1．ConstructiontherecombinantpcDNA3.1(+)-hHGF,thisstepismaintainlyusedMolecularbiologytechniques,theHGFcDNAwasampifiedbypoly-merasechainreaction(PCR),andthen,XbalIandBamHIenzymedigesteditandinsertedintotheenzymesites.T4ligaseConnectionthem,ConstructionTherecombinantvector.2．Adherentculturedandamplifiedthebonemarrowstemcells,whichwassimpleandeasytomanipulate.andthenselecttheGoodgrowthcellstoTransfection.3．TherecombinantplasmidpcDNA3.1(+)-hHGFtransfectingthehuamnbonemarrowstemcellsmediatedbylipfectamine2000,TheexpressionofhHGFintransfectedcellswasdetectedbyconfocallaser,RT-PCRandwesternblotrespectively.(+)4．ThenthepcDNA3.1-hHGFtransfectedhBMSCswereculturedwiththeserumofalcoholiclivercirrhosispatientfor7and14days.Westernblotwasperformedtodetectthealterationofα-fetoprotein(AFP)andalbumin(ALB)expression.Result:1．ThehHGFcDNAwasparticularllyamplified,toreconstructandanalysistheplasmidbyrestrictionendonucleasedigestionandsequencing.thesegmentofhHGFgenewasAbsolutelycorrect.3 第三军医大学硕士学位论文2．Successfullyculturedthecells,whichwasappearedSpindleandthefish-likegrowth,selectedthegoodconditiongrowthofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsfortransfection.3．pcDNA3.1(+)-hHGFcouldtransfectedhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsmediatedbylipofectamine2000.selectedbyG418,weeffectivelyincreaseboththehHGFmRNAandproteinConfirmedbyconfocallaser,RT-PCRandwesternblot;4．Aftertransfection,Inducedhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsgraduallyintoepithelial-likecells,triangularorirregularinshape.Uninducedcellsdidnotchangesignificantly,TheexpressionofAFPandALBobviouslyincreasedinthe(+)pcDNA3.1-hHGFtransfectedcellsafterco-culturedwiththeserumofalcoholiclivercirrhosispatientfor7and14days.Conclusion:1．WeamplifiedhHGFcDNAfull-lengthsequenceandsuccessfullyinsertedintovectorpcDNA3.1(+);2．Adherentculturecannurturethehumanbonemarrowmesenchymalstemcells,anditcanExtensiveexpansioninvitro;3．pcDNA3.1(+)-hHGFcouldtransfectedhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsmediatedbylipofectamine2000,hHGFgeneintransfectedcellscanbesuccessfullyexpressthetargetprotein.4．Alcoholiclivercirrhosispatient’sserumcouldinducehumanbonemarrowmesenchymalstemcellsintoliver-likecells,andhHGFgeneexpressionincellsimprovetheabilityofhumanbonemarrowmesenchymalstemcellsintohepatocyte-likecells.(+)Inawords,pcDNA3.1-hHGFtranfectedhBMSCscouldapparentlyup-regulatetheexpressionofHGF.ExogenousHGFgenecouldpromotehBMSCstoinduceintohepacyte-likecells,whichmaybeapromisinggenetherapeuticmethodforterminalstagehepatopaths.Keywords：humanbonemarrowstemcells；humanhepatocytegrowthfactor；hepacyte-likecells；alterationofα-fetoprotein；albumin4 第三军医大学硕士学位论文中英文对照缩略词表英文缩写英文全称中文全称AFPalpha-Fetoprotein甲胎蛋白ALBAlbumin白蛋白BMSCsBonemesenchymalstemcells骨髓间充质干细胞bpBasepair碱基对Cacl2Calciumchloride氯化钙cDNAcomplementaryDNA互补脱氧核糖核酸DAPIdiamidino-phenyl-indole二脒基苯基吲哚DEPCDiethylpyrocarbonate焦磷酸二乙酯DMEMDulbeccosModifiedEaglesMediumDMEM培养基DMSODimethylsulfoxide二甲基桠枫DNADeoxyribonucleosidetriphosphate脱氧核糖核酸hHGFHumanHepatoctyeGrowthfactor人促肝细胞生长因子基因IODinte-gratedopticaldensity积分光密度LBLuria-BertaniLB细菌培养基minminute分钟mRNAmessageRibonucleicacid信使核糖核酸MSCsmesenchymalstemcell间充质干细胞NAOHSodiumhydroxid氢氧化钠PBSPhosphateBufferedSaline磷酸盐缓冲液PCRPolymeraseChainReaction多聚酶链式反应RpmRevolutionsperminute每分钟转速RT-PCRreversetranscriptionPCR反转录酶链反应THtyrosinehydroxylase酪氨酸羟化酶TrisTrihydroxymethlaminomethan三羟甲基氨基甲烷1 第三军医大学研究生学位论文独创性声明秉承学校严谨的校风和科研作风，本人申明所呈交的论文是我本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得我校或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料，与我同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。申请学位论文与资料若有不实之处，本人承担一切相关责任。论文作者签名：日期：第三军医大学研究生学位论文版权使用授权书本人完全了解第三军医大学有关保护知识产权的规定，即：研究生在攻读学位期间论文工作的知识产权单位属第三军医大学。本人保证毕业离校后，发表论文或使用论文工作成果时署名单位为第三军医大学。学校有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。学校可以公布学位论文的全部或部分内容（保密内容除外），可以采用影印、缩印或其他手段保存论文。论文作者签名：指导教师签名：日期： 第三军医大学硕士学位论文hHGF促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的实验研究前言长期以来，病毒、药物、酒精、遗传代谢等因素而导致的急慢性肝损害严重威胁人类的健康，肝纤维化为慢性肝病的病理基础，亦为各种慢性肝病走向肝硬化的必经之路，因目前尚无特效药物，针对慢性肝病治疗的现状，如何使肝纤维化进程逆转，积极探索新的治疗手段成为亟待解决的问题。终末期肝病的治疗一直是全世界悬而未解的难题之一。原位肝移植是目前治疗终末期肝病的最有效方法，但因存在供肝匮乏、创伤性大、手术费用昂贵、且需终身使用免疫抑制剂等诸多的因素，使得其临床广泛应用受到限制。近年来，干细胞为肝脏疾病的治疗提供了新的契机。干细胞是来自胚胎、胎儿或者成体内，在一定条件下具有无限增殖及多向分化潜能的细胞，按细胞分化潜能的大小可将其分为单能干细胞、多能干细胞及全能干细胞，按组织的发生的不同可以分为造血干细胞、骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞等，而按发生学的来源可将其分为胚胎干细胞、成体干细胞。作为成体干细胞的骨髓干细胞由于取材方便，成为目前研究界的热点之一，其中对造血干细胞（HSCs）的研究尤为深入，HSCs移植已使部分血液疾病患者从中受益。除造血干细胞外，骨髓中还存在着另外一类间充质干细胞(MSCs)。骨髓MSCs可塑性极强，在不同的诱导条件下可分化为骨、软骨、肌腱、肌肉、脂肪、神经元、肝细胞等多种组织细胞；MSCs不表达MHCⅡ类分子，低表达或不表达MHCⅠ类分子，可以长期存活于异基因移植，并且发挥其正常的生物学作用；骨髓MSCs取材来源于成体骨髓，来源较为广泛，且可在体外进行大量扩增，能满足临床治疗需求，而且避免了胚胎干细胞移植后畸胎瘤产生的可能性以及其难以逾越的伦理学障碍，以上优势均使得MSCs在治疗肝脏疾病中具有较好的应用前景，也为MSCs治疗肝病描绘了美好蓝图，但是也有部分研究结果表明MSCs的移植并未明显改善肝功能，甚至参与并加速了肝纤维化的进程，为进一步明确并提升MSCs移植治疗疗效，研究者逐渐开始转向基因治疗方向的研究。MSCs可作为基因治疗理想的靶细胞。具有诸多优势：（1）MSCs取自骨髓，来源充足，取材容易；（2）MSCs在体外培养具有相当的遗传稳定性及可移植性；（3）MSCs的免疫原性较低；（4）MSCs本身易于外源性基因的表达。8 第三军医大学硕士学位论文基因修饰MSCs已在骨骼疾病、心血管疾病和神经系统疾病中显示了相当的治疗[1]价值。Hasharoni等将MSCs转染rhBMP-2基因后注入鼠脊柱旁，观察新生骨形成并[2]获得脊柱融合。Matsumoto等将VEGF基因转染入骨髓MSCs后进行同种异体移植治疗大鼠急性心肌梗死模型，结果显示异体大鼠MSCs可定植在梗死的心肌组织上并生存，结果证实其可转化为心肌细胞及血管内皮细胞，VEGF基因转染组动物左室射[3]血分数显著升高，梗死边缘区心肌面微血管数目亦明显增加。Lu等将酪氨酸羟化酶基因经腺病毒载体导入MSCs，筛选阳性表达该基因的克隆，并移植入帕金森病模型鼠体内，6w后脑组织中发现该基因的表达，研究结果也进一步表明MSCs可迅速增殖并分化为成纤维细胞，移植组动物临床症状得到缓解，显示了一定的临床应用价值及前景。国内外专家学者正积极探索将基因转染及生物技术用于治疗慢性肝病，HGF基因修饰的MSCs移植治疗慢性肝病，可望弥补MSCs移植的不足，为肝脏疾病治疗提供新的思路。载有HGF基因的MSCs既可以促进自身的增殖及向肝实质细胞的转化，又能持续稳定表达HGF，解决外源性因子半衰期短、价格昂贵等不足，从而更好的发挥[4]抗纤维化作用，Yu等运用重组腺病毒载体将HGF基因导入大鼠MSCs，构建小体积肝移植（SFSLT）大鼠模型，对模型进行MSCs移植，成功预防大鼠模型肝移植的[5]缺血再灌注损伤和肝纤维化的发生。Hu等以HGF基因修饰的大鼠β2m−/Thy1+BDHSCs移植治疗大鼠肝纤维化，发现HGF基因获得稳定高效地表达，并显著改善肝功能，达到逆转肝纤维化作用。本研究拟通过构建真核表达质粒（+）pcDNA3.1-hHGF，并扩增人骨髓MSCs，将真核载体介导的HGF基因导入人骨髓MSCs；并在体外运用酒精性肝硬化病人血清诱导其成为肝样细胞，探讨骨髓MSC-HGF较MSCs治疗慢性肝病的可行性及优越性；为hHGF基因转染后的MSCs移植治疗慢性肝病提供理论依据。9 第三军医大学硕士学位论文(+)第一部分真核表达载体pcDNA3.1-hHGF的构建基因治疗成为重大疾病的治疗方法之一，而如何将目的基因导入靶组织使其以适当的水平表达，从而达到治疗效果成为其临床应用面临的主要问题，因真核表达质粒(+)pcDNA3.1带有巨细胞病毒启动子，具有较强的启动效应，且具有SV40一类具有增(+)强转染效率的高效增强子，在本部分实验中，我们选用pcDNA3.1质粒。促肝细胞生长因子是20世纪80年代被提纯的一种细胞因子，其由间质细胞产生，含8个外显子及17个内含子，大约70KB，HGF受体c-met为原癌基因编码的酪氨酸激酶受体，两者结合后激活PTK，再有PTK激活靶蛋白上的酪氨酸磷酸化，经瀑布式的磷酸化反应，将信号逐渐放大，最终传导至细胞核内，导致细胞增殖和分化，随着研究的深入，基因治疗成为各种疾病治疗的新模式，而HGF基因是重要的靶基因，有望利用各种功能治疗多种疾病，越来越多的研究表明HGF因子在多种细胞具有促有丝分裂、促血管生成、抗纤维化及抗凋亡效应，可促进肝细胞、各类上皮细胞、内皮细胞、软骨细胞、神经细胞的DNA合成、加快损伤部位细胞再生。近期研究发现，提高HGF水平有益于提升间充质干细胞治疗疗效，且hHGF基因含有一分泌型的信号肽，可以通过细胞的旁分泌效应发挥作用，弥补转染过程中效率低的问题，本部分实(+)验中我们将HGF基因定向插入真核表达质粒pcDNA3.1中，构建重组质粒，为下一部分的转染奠定基础。研究材料（一）主要试剂(+)pcDNA3.1invitrogen公司hHGF基因invitrogen公司BamHＩ、XbalＩFermentas公司T4连接酶Fermentas公司PBS宝生物工程有限公司DH5ａ中心实验室提供引物合成及DNA测序上海生工生物公司RT-PCR试剂盒Promega公司10 第三军医大学硕士学位论文质粒提取试剂盒OMEGA公司胶回收试剂盒OMEGA公司DNAMarkerFermentas公司胎牛血清Hyclone公司甘油、琼脂糖中心实验室提供EDTA北京中杉生物技术有限公司（二）主要仪器4℃冰箱青岛海尔公司超净工作台苏州安泰空气技术有限公司低温高速离心机基因有限公司二氧化碳孵箱美国THERMO公司电热恒温水浴箱上海苏达实验仪器有限公司倒置显微镜Olympus公司生物安全柜美国THERMO公司低速离心机科大创新股份有限公司细菌摇床江苏兴化分析仪器厂产品OT-1旋涡混合器上海琪特分析仪器有限公司产品电泳仪Bio-Rad公司-40℃及-80℃冰箱SANYO公司PCR基因扩增仪PE公司倒置相差显微镜OLYMPUS公司电子天平Strtorius公司96孔培养板corning公司微量移液器Eppendof公司（三）主要试剂配制1）LB液体培养基：取400ml去离子水，加入4g胰蛋白胨、2g酵母提取物及4g氯化钠后充分搅拌溶解，滴加5mol/L的NAOH调试PH至7.0，分装入锥形瓶后高温、高压灭菌冷却至室温。2）LB/Amp固体培养基：按每1000mlLB液体培养基中加入15g琼脂粉的比例加入琼脂粉于LB液体培养基，混匀后高压蒸汽灭菌20min，待冷却至60摄氏度左右在灭菌空气净化台中，按100ng/ml的浓度加入Ampiciline混匀后倒入细菌培养板，冷却11 第三军医大学硕士学位论文后封装4摄氏度备用。3）0.5mol/LEDTA：将186.12gEDTA加入800mlMilliporeH2O中，混匀后，调节PH值至8.0，定容1L。4）0.125%胰酶/0.02%EDTA：将0.02gEDTA及0.125g胰酶分别溶解于50ml的D-hanks溶液中，分别于0.22µm微孔滤膜过滤，分装后-20℃储存。5）琼脂糖电泳凝胶：35µl1×TAE+0.28g琼脂糖混匀后微波炉加热至沸腾，取出冷却至40℃左右，加入7µlGVⅡ，混匀后放入齿梳倒板，室温冷却。(+)（四）pcDNA3.1-hHGF构建示意图研究方法1．DH5α感受态的制备1）将配置好备用的LB固体培养基平板放置于超净台，接种环取少量DH5α空菌12 第三军医大学硕士学位论文液于平板上划线，置于37℃，饱和湿度细菌培养箱中培养12h。2）挑取LB平板上的单个DH5α菌落，放入含100mlLB液体培养基的烧瓶中，混匀，置入37℃恒温摇床4h（300rpg）。3）4h后取少量菌液，测OD600，值约0.4时为细菌的对数生长期，收集菌液。4）转入2个50ml预冷的灭菌Beckman管，放置冰上再次预冷大约10min，4000rpm，0℃离心10min。5）丢弃上清液（尽可能流尽），每管中加入冰预冷的0.1mmol/LCaCl2，轻悬细菌，（+）分装入无菌、预冷的EP管中，留一管做pcDNA3.1质粒转化，余立即置于-80℃储存。2．hHGF基因的扩增与提取1）取200µl感受态细菌DH5α于无菌EP管中，管中加入introgen公司Pblast2-hHGF10µl，混匀后冰浴30min。2）将EP管放于42℃恒温水浴锅90s，不晃动EP管。3）快速放置于冰上2min后管中加入800µl的LB液体培养基，37℃,300rpg水浴摇床，温育45min。4）按introgen公司说明书配置固体级液体培养基（专用抗性培养基），固体培养基铺板后划线接种，置于37℃细菌培养箱。5）24h后见少量细菌生长，挑取单个细菌于专用抗性液体培养基，37℃,300rpg摇床扩菌。6）采用omiga公司的质粒提取试剂盒，取4个新的HiBindDNA结合柱放置于收集管中。7）放入200µlBufferGps平衡液于柱子中，室温放置3-5min。8）12000rpm2min，室温离心。9）将1ml菌液置于1.5ml无菌EP管，分装20管，余菌液4℃保存。10）室温离心10000rpm，1min，弃上清。11）250µlsolutionⅠ/RnaseA重悬细菌。12）加入250µlsolutionⅡ后轻柔上下颠倒，放置2min。13）加350µlsolutionⅢ，混匀，见白色沉淀。14）13000rpm，室温离心10min。15）将上清放入平衡柱，，10000rpm，室温离心1min。16）弃收集管中液体，加700µlDNAwashBuffer洗柱，室温离心10000rpm，1min。17）130000rpm，2min甩干。13 第三军医大学硕士学位论文18）离心柱放入1.5ml灭菌EP管中，加入30µlElutionBuffer室温放置2min离心1min，13000rpm。19）测OD值。(+)3．pcDNA3.1质粒扩增与提取(+)1）200µl感受态细菌DH5α中加入10µlpcDNA3.1质粒于EP管中混匀，冰浴30min。2）在放置于42℃恒温水浴锅90s，不晃动EP管，快速放置于冰上2min。3）加入800µl的LB培养基，置于37℃恒温水浴摇床300rpg，45min，离心8000rpm×200min，弃上清，加入20µlLB液体培养基，混匀。4）接种环蘸取于LB/AMP固体培养基上涂匀，室温干燥后将培养皿倒置放置，37℃孵育48h。5）接种环挑取转化的DH5α单个菌落于LB/Amp液体培养基中，37℃,300rpm恒温摇床过夜，准备下一步质粒提取。6）采用omiga公司的质粒提取试剂盒，取4个新的HiBindDNA结合柱放置于收集管中。7）放入200µlBufferGps平衡液于柱子中，室温放置3-5min。8）12000rpm2min，室温离心。9）将1ml菌液置于1.5ml无菌EP管，分装20管，余菌液4℃保存。10）室温离心10000rpm，1min，弃上清。11）250µlsolutionⅠ/RnaseA重悬细菌。12）加入250µlsolutionⅡ后轻柔上下颠倒，放置2min。13）加350µlsolutionⅢ，混匀，见白色沉淀，此步骤为去蛋白质。14）13000rpm，室温离心10min。15）将上清放入平衡柱，10000rpm，室温离心1min。16）弃收集管中液体，加700µlDNAwashBuffer洗柱，室温离心10000rpm，1min。17）130000rpm，2min甩干柱子。18）离心柱放入1.5ml灭菌EP管中，加入30µlElutionBuffer室温放置2min后离心1min，13000rpm。19）测OD值。4．PCR扩增hHGF4.1引物设计根据invitrogen公司提供的Pblast2-hHGF中hHGF基因序列，应用primer5.0软件14 第三军医大学硕士学位论文设计引物，并由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列如下：，，P1：5—ATAGGATCCATGTGGGTGACCAAACTC—3，(GGATCC为限制性内切酶BamH-Ι酶切位点)，，P2：5—GTCGTCTAGACTATGACTGTGGTACCTT—3(TCTAGA为限制性内切酶XbalΙ酶切位点)4.2梯度PCR扩增体系采用Fermentas公司PCRmasterMix（2×），具体步骤如下：将100µlPCRmasterMix（2×），16µlprimer1,16µlprimer2，4.0µlhHGF基因及64µlwater-nuclease-free混匀于2.0ml无菌EP管后，分装于8只0.2mlPCR管中，标记为a，b，c，d，e，f，g，habcdefgh58.0℃58.6℃59.8℃61.1℃62.2℃63.2℃64.0℃64.9℃收集以上8管PCR产物，分别进行琼脂糖凝胶电泳：1）分别取a、b、c、d、e、f、g、h、marker样品1µl，分别加入4µl超纯水及1µl10×Buffer。2）倒入电泳缓冲液，将琼脂糖电泳凝胶放置于电泳槽中，使得缓冲液液面高于电泳凝胶1mm。3）将上述样品及marker分别用微量移液器于电泳凝胶齿梳孔中上样。4）接通电源，设置电压1-5V/cm，约30min后取出琼脂糖凝胶。5）凝胶成像系统下观察电泳条带，记录结果并拍照。6）观察到hHGF基因最适反应条件为：94℃变性30s，59.8℃退火45s，72℃延伸2min，循环30次。7）找到适宜条件后进行PCR，反应体系：试剂用量（μl）Pblast2-hHGF质粒DNA1PCRMasterMix(2×)12.5Primer1（10μM）2.5Primer2（10μM）2.5ddH2O6.5Total2515 第三军医大学硕士学位论文8）反应条件温度时间循环955min℃94℃30s59.8℃45s30cycles72℃2min72℃5min4.3胶回收hHGF基因PCR产物胶回收试剂盒购于Omiga公司。1）将2200bp处电泳条带进行切胶回收。2）将回收产物放于一清洁的1.5mlEP管中，称重，算出回收产物重量。3）将HiBindDNA平衡柱平衡好后放于2ml收集管中。4）按照说明书放入对应体积的BindingBuffer（XP2），置于55℃-60℃恒温水浴箱，水浴7min，胶完全融化，上下轻混2-3min。5）700µlDNA/agarosesolution于HiBindDNA柱，室温离心10000rpm，1min，6）弃去收集管中液体，再次HiBindDNAcolumn中加入300µlBindingBuffer（XP2）室温离心10000rpm，1min。7）加入700µlSPWashBuffer洗柱，室温10000rpm离心1min。8）重复第七步。9）将HiBindDNAcoloum柱室温离心13000rpm，2min，干燥。10）放柱于灭菌1.5mlEP管，加入20µlElutionBuffer洗柱，室温放置1min，13000rpm，1min离心。11）将产物取1µl于ND-1000紫光分度仪测浓度。(+)5．pcDNA3.1电泳后胶回收1）取扩增的pcDNA3.1(+)进行琼脂糖电泳。2）电泳条带进行切胶回收。3）将回收产物放于一清洁的1.5mlEP管中，称重，算出回收产物重量。4）将HiBindDNA平衡柱平衡好后放于2ml收集管中。5）按照说明书放入对应体积的BindingBuffer（XP2），置于55℃-60℃恒温水浴16 第三军医大学硕士学位论文箱，水浴7min，胶完全融化，上下轻混2-3min。6）700µlDNA/agarosesolution于HiBindDNA柱，室温离心10000rpm，1min，7）弃去收集管中液体，再次HiBindDNAcolumn中加入300µlBindingBuffer（XP2）室温离心10000rpm，1min。8）加入700µlSPWashBuffer洗柱，室温10000rpm离心1min。9）重复第七步。10）将HiBindDNAcoloum柱室温离心13000rpm，2min，干燥。11）放柱于灭菌1.5mlEP管，加入20µlElutionBuffer洗柱，室温放置1min，13000rpm，1min离心。12）将产物取1µl于ND-1000紫光分度仪测浓度。(+)6．BamHⅠ、XbalⅠ双酶切hHGF基因及pcDNA3.1hHGF基因反应体系：hHGF基因10µl超纯水18µl10×BufferTango4ulXbalⅠ1.5ulBamHⅠ1.5ul(+)pcDNA3.1反应体系：（+）pcDNA3.11µl超纯水18µl10×BufferTango2.5ulXbalⅠ1.5ulBamHⅠ1.5ul反应条件：37℃水浴4h。(+)7．双酶切hHGF基因及pcDNA3.1电泳胶回收(+)1）取双酶切后的hHGF基因及pcDNA3.1进行琼脂糖电泳。2）电泳条带进行切胶回收。17 第三军医大学硕士学位论文3）将回收产物分别放于一清洁的1.5mlEP管中，称重，算出回收产物重量。4）将HiBindDNA平衡柱平衡好后放于2ml收集管中。5）按照说明书放入与胶重量相对应体积的BindingBuffer（XP2），与胶混合，置于55℃-60℃恒温水浴箱，水浴7min，胶完全融化，上下轻混2-3min。6）700µlDNA/agarosesolution于HiBindDNA柱，室温离心10000rpm，1min，7）弃去收集管中液体，再次HiBindDNAcolumn中加入300µlBindingBuffer（XP2）室温离心10000rpm，1min。8）加入700µlSPWashBuffer洗柱，室温10000rpm离心1min。9）重复第七步。10）将HiBindDNAcoloum柱室温离心13000rpm，2min，干燥。11）放柱于2个灭菌1.5mlEP管，加入20µlElutionBuffer洗柱，室温放置1min，13000rpm，1min离心。12）将产物取1µl于ND-1000紫光分度仪测浓度8．载体与目的基因连接(+)将纯化回收后的pcDNA3.1及hHGF按摩尔比1:3进行连接，反应体系如下：(+)pcDNA3.14µlHGF基因4µl10×T4Buffer2.5ulT4DNAligase1ul超纯水25ul反应条件：22℃水浴连接过夜。(+)9．pcDNA3.1-hHGF转化大肠杆菌DH5α9.1DH5α的制备及转化1）取LB固体平板上单个菌落。2）溶入LB液体培养基中，于37℃摇床孵育4h。3）收集菌液，测OD值为0.378。4）取6支50ml无菌Beckman管，每管倒入25ml菌液，冰浴10min后4℃，4000rpm离心10min。5）弃上清，每管加入5ml0.1mmol/L的CaCl2，重悬后冰浴30min，4℃，4000rpm18 第三军医大学硕士学位论文离心10min。6）弃上清，每管加入1ml0.1mmol/L冰预冷的CaCl2，重悬后分装，取2支进行转化，余放入-80℃储存。7）取20ul连接产物加入100ul冰浴的感受态DH5α，继续冰浴30min。8）放入42℃水浴锅中热休克90S，不摇动。9）迅速冰浴2min。10）转入800ulLB培养基中，置于空气恒温摇床37℃,200rpm，1h。11）吸取200ul菌液涂于含60ng/ml的Amp固体LB培养皿。12）37℃孵育过夜。9.2重组质粒酶切鉴定挑取培养皿上单个菌落进行扩增、质粒提取，加入BamHⅠ及XbalⅠ酶切鉴定，反应体系如下：(+)pcDNA3.1-hHGF10µl超纯水18µl10×BufferTango4ulXbalⅠ1.5ulBamHⅠ1.5ul反应条件：37℃,水浴4h。收集反应产物，进行琼脂糖凝胶电泳，观察条带大小，取存在2200bp左右条带大小的细菌克隆，送上海生工生物有限公司进行测序，测序结果与GeneBank中GMID3082，CDs166-2352进行比较，判断基因序列有无突变及异常。结果òHGF基因扩增产物以introgen公司的hHGF基因为模板与上海生工合成引物进行PCR，所得产物进行琼脂糖凝胶电泳，结果在Marker2200bp附近出现特异性扩增条带，与HGF在geneBank中大小一致。结果如图1-1：19 第三军医大学硕士学位论文图1-1：hHGF基因电泳1：PCRproducts，2：DNAmarkeròBamHⅠ及XbalⅠ双酶切鉴定重组载体将连接产物转化感受态DH5α，挑取单个菌落，进行摇菌扩增、提取，应用限制性内切酶BamHⅠ及XbalⅠ进行双酶切鉴定，产物进行琼脂糖凝胶电泳，得到2条特(+)异性条带，大小分别为5400bp、2200bp，与线状pcDNA3.1、hHGF大小相符。如图1-2：（+）（+）M1：DNA标准（10000bp）；1：pcDNA3..1质粒2：pcDNA3.1-hHGF重组质粒；3：双酶切重组质粒，M2：DNA标准（2000bp）（+）图1-2：pcDNA3.1-hHGF重组质粒双酶切琼脂糖电泳鉴定ò生工测序结果：20 第三军医大学硕士学位论文送重组载体测序，结果显示读玛框架正确，无基因突变发生。克隆基因序列与geneBank中GMID3082，CDs166-2352HGF序列完全一致，部分测序结果如下：讨论基因修饰在各类疾病中的应用越来越广泛，其关键在于实现目的基因的获取及基因转移，而目前较普遍用于基因转移的方法有非病毒载体及病毒载体两大类，此两类各有优缺点：非病毒载体以真核表达质粒为主，其缺点在于转染效率低，但不需要整合入细胞的染色体，而是进入胞体独立的表达外源性基因，操作简单，安全性高；病毒载体则存在着安全隐患及操作复杂等问题，使得其临床应用得到一定的限制，本研究考虑到HGF基因含一分泌信号肽，具有较强的旁分泌作用，结合临床应用的安全性、(+)适用性，我们选用了真核表达载体pcDNA3.1作为外源性目的基因hHGF的载体。(+)pcDNA3.1为常用的非融合蛋白类型真核表达载体之一，大小约为5.4Kb，转染后连同目的基因以附加体的形式存在于细胞体内，而不会将目的基因整合，使其进入细胞染色体中，安全性较高，其含有的增强子SV40是不依赖方向的远距离促进基因转染效率的顺式作用元件，且包含了多个克隆位点，便于选择相应的酶切位点，为实验中应用限制性内切酶将目的基因及运载体切成粘性末端奠定了基础，在多克隆位点前还装有功能很强的真核基因启动结构，允许其在体外按有意义链方向进行转录和测序，最重要的是其包含可高效表达目的蛋白的人类巨细胞病毒启动子、氨苄抗性青霉[6]素及新青霉素抗性基因，为下一步实验中蛋白表达及转染后G418筛选创造了极为有力的条件。自1975年LaBrecque等从大鼠再生肝脏中纯化出具有刺激肝细胞生长的物质命名为肝脏再生刺激因子后，1984年Nakamura等再次从部分肝切除大鼠的血清中分离到[7]能刺激肝细胞生长和DNA合成的肝源性因子，并首次将它命名为肝细胞生长因子，21 第三军医大学硕士学位论文近年来，研究表明HGF是由间质细胞产生的一类细胞生长因子，不仅在肝细胞，在多种细胞中均有抗纤维化、抗凋亡、促进血管生成、促进有丝分裂的作用，越来越多的[23]实验及临床治疗关注HGF基因，Efimova等将健康人肝脏部分切除后，测定了血清中HGF、表皮生长因子（EGF）、血管内皮细胞生长因子（VEGF）、TGF-α的变化，结果发现，在肝脏部分切除的早期，血清中的HGF显著升高，EGF、VEGF变化不明显，TGF-α无明显变化。这说明HGF在肝再生过程中具有重要的作用近期研究表明，[8]HGF为骨髓间充质干细胞向肝细胞分化的最重要启动因子之一，考虑到外源性因子半衰期较短，受体内微环境影响大，价格昂贵等因素，基于基因疗法的目的，将外源（+）性hHGF基因定向插入运载体pcDNA3.1成为后部分实验中转染骨髓间充质干细胞的关键一步。(+)本实验将大小为5400bp左右的pcDNA3.1质粒及大小约2200bp的目的基因(+)hHGF分别运用限制性内切酶BamHⅠ及XbalⅠ双酶切，使得pcDNA3.1及hHGFcDNA形成粘性末端，方便目的基因cDNA插入载体的BamHⅠ及XbalⅠ位点之间，从而进行定向重组，重组成功后经酶切鉴定，电泳后形成2条特异性条带，大小分别(+)为5400bp及2200bp，该条带大小与线性pcDNA3.1及hHGFcDNA大小相符，测序(+)结果亦表明，插入pcDNA3.1酶切位点BamHⅠ及XbalⅠ之间的hHGFcDNA为定向插入，读码框架完全正确，无终止密码存在。小结测序结果证实：双酶切位点间定向插入的目的基因hHGF序列读码框架完全正确，无终止密码存在，同GeneBank中HGF基因编码序列完全一致，故本部分实验成功构(+)建了真核表达载体pcDNA3.1-hHGF。22 第三军医大学硕士学位论文第二部分hHGF促进人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的实验研究干细胞是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，也是干细胞的两种主要特性，即自我更新的能力及多向分化的能力，使细胞在损伤组织再生方面有强大治疗的潜能。而且干细胞移植治疗急慢性肝病具有无伦理限制、不存在免疫排斥、不易受病毒或肿瘤的污染等优点，操作简单，安全有效。利用自身或他人的干细胞和干细胞衍生的组织或器官替代病变的组织或器官，能够治疗目前难以医治的多种疾病。它的临床应用将会使许多难治性的疾病的预后产生划时代变化。这是目前国际上唯一一项可以与肝移植相媲美，治疗肝硬化的新技术。干细胞具有强大的分化功能，根据不同的环境及药物诱导作用可以分化成多种原始的祖细胞。因人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化无明显的“老化”及丧失分化潜力等特性，成为治疗各种急慢性肝脏疾病的重要细胞来源，我们就是根据这种原理将干细胞种植到肝上在微环境和细胞分化诱导剂的作用下使其生长为肝脏细胞。从而代替已经衰老坏死的肝细胞，完成肝脏自身代谢维持基本的生理功能。将促进干细胞向肝细胞分化的始动因子hHGF导入干细胞，促进干细胞向肝细胞的转化，成为本实验的选择。本部分实验主要解决以下几个问题：1、人骨髓间充质干细胞的培养、扩增；2、探讨(+)pcDNA3.1-hHGF转染人骨髓间充质干细胞的可行性问题。3、转染后的人骨髓间充质干细胞诱导成肝样细胞的优越性问题。研究材料（一）主要试剂L-DMEMHyclone公司hBMSCs州赛业公司Lipofectamine2000Reagentinvitrogen公司胎牛血清Hyclone公司PBS宝生物工程有限公司酒精性肝硬化病人血清本科室病人捐赠Anti-HGF单克隆抗体abcam公司23 第三军医大学硕士学位论文Anti-ALB多克隆抗体cellsignal公司Anti-AFP多克隆抗体cellsignal公司PVDF膜Millpore公司丙烯酰氨BioRad牛血清清蛋白SIGMA脱脂奶粉伊利去离子水MilliPore蒸馏水实验室自备RIPA裂解液重庆金麦Tween-20上海生工丽春红北京天根Tris碱（三羟甲基氨基甲烷）北京鼎国（二）主要仪器4℃冰箱青岛海尔公司超净工作台苏州安泰空气技术有限公司二氧化碳孵箱美国THERMO公司电热恒温水浴箱上海苏达实验仪器有限公司倒置显微镜Olympus公司6、24孔细胞培养板corning公司微量移液器Eppendof公司电泳装置Bio-Rad电转装置Bio-Rad转膜槽Bio-Rad三衡电源Bio-Rad凝胶成像系统Bio-Rad涡漩混合器北京同正水平脱色摇床北京鼎国电磁搅拌器Sartorius超纯水机MILLI（三）试剂配制1)30%丙烯酰胺24 第三军医大学硕士学位论文丙烯酰胺29g甲叉双丙烯酰胺1g去离子水定容至100ml2)电泳缓冲液(5×)TrisBase15.1g甘氨酸94gSDS5g去离子水定容至1000ml3)电转缓冲液甘氨酸2.9gTrisBase5.8gSDS(电泳级)0.37g甲醇200ml去离子水定容至1000ml4)TBST洗膜液配制Tris缓冲液100mlNaCl8.5-9.0gTween-201ml去离子水定容至1000ml5)Tris缓冲液(0.5M，PH7.6)：TrisBase60.57g溶于800ml去离子水中，调PH值至7.6，定容至1000ml。6)封闭液配制：5g脱脂奶粉加入到100ml0.01M的PBST中，混匀。7)TAE配制：将242gTris-Cl、57.1ml醋酸及37.2gEDTA-Na2.H2O混合物定容至1L，室温储存，重复使用次数不可过多，否则影响缓冲效果。研究方法1．人骨髓间充质干细胞的复苏与培养人骨髓间充质干细胞购于广州赛业公司。25 第三军医大学硕士学位论文1）将购得冻存的人骨髓间充质干细胞置于37℃水浴中快速震荡溶解。2）取15毫升无菌离心管，加入含10%胎牛血清的L-DMEM完全培养液，将细胞转入离心管，1000r/min离心5分钟。3）弃上层液，再次加入含10%胎牛血清的L-DMEM培养液。4）轻柔吹打混匀，置于37℃含有5%CO2的细胞培养箱中贴壁培养。5）2日后首次半量换液，余隔2日换液一次。6）当细胞长至80%左右融合时用0.25%胰酶消化后以1:2比例分瓶传代并计数。7）每日倒置显微镜下观察细胞生长状态及细胞贴壁状态，并摄像记录。8）将活力最好的第三代人骨髓间充质干细胞计数后培养于24孔板中，仅接种12孔，每孔设一复孔，以备进行细胞转染。(+)2．pcDNA3.1-hHGF转染人骨髓间充质干细胞1）将50gG418溶解于100µl20mmol/L的HEPES溶液后，除菌，分装于EP管，-20℃保存，此为500mg/ml的G418。2）将上步准备好60%融合的24孔板中第三代人骨髓间充质干细胞培养于加入含有双抗（青霉素、链霉素各100u/ml）的完全培养基中。3）将12孔分别设置浓度梯度为200、400、500、600、700、800、1000、1200µg/ml，其余4孔做对照，置于37℃含有5%CO2的细胞培养箱中培养。4）维持G418浓度的情况下，隔2日换液，并倒置显微镜下观察细胞死亡情况，直至确定G418最低致死浓度。(+)5）将12µlpcDNA3.1-hHGF及10µlLipofectamine2000Reagent分别溶于250µLDMEM/F12后，轻柔混匀，室温放置15min。6）加入0.478mlDMED/F12入上步准备好的混合物中，充分混匀。7）待前面准备好的6孔板中的细胞生长到80%融合，将上步的溶液加入6孔板的3孔中，其余3孔做对照。8）置于37℃含有5%CO2的细胞培养箱中贴壁培养12h后，加入含20%胎牛血清的完全培养基1ml。9）转染60h后，细胞铺板约70%，1:2传代，继续至细胞铺板约70-80%。10）弃去培养液，对照孔及实验孔均分别加入500µg/ml的G418进行筛选。11）当对照孔中细胞大部分死亡时，更换200µg/ml的G418筛选2周。12）抗性集落形成后，应用极限稀释法获得表达hHGF的细胞克隆。3．激光共聚焦检测转染前后细胞内hHGF蛋白表达26 第三军医大学硕士学位论文1）取无菌盖玻片放置于一次性6孔板中。2）转染前后的细胞分别按1×10^4个/孔接种于放置盖玻片的孔板中。3）置于37℃含有5%CO2的细胞培养箱中培养48h。4）弃去培养液，加入PBS后放于水平摇床上清洗3遍，以10%甲醛固定，再次加入PBS于水平摇床上清洗3次。5）将鼠抗人HGF抗体以抗体稀释液1:500稀释，分别加在转染前后固定好的盖玻片上，放于4℃冰箱孵育过夜。6）CY3标记的二抗用抗体稀释液以1:200比例稀释后加于盖玻片上，避光孵育2h。7）于水平摇床上轻柔的用PBS漂洗3次，每次5min。8）Dapi染核5min，荧光抗粹灭封片剂封片。9）避光送激光共聚焦室进行观察、摄片。4．RT-PCR法测定人骨髓间充质干细胞中hHGF表达1）引物设计://P1:5-CAAATGTCAGCCCTGGAGTT-3//P2:5-ATTGACAGTGCCCCTGTAGC-3GAPDH-1:5'ACCCCGTGCTGCTGACCGAG3'GAPDH-2:5'TCCCGGCCAGCCAGGTCCA3'(+)(+)2）将实验分为3组，转染pcDNA3.1组，转染pcDNA3.1-hHGF基因组，无转染组，以下使用的所有使用液体、器械、离心管均用DEPC水处理并消毒，操作中戴口罩及手套，防止RNA被酶降解。3）将3组细胞分别用6孔板以10^6/ml密度培养，用PBS洗涤后分别加入1mlTrizol匀浆，转入1.5mlEP管中，裂解5分钟。4）加氯仿1/5体积（0.2ml），漩涡振荡混匀后4℃，离心15000转，5分钟。5）转上层水相（约400μl）于另一1.5mlEP管中。6）EP管中加入等体积的异丙醇400μl，混匀后4℃，离心15000g，20分钟。7）弃上清，加入冰预冷的75%乙醇1ml后4℃离心15000g，5分钟。8）再次弃去上清，加入无水乙醇1ml后4℃，离心15000g，5分钟。9）弃上清，置室温下干燥5-10分钟。10）溶于DEPC水中至11μl，-70℃保存待用。27 第三军医大学硕士学位论文11）另取10µL标本稀释50倍，在紫外可见分光光度计上分别于260nm、280nm进行RNA纯度和含量测定。RNA含量（µg/µL）=OD260nm×40×50/1000，正常范围为1.65—2.00。12）所提RNA进行1%琼脂糖凝胶电泳，将上述3组提取的RNA分别加入琼脂糖凝胶的齿梳孔中，120V、20min。13）逆转录进行cDNA制备：将提取的RNA与DEPC水的混合物11µl与引物Oligo（dT）15µl，混匀、离心后70℃加热10min后立即至冰上冷却2min。加入下列混合物：Mgcl22µl5xRTBuffer2µldNTPMixture1µlRNAsinupto2µl37℃，5min加入逆转录酶1µl，42℃反应1h后70℃,15min终止反应。冰中加入1µlRNaseH，37℃水浴反应25min，降解RNA残留。此时反应产物即为cDNA，-20度保存待用。14）PCR扩增：PCR反应20ulPCR反应体系加入试剂和引物，PCR体系的组成如下：进行PCR循环，4℃保存PCR产物。10xPCRBuffer2.5µlMgcl22.5µldNTPMixture0.5µlcDNA3.0µlTaqHS0.2µlP1、P2（50µmol/L）0.25µlGAPDH1、GAPDH2（50µmol/L）0.25µlddH2Oupto20µL15）琼脂糖凝胶电泳鉴定：将以上3组细胞的PCR产物分别加入相应的凝胶齿梳孔中，并给予DNAMarker进行对照。对mRNA进行半定量对照。28 第三军医大学硕士学位论文5．Westernblot检测转染后人骨髓间充质干细胞的hHGF蛋白表达5.1总蛋白浓度测定(+)本部分实验分为3组，a为转染pcDNA3.1-hHGF质粒细胞组；b为转染(+)pcDNA3.1质粒细胞组；c为无转染组。将细胞中加入1mlRIPA和10µlPMSF，吹打匀浆，冰浴30min后转移到1.5ml离心管中，4℃，20000g离心30min，取上清，提取出总蛋白，BCA蛋白定量试剂盒检测以上3组细胞总蛋白浓度：a）按照适当的比例稀释样本。b）BCA工作液与稀释的样本按照10：1的比例加入，混匀。c）置于37℃水浴30min，紫外分光光度仪于562nm波长处测定吸光度。5.2SDS-聚丙稀酰胺凝胶电泳1）将3组蛋白样品中分别加入5×SDSLoadingBuffer，煮3-5min，冷却至室温。2）分离胶的配制10％分离胶H2O4mL30％ACM3.3mL1.5MTris-Cl,pH8.82.5mL10%SDS0.1mL10%AP0.1mLTEMED0.004mLTotal10mL3）浓缩胶的配制5％浓缩胶H2O5.50mL30％ACM1.30mL1.5MTris-Cl,pH8.81.00mL10%SDS0.08mL10%AP0.08mLTEMED0.008mLTotal8mL29 第三军医大学硕士学位论文4）清洁玻璃板，卡紧、对齐，垂直卡于架子上。5）将配制好的分离胶混合液缓慢倒入玻璃板间的夹缝中，为浓缩胶配制留足够空间，聚胶后轻轻在顶层加入蒸馏水覆盖，以防空气抑制作用。6）封闭30min，倒去覆盖的蒸馏水，吸水纸吸干残留液体，缓慢加入上述准备好的浓缩胶混合液于夹缝后插入齿梳。7）60min后取下梳子，电泳装置中加入1×电泳液，注意有无泄漏，驱除玻璃板中气泡。8）齿梳孔中分别加入maker，及蛋白样品后跑胶，浓缩胶电压为8V/cm胶，分离胶电压调整为15V/cm，直到染料到分离胶底部为止，断开电源。9）小心取下胶，根据目的条带大小切取胶条，用转膜液洗PVDF膜及胶后将膜铺在胶上，除去气泡；10）将上步组合成的胶/膜复合物外加一层虑纸，除去气泡，组成滤纸/胶/膜组合，放入电泳槽，胶面向阴极低温电泳转膜。5.3免疫反应1）去离子水泡膜后加适量5%脱脂奶粉（PBST配制），水平摇床2h。2）脱色摇床上PBST洗膜三次，每次10min。3）一抗hHGF孵育后4℃摇床过夜。4）复温后再次PBST洗膜三次，每次10min。5）加二抗，摇床2h后再次TBST洗膜三次，每次10min。6）曝光，采图。6．成肝样细胞诱导及诱导后AFP及ALB检测6.1诱导成肝样细胞分化诱导血清为一名45周岁酒精性肝硬化男性患者血清，诊断符合2000年全国传染病及肝病学会分会修订标准，肝功损害明显，肝炎病毒标志物阴性，排除其他系统疾病，患者知情同意。(+)诱导分组：Ⅰ组：转染pcDNA3.1-hHGF组加入含20%患者血清的完全培养基；(+)Ⅱ组：转染pcDNA3.1组加入含有20%患者血清的完全培养基；Ⅲ组：未转染的细胞(+)加入含有20%患者血清的完全培养基；Ⅳ组：转染pcDNA3.1-hHGF组加入含20%胎牛血清的完全培养基，间隔2日换液一次，每日在倒置显微镜下观察各组细胞诱导分化过程中的形态变化及生长状态，并摄像记录。30 第三军医大学硕士学位论文6.2AFP及ALB的Westernblot检测1）收集诱导7D及14D的各组细胞，分别放置于微量离心管中。2）加入RIPA缓冲液（含10mg/mlPMSF），吹打匀浆，冰浴30min。3）4℃离心后，取上清液。4）BCA蛋白定量试剂盒检测以上各组细胞总蛋白浓度：a）按照适当的比例稀释样本。b）BCA工作液与稀释样本按10：1比例加入后混匀。c）置于37℃水浴30min，紫外分光光度仪于562nm波长处测定吸光度。5）清洁玻璃板，卡紧、对齐，垂直卡于架子上。6）将配制好的分离胶混合液缓慢倒入玻璃板间的夹缝中，为浓缩胶配制留足够空间，聚胶后轻轻在顶层加入蒸馏水覆盖，以防空气抑制作用。7）封闭30min，倒去覆盖的蒸馏水，吸水纸吸干残留液体，缓慢加入上述准备好的浓缩胶混合液于夹缝后插入齿梳。8）60min后取下梳子，电泳装置中加入1×电泳液，注意有无泄漏，驱除玻璃板中气泡。9）齿梳孔中分别加入maker，及蛋白样品后跑胶，浓缩胶电压为8V/cm胶，分离胶电压调整为15V/cm，直到染料到分离胶底部为止，断开电源。10）小心取下胶，根据目的条带大小切取胶条，用转膜液洗PVDF膜及胶后将膜铺在胶上，除去气泡；11）将上步组合成的胶/膜复合物外加一层虑纸，除去气泡，组成滤纸/胶/膜组合，放入电泳槽，胶面向阴极低温电泳转膜。6.3免疫反应1）去离子水泡膜后加适量5%脱脂奶粉（PBST配制），水平摇床2h。2）脱色摇床上PBST洗膜三次，每次10min。3）一抗孵育后4℃摇床过夜。4）复温后再次PBST洗膜三次，每次10min。5）加二抗，摇床2h后再次TBST洗膜三次，每次10min。6）曝光，采图。7．统计学分析以上RT-PCR及Westernblot结果运用真彩色医学图像分析软件（MediaCybernetics公司Image-proplus）进行分析，选择质积分光密度（inte-grated）optical31 第三军医大学硕士学位论文density，IOD）值作为结果IOD值，计算转染前积分光密度与转染后积分光密度的统计学差异。结果1．骨髓间充质干细胞的培养将细胞复苏后，放置于37℃，5%CO2饱和湿度的培养箱中培养，首次按1:2比例接种在培养瓶，接种后倒置显微镜下观察成圆形的悬浮细胞，大约于3h后细胞开始贴壁，形态变为三角形及多边形，伸出伪足，24h后细胞全部贴壁，由多形变为长梭形、纺锤形，细胞数目逐渐增多，细胞间形成联系交织，48h后细胞成团样、漩涡、鱼群样生长。连续培养传代扩增后备用于细胞转染。图2-1：hBMSCs的形态学观察（复苏接种后）图2-2：hBMSCs的形态学观察（接种后72h）(+)2．pcDNA3.1-hHGF转染人骨髓间充质干细胞2.1最低致死浓度的筛选将200、400、500、600、700、800、1000、1200µg/ml的G418加入人骨髓间充质干细胞培养观察，发现500µg/ml维持的第六天，细胞大多数死亡，多数细胞悬浮、变圆，维持第十天，倒置显微镜下见大量细胞碎屑，视野中未见贴壁细胞存在，全部死亡。32 第三军医大学硕士学位论文图2-3：筛选后第10天（LM×200）2.2人骨髓间充质干细胞的转染脂质体Lipofectamine2000介导的DNA转染法，双分子层组成的闭合囊泡通过细胞的内吞或吞噬作用，将携带的目的基因导入人骨髓间充质干细胞，使得hHGF基因在细胞中得以表达，从而达到上调hHGF的目的。转染12h左右，加入胎牛血清终止转染，放入37℃，5%饱和湿度细胞培养箱中孵育48h，加入500µg/ml的G418进行转染后筛选，空白对照组细胞在7D左右，大部分死亡，实验组和对照组部分细胞死亡，将G418浓度调节至200µg/ml，维持浓度继续筛选14D，转染重组质粒组及转染空质粒对照组均有细胞集落形成，收集细胞，获得表达hHGF的细胞克隆。(+)图2-4：转染pcDNA3.1-hHGF后的BMSCs（×64）33 第三军医大学硕士学位论文2.3转染前后激光共聚焦结果对比(+)取转染pcDNA3.1-hHGF质粒前后的人骨髓间充质干细胞进行激光共聚焦检测，通过观察细胞中hHGF的荧光强度发现：转染后的细胞胞浆中荧光强度明显高于转染前，表明转染后的细胞中hHGF表达明显增高。图2-5：转染前hBMSCs中hHGF化学荧光染色图2-6：转染后hBMSCs中hHGF化学荧光染色2.4转染前后人骨髓间充质干细胞中hHGFmRNA及蛋白表达对比1）总RNA提取:紫外分光光度计检测总RNA,OD260/OD280(R)在1.8～2.0之间,质量较好.抽提的总RNA电泳结果如图2-6所示.图2-7总RNA提取2）RT-PCR结果经过RT-PCR检测证实，在500bp附近有特异性条带出现（图2-7）。RT-PCR结34 第三军医大学硕士学位论文果图片经过真彩色医学图像分析软件统计，最后以组别作为横坐标，HGF/GAPDH（%）6作为纵坐标作图，转染组HGF表达明显增高。取1×10个以上各组细胞，提取各组总蛋白，应用鼠抗人HGF单克隆抗体进行蛋白印迹检测（图2-8），WB结果图片经过真彩色医学图像分析软件统计，最后以组别作为横坐标，HGF/Actin（%）作为纵坐标作图，实验组人骨髓间充质干细胞中hHGF蛋白表达明显增高（P＜0.05）。HGF*0.160.140.120.10.080.06HGF/GAPDH(%)0.040.020123图2-8：RT-PCR检测hBMSCs中hHGF基因mRNA的表达（+）（+）M：DNA标准（DL2000）1无质粒转染组；2：pcDNA3.1转染组；3：pcDNA3.1-hHGF质粒转染组（*，与对照组相比，P＜0.05）35 第三军医大学硕士学位论文0.45**0.40.350.30.250.20.15HGF/β-Actin（%）0.10.050123图2-:9：westernblot检测各组hBMSCs中hHGF蛋白的表达（+）（+）1：pcDNA3.1-hHGF转染组hHGF蛋白表达；2：pcDNA3.1空白质粒转染组hHGF蛋白表达；3：无质粒转染组hHGF蛋白表达（**，与对照组相比，P＜0.01）2.5经诱导后各组细胞的形态学改变(+)诱导培养过程中，观察加入含20%患者血清的pcDNA3.1-hHGF转染组细胞形态学改变，经诱导后7D出现上皮样细胞，呈现不规整形或者三角形，随后可见少量细胞分化为肝样细胞，此为多边形细胞，其胞浆较为丰富，核较大，偶可见双核细胞，经14D诱导后可见多边形肝样细胞明显增多（图2-9）。未经诱导组细胞形态变化不明显，仍保持均一梭形生长。36 第三军医大学硕士学位论文实验组经诱导7D后形态学改变（LM×100）实验组诱导14D后形态学改变（LM×100）图2-10诱导组细胞形态学观察2.6分别诱导7D及14D后细胞AFP、ALB表达经过7D及14D的诱导后，各组分别取1×10^6个细胞，抽提蛋白后以兔抗人AFP抗体，兔抗人ALB抗体进行westernblot检测，表明Ⅰ组细胞诱导7D时AFP(图2-10)及14D时ALB（图2-11）表达强度明显高于阴性对照组（Ⅱ、Ⅲ组），空白对照组（Ⅳ组）未见明显条带，WB结果图片经过真彩色医学图像分析软件统计，最后以组别作(+)为横坐标，目的条带/β-Actin（%）作为纵坐标作图，均表明转染pcDNA3.1-hHGF后人骨髓间充质干细胞经诱导分化为肝样细胞的能力明显增高。37 第三军医大学硕士学位论文1**0.90.80.70.60.5**0.4AFP/β-Actin0.30.20.101234图2-11：诱导7D后AFP表达1：Ⅳ组7D后AFP表达2：Ⅲ组7D后AFP表达；3：Ⅱ组7D后AFP表达4：Ⅰ组7D后AFP表达（**，与未诱导组相比，P＜0.01；*，与未诱导组相比，p＜0.05）38 第三军医大学硕士学位论文1.2*10.80.6**0.4ALB/β-Actin（%）0.201234图2-12：诱导14D后ALB表达1：Ⅳ组14D后ALB表达；2：Ⅰ组14D后ALB表达；3：Ⅱ组14D后ALB表达；4：Ⅲ组14D后ALB表达（*，与未诱导组相比，p＜0.05）讨论21世纪也是细胞治疗的世纪，干细胞技术在临床上的应用不仅给各类疾病提供了全新的治疗模式，同时也给被病魔折、甚至面临死亡的肝病患者带来新的希望。干细胞为一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官的潜在功能，也是干细胞的自我更新及多向分化能力，使细胞在损伤组织再生方面有强大治疗的潜能。按个体发育中干细胞出现的次序和发育潜能可分为胚胎干细胞及成体干细胞，由于胚胎干细胞的应用存在伦理学、导致畸胎瘤及免疫排斥的因素，其在临床中的应用收到了限制，而成体干细胞存在于胎儿和成体不同组织中的多潜能干细胞，具有自我复制能力，能够发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤等作用。此类细胞具有一下优点：（1）获取容易；（2）应用于自身避免了组织相容性问题，不存在移植排斥反应，术后不需要使用免疫抑制剂；（3）具有多向分化潜能；（4）成瘤风险低，目前应用于临床治疗的成体干细胞分为两类。一类为造血干细胞；另一类为骨髓血干细胞。利用自身或他人的干细胞和干细胞衍生的组织或器官替代病变的组织或器官，能够治疗目前难以医治的多种疾病。它的临床应用将会使许多难治性的疾病的预后产生划时代变39 第三军医大学硕士学位论文化。而且干细胞移植治疗急慢性肝病具有无伦理限制、不存在免疫排斥、不易受病毒或肿瘤的污染等优点，操作简单，安全有效。这是目前国际上唯一一项可以与肝移植相媲美，治疗急慢性肝病的新技术。根据不同环境和药物诱导的作用，干细胞可以分化成多种原始的祖细胞。目前诱导间充质干细胞向肝细胞分化的主要方法有两种，(1)将分离获得的间充质干细胞，加入不同的细胞因子，如肝细胞生长因子、干细胞生长[9,10]因子、表皮生长因子、成纤维生长因子、胰岛素样生长因子-1、转化生长因子-α、[11][12]白介素-10、干扰素-γ等，在体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化;(2)运用肝损伤血清进行诱导：肝损伤患者血清中存在一系列的促进肝细胞生长的因子及化学激活素，[9]如促肝细胞生长因子、成纤维生长因子、白介素2、干扰素等。Sarah等将大鼠骨髓干细胞依次加入FGF-4、HGF、胰岛素转铁蛋白钠亚硒酸盐、地塞米松体外共培养，BMSCs模拟了胚胎发育中肝细胞的分化过程，随着BMSCs向肝细胞分化，早期肝细胞标志物α-AFP和肝细胞核因子3β表达下降,而肝细胞发育晚期标志物ALB、细胞角蛋白18及HNF1α逐渐上升，并出现肝细胞功能表现，如ALB合成、糖原贮存、尿素合成及[13]诱导细胞色素P450活性。Claudia等将大鼠MSCs与肝细胞及SCF、HGF、EGF、FGF-4共培养3周，出现Thy-1及肝细胞特异性ALB、CK-18、CK-19和AFPmRNA表达，提示MSCs在特定微环境中可分化为肝系细胞。大量的研究证实MSCs在体内环境中亦可转化为肝细胞样细胞，促进肝损伤模型动物存活率提高、肝功能改善、肝纤维化程度减[14-15]轻。Aurich等将骨髓间充质干细胞的培养基中加入HGF进行培养，并移植入免疫[20][21]衰竭的小鼠肝脏，结果提示移植的细胞仍然保持高度的分化能力，Oyagietal.等人将含HGF的培养基中培养2周的骨髓间充质干细胞移植入CCL4大鼠模型，结果表明实验组大鼠血清白蛋白水平明显高于未加入HGF培养的对照组，且较对照组显著降低模型大鼠血清转氨酶水平、进一步抑制实验组肝纤维化进一步的研究提示，MSCs逆转肝纤维化的机制可能与其分泌HGF，而后者可进一步诱导肝细胞增殖，并可促进基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）表达，下调转化生长因子-β1（Transforming[15-16]growthfactorbeta1,TGF-β1）表达，从而达到抗纤维化作用，这些研究证实骨髓间充质干细胞在体外可以向肝系细胞分化，其分化发育的特性是自身特性及外界环境的相互作用下实现的。骨髓间充质干细胞成肝细胞的分化，既肝内迁移、植入、整合、转化等，需要众多细胞因子及生在因子的参与，如：肝细胞生长因子，表皮生长因子、碱性成纤维生长因子、制瘤素M、曲古霉素A等，其中HGF是最关键的诱导因子。HGF通过与MSCs表面特异性受体C-met结合，从而激活受体的酪氨酸激酶区，c－端酪氨酸残基自动磷40 第三军医大学硕士学位论文酸化，引起一系列的信号转导，从而表现出促有丝分裂、促细胞运动、促迁移和促细[17]胞形态发生等功能，HGF不仅具有肝细胞保护和促进增生作用，且可在体内外诱导肝干细胞增殖和向肝脏炎症部位迁徙并转化为成熟肝细胞，又可抑制肝星状细胞活化[18]和减少细胞外基质沉积。HGF作为肝脏发育和肝再生过程最基本的细胞因子，在肝脏严重损伤的情况下，仅靠自身分泌的HGF不足以修复肝损伤，因而提高外源性HGF表达是治疗肝损伤的一种可行方案。但考虑到外源性HGF价格贵，半衰周期短，较易受体内微环境影响，获得足量的HGF是治疗的前提，应用基因疗法，我们选择了将hHGF基因转染hBMSCs，而肝硬化病人机体能够分泌一系列细胞因子和化学激活素，血清中含一些肝脏发育和再生中重要的生长因子如肿瘤坏死因子、成纤维细胞生长因子、肝细胞生长因子、白[22]细胞介素2、γ-干扰素、一氧化氮均等，均明显高于正常值，为了排除病毒性肝病患者血清中病毒对干细胞的影响，我们选用了一名酒精性肝硬化患者血清对转染前后的人骨髓间充质干细胞分别用酒精性肝硬化患者血清进行诱导，7D及14D分别检测诱导后细胞内AFP及ALB蛋白表达,以此判定转染hHGF基因后的人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的能力，从而为hHGF修饰后的骨髓间充质干细胞体内治疗慢性肝病的临床应用进一步提供实验依据。小结(+)1．本部分实验成功的应用脂质体2000将pcDNA3.1-hHGF转染人骨髓间充质干细胞，并应用RT-PCR及WesternBlot检测出hHGF的mRNA及蛋白在成功转染细胞中呈现高表达；2．成功应用酒精性肝硬化患者血清诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化，并且转染hHGF基因组细胞表达早期肝细胞标志物AFP及成熟肝细胞标志物ALB明显高于无基因转染组及转染空质粒组，明确了转染hHGF基因后能促进骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化。41 第三军医大学硕士学位论文全文总结本实验应用了基因转染技术，将细胞生长因子导入人骨髓间充质干细胞，提高诱导过程中人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的效率，为临床治疗的应用奠定理论基础，并得出以下结论。(+)1．应用基因重组技术构建了真核表达载体pcDNA3.1-hHGF。并应用限制性内切酶酶切及基因测序鉴定基因编码区序列完全正确，重组质粒构建成功。2．采用贴壁培养法对人骨髓间充质干细胞进行扩增培养，培养后细胞数量多，活力好。(+)3．应用脂质体2000将pcDNA3.1-hHGF成功转染人骨髓间充质干细胞，并且应用RT-PCR及WesternBlot检测到转染hHGF基因细胞组中HGFmRNA及蛋白呈高表达，激光共聚焦显示转染组细胞浆内荧光强度明显强于未转染基因细胞组。4．应用酒精性肝硬化患者血清诱导后的人骨髓间充质干细胞7D左右呈现不规整形或者三角形改变，随后少量细胞分化为肝样细胞，此为多边形细胞，其胞浆较为丰富，核较大，偶可见双核细胞，14D后多边形肝样细胞明显增多。未经诱导组细胞保持均一梭形生长。5．应用酒精性肝硬化患者血清成功诱导人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化，且应用WesternBlot检测出转染hHGF基因细胞组诱导后表达的AFP及ALB较无转染hHGF细胞组高，表明转染hHGF基因后可显著提高人骨髓间充质干细胞向肝样细胞分化的效率。42 第三军医大学硕士学位论文致谢再此论文完成之际，首先谨向我的恩师蒋明德教授表示诚挚的敬意及由衷的感谢，在三年的学习生活中导师始终不断的支持鼓励我，从课题的设计、实施及论文的撰写的每一个环节都倾注了导师的大量心血，导师不仅以渊博的知识及严谨的科学态度指导了我的学业，更以孜孜不倦的敬业态度、开拓创新的奉献精神感染了我，使我得益于此。您是我医学事业的启蒙老师，我有幸从师于蒋明德教授而感到骄傲，同时，我也不会辜负您的殷切希望，学生将在以后的学习及工作中努力拼搏，用优异的成绩回报您。由衷的感谢成都军区总医院感染消化病区曾维政教授及贺莉老师、二病区徐辉教授、一病区吴晓玲老师在临床实践中给予我的支持及悉心指导。由衷的感谢崔洁硕士、张华硕士、向飞博士、汤善洪博士在实验过程中的大力支持及帮助。特别感谢李宁硕士、许森林硕士、胡月华硕士对本人实验给予的热情指导及大力支持，你们是我顺利完成实验的坚强后盾。在此，我还要感谢我的父母及家人，正是由于你们的支持、理解及鼓励，使得我能顺利完成学业。最后，感谢所有关心我和照顾我的老师及同学！43 第三军医大学硕士学位论文参考文献[1]HasharoniA,ZilbermanY,TurgemanG,etal.Murinespinalfusioninducedbyengineeredmesenchymalstemcellsthatconditionallyexpressbonemorphogeneticprotein-2[J].NeurosurgSpine,2005;3(1):47-52.[2]MatsumotoR,OmuraT,YoshiyamaM,etal.Vascularendothelialgrowthfactor-expressingmesenchymalstemcelltransplantationforthetreatmentofacutemyocardialinfarction[J].ArteriosclerThrombVascBiol,2005;25(6):1168-73.[3]LuL,ZhaoC,LiuY,etal.TherapeuticbenefitofTH-engineeringmesenchymalstemcellsforParkinson’sdisease[J].BrainResProtoc,2005;15(1):46-51.[4]Jun-JieHuJJ,SunC,LanL,etal.Therapeuticeffectoftransplantingβ2m−/Thy1+bonemarrow-derivedhepatocytestemcellstransducedwithlentiviral-mediatedHGFgeneintoCCl4-injuredrats[J].GeneMed2010(3);12:244–254.[5]YuY,LvL,QianX,etal.Anti-fibroticEffectofHepatocyteGrowthFactor-expressingMesenchymalStemCellsinSmall-for-sizeLiverTransplantRats[J].StemCellsDev,2009;18(12):.[6]SouthernPJ，BergP.TransformationofmammaliancellstoantibioticResistancewithabacterialgeneundercontroloftheSV40earlyRegionpromoter.[J].JournaloftheMolecularandAppliedGenetics,1982,1(4):327-341[7]NakamuraT,NawaK,IchiharaA.Partialpurificationandcharacterizationofhepatocytegrowthfactorfromserumofhepatectemiedrats[J].BiochemBiophysResCommun,1984;122(3):1450-1459[8]Xue-JunDong,HuiZhang,Ruo-LangPan，etal.IdentifcationofcytokinesinvolvedinhepaticdifferentiationofmBM-MSCsunderliver-injuryconditions[J].WorldJGastroenterol2010July14;16(26):3267-3278[9]SarahS,TamaraV,PeggyP,etal.SequentialExposuretoCytokinesReflectingEmbryogenesis:TheKeyforinvitroDifferentiationofAdultBoneMarrowStemCellsintoFunctionalHepatocyte-likeCells[J].ToxicologicalScience,2006;94(2):330–41.[10]IshikawaT,TeraiS,UrataY,etal.Fibroblastgrowthfactor2facilitatesthe44 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第三军医大学硕士学位论文文献综述骨髓间充质干细胞移植治疗慢性肝病的研究进展各种感染、毒素、代谢等因素引起慢性肝病导致的终末期肝硬化，肝移植是最好的治疗方法，但困于供肝缺乏、免疫排斥反应、手术并发症以及高费用等问题的存在，肝硬化患者目前接受最多的都是对于肝硬化导致的并发症的治疗，比如食管静脉曲张、脾功能亢进、肝性脑病等。人骨髓分离的间充质干细胞(bonemesenchymalstemcells,BMSCs)具有在活体内外分化为肝细胞的潜能,有望成为治疗终末期肝病的新方法，本文就目前国内外应用骨髓间充质干细胞移植治疗各类慢性肝病的研究现状做一初步探讨。1．关于肝脏的损伤与修复肝脏是人体最大的消化器官，肝细胞也易因感染、毒素、代谢、创伤事件受到损伤，是一类具有自我复制潜能的细胞，可以因需要随时进入细胞分裂周期来代偿受损的细胞数量。当肝实质细胞不能代偿损伤的情况下，称为肝脏祖细胞的卵圆细胞经活化可进一步分化为肝细胞及胆管细胞，补充正常细胞数量而代偿受损的肝功能。但是当各种慢性损害持续存在使肝星状细胞活化，细胞外基质合成增多，降解减少，汇管区纤维结缔组织异常增生而导致肝纤维化甚至肝硬化时，会出现如食管静脉曲张、脾功能亢进、肝性脑病、肝腹水等一系列严重并发症。肝移植是最好的治疗方法，而由于供肝缺乏、免疫排斥反应、手术并发症以及高费用等问题的存在，肝硬化患者目前接受最多的都是对于肝硬化导致的并发症的治疗，未来临床应用细胞移植治疗肝病的方式正在积极探索当中。2．治疗慢性肝病移植的细胞种类进行移植的细胞种类大致可分为以下三种：（1）肝细胞移植：临床上肝细胞移植具有替代原位肝移植治疗肝衰竭的趋势,然而,健康人成体肝细胞来源的缺乏限制了其临床应用.大多数情况下,移植肝细胞来源于手术丢弃的肝组织,此类组织中往往合并有过度的脂肪沉积，不适合移植.更为重要的是其分离步骤本身就加重了细胞破坏,导致肝细胞凋亡。（2）胚胎干细胞移植：此类细胞移植后有产生畸胎瘤的可能且存在难以逾越的伦理障碍，所以将其应用于临床甚少。（3）人骨髓干细胞：具有在正常肝脏及一些肝脏病理条件下分化为肝细胞及胆管细胞的潜在功能，有望成为新的47 第三军医大学硕士学位论文[1-4]肝细胞源代替坏死的肝脏细胞。骨髓干细胞有两种，一类为造血干细胞，目前常用的鉴定标记为CD34+，临床上广泛应用于骨髓移植治疗造血系统疾病，一类为间充质细胞，也是本综述主要涉及的细胞，特点如下1、其来源于中胚层的具有自我复制及多向分化潜能，可以跨系、跨胚层分化为其他的组织细胞类型，如成骨细胞、内皮[5]细胞、神经细胞、肾细胞、脂肪细胞、软骨细胞等，2、干细胞移植入体内后，逐向病变部位迁移，成为病变部位的前体细胞，并分化为终末成熟细胞，称为化学趋化性，3、BM-BSCs具有高度的扩增能力，传代后依然保持细胞的染色体核型及端粒酶活性。骨髓干细胞转分化示意图3.MSCs成肝样细胞分化的体外研究依据基于MSCs具有强大的转分化潜力，体外诱导MSCs向肝细胞分化的众多方法中，主要是将分离获得的MSCs中加入不同的细胞因子，如肝细胞生长因子（Hepatocytegrowthfactor,HGF）、干细胞生长因子（Stemcellgrowthfactor，SCF）、表皮生长因子[5，6](Epidermalgrowthfactor,EGF)、成纤维生长因子(Fibroblastgrowthfactor,FGF)、胰岛素样生长因子-1(Insulinlikegrowthfactor-1,IGF-1)、转化生长因子-α(Transforming48 第三军医大学硕士学位论文[7][8]growthfactor-α,TGF-α)、白介素-10(Interleukin-10，IL-10)、干扰素-γ（Interferon-γ，IFN）等，在体外诱导骨髓干细胞向肝系细胞分化。其中，HGF和EGF是最关键的诱导因子。HGF通过与MSCs表面特异性受体C-met结合，从而激活受体的酪氨酸激酶区，c－端酪氨酸残基自动磷酸化，引起一系列的信号转导，从而表现出促有丝分裂、促细[9]胞运动、促迁移和促细胞形态发生等功能，HGF不仅具有肝细胞保护和促进增生作用，且可在体内外诱导肝干细胞增殖和向肝脏炎症部位迁徙并转化为成熟肝细胞，[10]又可抑制肝星状细胞活化和减少细胞外基质沉积。EGF作为一种促生长因子，通过与其受体EGFR/ErbB-1结合而作用于靶细胞。业已证实MSCs表达EGFR/ErbB-1，EGF[11]可促进体外MSCs增殖与分化，诱导MSCs向组织损伤部位迁徙，并促进MSCs分泌[12][5]VEGF和HGF。Sarah等将大鼠骨髓干细胞（Bonemarrowstemcells，BMSCs）依次加入FGF-4、HGF、胰岛素转铁蛋白钠亚硒酸盐（Insulin-transferrin-sodiumselenite，ITSS）、地塞米松体外共培养，BMSCs模拟了胚胎发育中肝细胞的分化过程，随着BMSCs向肝细胞分化，肝细胞发育早期标志物α-AFP和肝细胞核因子3β(Hepatocytenuclearfactor3β,HNF3β)表达下降,而肝细胞发育晚期标志物ALB、细胞角蛋白18(cytokeratin18,CK18)及HNF1α逐渐上升，并出现肝细胞功能表现，如ALB合成、糖[13]原贮存、尿素合成及诱导细胞色素P450活性。Claudia等将大鼠MSCs与肝细胞及SCF、HGF、EGF、FGF-4共培养3周，出现Thy-1及肝细胞特异性ALB、CK-18、CK-19[14,15]和AFPmRNA表达，提示MSCs在特定微环境中可分化为肝系细胞。Lan等利用二步法免疫磁珠法分选β2m-/Thy-1+骨髓源性肝干细胞（bonemarrow-derivedhepatocytestemcells，BDHSCs)，认为其是具有肝细胞分化潜能的BMSCs的亚群，并证实其可表达肝细胞的特征性标志物，如ALB、AFP、CK18、HNF4α、HNF6和c-met，亦表达干细胞生长因子受体c-kit、基质细胞衍生因子1（Stromalcell-derivedfactor-1，SDF-1）受体CXCR4等。4、MSCs治疗肝病的体内研究依据[16,17]大量的研究证实骨髓MSCs在体内可向肝细胞分化，参与肝损伤的修复。在[18]慢性肝病中已有较多实验证实了MScs治疗的有效性，Petersen等以CCl4制造大鼠肝衰模型，并以2-乙酰氨基芴阻断受体鼠自身肝细胞增殖，通过三种途径追踪移植的骨髓细胞：（1）将雄性大鼠骨髓移植到受致死量照射的同系雌鼠体内后，用DNA探针检测Y染色体的sry区来分辨受体肝脏中供体来源的细胞。（2）将二肽基肽酶Ⅳ阳性（DPPIV+）的雄性大鼠的骨髓移植到DPPIV-的同系雌鼠体内，检测受体肝内表达DPPIV的细胞。（3）将表达L21-6抗原的Lewis大鼠作为受体，不表达该抗原的同种49 第三军医大学硕士学位论文异体Brown-Norway大鼠作为供体进行全肝移植，检测移植肝中L21-6+细胞。通过以上三种途径证实肝卵圆细胞的骨髓源性。近年来，大量的研究证实MSCs在体内环境中可转化为肝系细胞，促进肝损伤模型动物存活率提高、肝功能改善、肝纤维化程度[19-21]减轻。进一步的研究提示，MSCs逆转肝纤维化的机制可能与其分泌HGF，而后者可进一步诱导肝细胞增殖，并可促进基质金属蛋白酶（matrixmetalloproteinase,MMP）表达，下调转化生长因子-β1（Transforminggrowthfactorbeta1,TGF-β1）表达，[20、22]从而达到抗纤维化作用。另有研究认为，Liv-8阴性，而Thy-1阳性骨髓干细胞[23.24]在体内外均可转化为肝系细胞，SDF-1及其受体CXCR4与骨髓干细胞在体内向[25]肝脏损伤部位归巢机制有关。有报道成体骨髓间充质干细胞移植可以治疗延胡索酰乙酰乙酸水解酶阴性小鼠（FAH－／－敲除），发现缺陷鼠肝脏几乎被正常的功能性肝[26]细胞完全取代。Liuf等报道经脾移植及经腹股沟静脉移植骨髓间充质干细胞可提高D一半乳糖胺诱导的急性肝衰竭大鼠的生存率，改善肝功，并提出1.4g/kg剂量的[27]D-氨基半乳糖胺一次性腹腔注射为诱导SD大鼠急性肝衰模型的最好剂量。5．临床BM-MSCs移植干细胞进入临床应用不仅给各类疾病提供了全新的治疗模式，同时也给面临死亡疾病的患者带来了新的希望，通过先分离及纯化患者自体骨髓干细胞，然后将干细胞输入到患者的肝内，使这些干细胞在肝内“落户”。由于骨髓干细胞有着很强的“因地分化”特性，所以当骨髓干细胞被移植到患者肝脏组织后，就像种入肝脏的种子，在肝脏微环境调节下“入乡随俗”地分化为肝细胞，新生的肝细胞便承担起病肝不能胜任的工作，从而改善了患者的肝功能。临床上进行骨髓间充质干细胞移植的途径亦较多，比如肝脏内、脾脏内、腹膜腔内等，目前采取通过门静脉进行干细胞移植的临床案例较多。6．BM-MSCs肝病治疗中存在的问题及前景，骨髓间充质干细胞治疗肝硬化目前仍然处于初期阶段，还面临着很多技术难题，MSCs移植在肝纤维化、肝硬化研究领域取得了重大进展，然而临床应用仍在进一步[28]探索之中，存在争议，Mare等在采用惹蕈碱抑制肝实质细胞增殖的基础上，用四氯化碳制造肝损伤模型，进行10的8次方全骨髓细胞移植，结果发现骨髓干细胞移植并不能促进肝功的恢复，受体鼠的死亡仅与四氯化碳的剂量有关，而与是否移植细胞无关。免疫组化检测发现，除了极少数的白细胞来源于供体外，未见其他供体来源的[29]细胞存在，并指出肝组织的恢复主要是通过肝实质细胞的增殖来完成，Hideaki及其研究组对经放射线照射又行肝部分切除的小鼠通过尾静脉移植10的5次方EGFP阳性50 第三军医大学硕士学位论文骨髓细胞，同时设立假切除阴性对照。结果提示移植后4周时，肝内EGFP阳性细胞表达CD31增加而不表达ALB，并发现在肝再生过程中，肝组织内血管内皮生长因子（VEGF）浓度升高，认为骨髓细胞参与了肝部分切除后的肝脏再生，但主要分化为窦状隙内皮细胞而不是肝实质细胞。所以，将骨髓间充质干细胞运用于急性肝衰竭仍有许多工作和技术难点需要更深入的探索。在衰竭肝脏环境下提高移植后体内MSCs的数量、存活及向肝细胞的分化率至关重要。因此，改善MSCs的移植效率仍是目前需要迫切解决的问题。骨髓间充质干细胞用于临床存在的问题可归纳为以下几点：（1）自体骨髓干细胞移植能够促进患者肝功能改善，但对于食道静脉曲张及脾功能亢进等顽固并发症无明显作用；（2）移植入的细胞在受损肝脏中的抗纤维化作用已经被证实，但是移植入的细胞在肝脏内的分化进程及特性还不清楚,要进一步了解干细胞可塑分子基础，包括移植后形成肝细胞的各类信号通路、转录调节、细胞外诱导信号及其发挥作用的时间、空间、剂量需要进一步探讨；（3）干细胞目前尚未发现特异的细胞表型，因此鉴定干[30]细胞还在于进一步研究，有研究发现CD34+的细胞具有显著的肝脏再生能力.以后[31]发现SP亚群也具备相似的多向分化能力,然而SP亚群却富含CD34-细胞；（4）移植的细胞在体内放入长期命运尚不确定，需要在动物实验体内进行评价，包括移植后的功能，遗传、表观稳定性及成瘤性危险等。随着深入研究，相信能够在对骨髓间充质干细胞的认识上有进一步突破，必将推动其在慢性肝病中的广泛应用。51 第三军医大学硕士学位论文参考文献[1]LevicarN,PaiM,HabibNA,TaitP,JiaoLR,MarleySB,DavisJ,DazziF,SmadjaC,JensenSL,NichollsJP,ApperleyJF,GordonMY.Long-termclinicalresultsofautologousinfusionofmobilizedadultbonemarrowderivedCD34+cellsinpatientswithchronicliverdisease[J].CellProlif2008;41(1):115-125[2]urichI,MuellerLP,AurichH,LuetzkendorfJ,TisljarK,DollingerMM,SchormannW,WalldorfJ,HengstlerJG,FleigWE,ChristB.Functionalintegrationofhepatocytesderivedfromhumanmesenchymalstemcellsintomouselivers[J].Gut,2007;56:405-415[3]YagiK,KojimaM,OyagiS,Applicationofmesenchymalstemcellstoliverregenerativemedicine.[J]YakugakuZasshi2008;128(1):3-9[4]YanL,HanY,WangJ,LiuJ,HeY,WangH,FanD.Peripheralbloodmonocytesfromthedecompensatedlivercirrhosiscouldmigrateintonudemouseliverwithhumanhepatocyte-markersexpression[J].BiochemBiophysResCommun,2008;371:635-638[5]SarahS,TamaraV,PeggyP,etal.SequentialExposuretoCytokinesReflectingEmbryogenesis:TheKeyforinvitroDifferentiationofAdultBoneMarrowStemCellsintoFunctionalHepatocyte-likeCells[J].ToxicologicalScience,2006;94(2):330–41.[6]IshikawaT,TeraiS,UrataY,etal.Fibroblastgrowthfactor2facilitatesthedifferentiationoftransplantedbonemarrowcellsintohepatocytes[J].CellTissueRes,2006;323(2):221-31.[7]HuangYH,ShiMN,ZhengWD,etal.Therapeuticeffectofinterleukin-10onCCl4-inducedhepaticfibrosisinrats[J].WorldJGastroenterol,2006;12(9):1386-91.[8]WengHL,WangBE,JiaJD,etal.Effectofinterferon-γonhepaticfibrosisinchronichepatitisBvirusinfection:arandomizedcontrolledstudy[J].ClinGastroenterolHepatol,2005;3(8):819-28.[9]NeussS,BecherE,WoltjeM,etal.FunctionalexpressionofHGFandHGF52 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