肺炎克雷伯菌菌株β

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1、肺炎克雷伯菌菌株β引言1.研究背景肺炎克雷伯菌（KleBsiellaPneumoniae)属于肠杆菌科细菌，是人和动物肠道及上呼吸道的正常菌群成员⑴。然而，肺炎克雷伯菌常引起医院感染，如肺炎、肠炎、脑膜炎、外伤感染及泌尿感染、败血症等，同时也是产Β-内酰胺酶常见细菌之一[2]。根据氣基酸序列及底物不同，β-内酰胺酶可有多种类型，其中以KΒC、TEM、CTX-M、SHV和OXA较为常见，但不同地区分离菌株优势Β-内酰胺酶基因型有一定差异[5_8]。最近我们发现，抗生

2、素分子可作为信号分子，诱导多种细菌药物钝化酶基因高表达，其中基于组氣酸激酶（histidinekinase,HK)的细菌二元信号传导系统（t,TCSS)可能发挥了重要作用[9]。.氯氰破柳胺（dosantel)是目前常用的HK特异性抑制劍[i。]。为了了解本地区肺炎克雷伯菌Β-内酰胺酶基因携带情况及其优势基因型、细菌TCSS在Β-由酰胺酶基因表达中的调控作用，本研究中我们首先检测了浙江地区分离的118株β-内酰胺类抗生素耐药肺炎克雷伯菌临床菌株携带的β-内酸胺酶基

3、因种类及其分布，同时对Β-内軟胺类抗生素上调Β-内酰胺酵基因表达以及氯氰碟柳胺抑制抗生素诱导的β-内酰胺酶基因表达的作用进行了研究。2.研究内容(1)临床分离菌株的鉴定及其耐药性测定(2)临床分离的耐药菌株对青霉素、头孢蜜席MIC测定(3)药物常见β-内敏；胺晦基因分布的βCR检测(4)药物β-内酸胺酶基因DNA片段的克隆与序列测定(5)抗生素诱导及组氨酸激酶阻断后药物β-内酰胺醇基因mRNA水平变化.第一章临床分离菌株耐药性与药物&

4、Beta;-内酰胺酵的检测1.1材料2012年1月~12月由浙江大学附属第二医院、浙江省人民医院、杭州市第二人民医院、浙江省中医院、浙江医院、浙江中医药大学附属第二医院检验科从住院病人中分离并鉴定了118株Β-内酰胺类抗生素耐药肺炎克雷伯菌，其中54株分离自下呼吸道感染病人痰液标本、37株分离自泌尿道感染病人尿液标本、16株分离自感染性胸膜炎病人胸水标本和11株分离自败血症病人外周血标本。各菌株经VITEKβact2型全自动细菌检测分析系统及其配套的细菌鉴定卡GNI进行鉴定，另釆用美

5、国临床和实验室标准协会（ClinicalandLaβoratoryStandardsInstitute,CLSI)推荐的微量试管稀释法确定上述菌株对多种Β-内酸胺类抗生素耐药性[]。0.01MβH7.4碟酸盐缓冲液：Na2HΒ04l2H202.9g、KH2ΒO40.24g、NaC18.00g、KCl0.20g,加800ml蒸德水使其充分溶解，定容至1000ml，高压蒸汽灭菌（121°C，15min),于4°C内保存。0.1MβH

6、8.0Tris-HCl缓冲液（含ImMEDTA)：1.21gTrisβase,0.292gEDTA,用适量蒸馏水充分溶解，用盐酸调βH至8.0后，定容至1000ml,高压蒸汽灭菌（121°C，15min)，于4°C内保存。M-H琼脂平板：取38gMH谅脂粉，加980ml蒸傭水使其充分溶解，定容至l000ml，高压蒸汽灭菌（121°C，15min)，于4°C内保存。..2.2方法和步操118株对Β-内酰胺类抗生素耐药的菌株由浙江大学附属第二医院

7、、浙江省人民医院、杭州市第二人民医院、浙江省中医院、浙江医院、浙江中医药大学附属第二医院检验科提供。其培养基为含0.5%酵母提取物（Oxoid)的Todd-Hea)。釆用细菌基因组DNA提取试刹盒（GENEray)提取各受菌株基因组DNA，紫外分光光度法测定其浓度和纯度[12]。根据文献报道的KΒC、TEM、CTX-M、SHV和OXA基因通用引物序列，根据文献报道的引物序列委托上海Invitrogen公司合成各引物。引物序列见本文第一部分2.4药物Β-内敏；胺酶基因引物设计（表1)。

8、吸取200菌液均匀涂布在事先涂有40020mg/mlX-gal和2(
lOOmg/mlIΒTG的含氨节青霉素LΒ固体培养基平板上，室温待涂布的液体基本吸干后，37°C倒置培养12-16h,可见菌落出现，重组子呈现白色菌落，非重组子为蓝色菌落。..第二章药物(3-内酰胺酶基因DNA片段克隆及序列测定.......15第三章抗生素诱导及组氨酸激酶阻断后药物β-内酰胺酶基因........26讨论......