钙网蛋白在不同疼痛模型大鼠脊髓中的表达

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1、钙网蛋白在不同疼痛模型大鼠脊髓中的表达【摘要】目的：观察钙网蛋白在三种疼痛模型大鼠的脊髓中表达的变化，探讨其与疼痛的可能关系.方法：分别制作甲醛炎性痛模型、保留性坐骨神经分支损伤（SNI）模型和慢性缩窄性坐骨神经损伤（CCI）模型，观察大鼠疼痛行为学改变，并分别用免疫组化和:Todetectthechangeofratspinalcalreticulinexpressionlevelsinthreepainmodelsandtoinvestigatethepossibleinvolvementofcalreticulininpaindevelopment.METHODS:F

2、ormalininflammatorypainmodel,sparedneverinjury(SNI)model,andchronicconstrictioninjury(CI)modelmunohistochemistryandentofchronicneuropathicpaininducedbySNIandCCI.　　【Keym.SH组仅暴露坐骨神经.　　1.2.3行为学检测痛级均数(painintensityrating,PIR)计算：观察甲醛模型注射后1h内大鼠疼痛行为学变化，将痛反应分4级计分：0分两后爪同时着地，活动无异常；1分左后爪轻触地面，跛行；2分

3、左后爪抬起，不接触地面；3分大鼠舔、咬或摇动左后爪.疼痛程度以PIR表示，PIR＝(T1+2×T2+3×T3)/300,式中T1,T2,T3分别为观察的每单位时间(300s)内出现1,2,3级疼痛的持续时间（单位s）［3］.　　机械缩爪阈值测定：SH,SNI和CCI组大鼠手术后14d内隔日使用足底触觉测量仪测定机械缩爪阈值，以50％缩爪阈值表示.采用upanddoin.从2g开始，若呈阴性反应则选择上移一个刺激级别(3.63g)，若呈阳性反应则选择下移一个刺激级别(1.20g)，依次类推.当出现相邻两次反应不一致（阳性反应变为阴性反应或阴性反应变为阳性反应）时，继续依

4、序刺激4次.计算机械刺激的50%缩爪阈值如下：50％缩爪阈值=10log(X)+kδ（X为最后刺激使用的力度，k为不同刺激方式的系数.δ是各相邻级别刺激力度对数值之差的平均数，此处δ＝0.224）.若需选择的刺激力度超过15.1g或低于0.45g，则50％缩爪阈值直接记为15.1g或0.45g［4］.　　1.2.4取材和标本制作SA组和F组大鼠注射后2h处死取材，其余各组大鼠术后第14日测痛后处死取材.大鼠腹腔注射100g/L水合氯醛400mg/kg麻醉.每组取3只大鼠以40g/L多聚甲醛心脏灌注固定，分离、截取腰4~6段脊髓，40g/L多聚甲醛后固定4h，蔗糖脱水，30μ

5、m冰冻切片；另3只大鼠迅速断头处死，在冰面上取脊髓腰4~6段，提取总蛋白，考马斯亮兰法定量.　　1.2.5免疫组织化学实验切片用PBS洗涤，30mL/LH2O2处理，入100mL/L羊血清封闭，37℃30min，入1∶500稀释的兔抗cFos抗体孵育，4℃12h，经PBS洗后加入1∶400稀释的生物素化羊抗兔IgG，37℃孵育1h，SABC复合物37℃孵育30min，DAB显色，常规脱水、透明、封片.在显微镜下计算脊髓后角Ⅰ～Ⅳ层cFos阳性神经元数目，比较疼痛大鼠与相应对照组大鼠脊髓cFos阳性神经元数目的变化.1.2.6in，然后4℃过夜，PBS洗膜后1∶500相

6、应HRP标记二抗室温孵育1h，显色照相，进行灰度分析以观察钙网蛋白相对表达水平的改变.统计学处理：计量资料以x±s表示，采用SPSS10.0进行统计分析.组间比较采用单因素方差分析，两两比较采用Duntst检验.P<0.05为差异有统计学意义.　　2结果　　2.1疼痛行为学改变足底注射后，F组大鼠呈现明显的两相疼痛反应，分别出现在注射后10min内和20min后，PIR较SA组明显升高，差异有统计学意义（P<0.05，图1A）.SNI组大鼠术后第2日术侧50％缩爪阈值即开始下降，CCI组大鼠术侧50％缩爪阈值在第5日左右开始下降.术后第14日，SNI组和CCI

7、组大鼠术侧50％缩爪阈值均较假手术组降低，差异有统计学意义（P<0.05，图1B）.　　2.2cFos的表达脊髓后角cFos阳性神经元分布较广泛，主要位于Ⅰ～Ⅳ层，在ⅠⅡ层分布较为密集，呈胞核棕褐色深染圆形颗粒.各疼痛模型组患侧脊髓后角Ⅰ～Ⅳ层cFos阳性神经元数目与相应对照组相比均明显增多，差异有统计学意义（P<0.05，图2）.　　2.3钙网蛋白的表达SNI组和CCI组大鼠脊髓钙网蛋白的表达均升高，与SH组相比差异有统计学意义(P<0.05)，但F组大鼠与SA组、两不同处理的对照组间差