胰蛋白酶诱导肺上皮细胞分泌白细胞介素

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1、胰蛋白酶诱导肺上皮细胞分泌白细胞介素【关键词】胰蛋白酶Inductionofsecretionofinterleukin8fromlungepithelialcellsbytrypsin　　【Abstract】　AIM:Toinvestigatetheactionsoftrypsinonthesecretionofinterleukin8(IL8)fromhumanlungepithelialcells.METHODS:A549cellsedbyaddingvariousconcentrationsoftrypsinortrypsininhibi

2、torintoeachinatedbyremovingthesupernatantfromeachinethelevelsofIL8insupernatants.RESULTS:Folloanner.AsloepithelialcellsandthemaximumofaccumulatedreleaseofIL8orethanthebaselinerelease.Hoecourseshoculturedhumanlungepithelialcells,indicatingthatitislikelytobeinvolvedinthepathoph

3、ysiologicalprocessofairmation.　　【Keya公司，DMEM培养液、胎牛血清（FBS）、胰蛋白酶EDTA消化液均购自Gibco公司.　　1.2方法　　1.2.1细胞培养人肺癌上皮细胞系A549细胞（购自中国科学院上海细胞研究所）接种于50mL培养瓶内，用DMEM完全培养液（含100g/LFBS,10×104U/L青霉素和100mg/L链霉素），于37℃，50mL/LCO2培养箱中培养.　　1.2.2上皮细胞激发实验待细胞铺满瓶底后，用2.5g/L胰蛋白酶EDTA消化液消化，将获得的细胞分种于12孔培养板各孔内，用1mL

4、完全培养液培养至细胞相互融合后，换无血清培养液培养16h.然后向每孔的细胞内加入不同浓度的胰蛋白酶和/或胰蛋白酶抑制剂进行激发实验.胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶加入细胞前在冰上孵育30min,细胞培养2,8和16h后收集上清液，离心后于-80℃冻存.全部实验为双样，每组实验均重复5次.　　1.2.3细胞上清IL8水平检测用人IL8ELISA检测试剂盒（Biosource）,检测细胞上清液中的IL8水平，并用酶标仪(MolecularDevices公司)于450nm波长处测定吸光度（A）.　统计学处理：数据以x±s表示,采用SPSS(11.0版)软件进

5、行单因素方差分析,组间方差不齐时采用非参数秩和检验.P0.05为有统计学意义.　　2结果　　2.1胰蛋白酶对肺上皮细胞系IL8释放的影响经过16h的培养，胰蛋白酶可引起浓度相关性IL8释放增加，胰蛋白酶1μg/L时就可引起IL8释放量增加，3μg/L时达高峰,为基础分泌量的5倍，但随着胰蛋白酶浓度的再增加,IL8的释放量反而下降（Fig1）.时间关系曲线显示，胰蛋白酶引起A549细胞分泌IL8从2h起就有所增加，16h增加最显著（Fig2）.　　2.2胰蛋白酶抑制剂对胰蛋白酶诱导释放IL8的抑制作用胰蛋白酶抑制剂和胰蛋白酶与A549细胞共同培养1

6、6h后结果显示：SBTI在浓度为10和30mg/L时可分别抑制胰蛋白酶诱导的A549细胞释放IL8的作用（Fig3）.α1AT在浓度为10mg/L也能抑制胰蛋白酶引起的IL8释放（Fig4）.　　3讨论　　研究表明，PAR2激活能介导气管平滑肌的收缩、促进炎症性细胞的游走和血管的通透性增加，介n=5.bP0.05vsthecorresponding.　　导嗜酸性粒细胞的浸润〔8〕，调节血管舒张与收缩，调节消化道和皮肤的功能等〔9〕.呼吸道上皮细胞PAR2的激活还可导致基质金属蛋白酶（MMP9）〔10〕、粒细胞巨噬细胞集落刺激因子（GMCSF）〔1

7、,2〕、酸性粒细胞趋化因子〔4〕、前列腺素E2（PGE2）、白细胞介素（IL）6等〔4〕细胞因子的释放，提示PAR2可能参与气道的炎症和重塑.激活PAR2的蛋白酶主要有胰蛋白酶、肥大细胞类胰蛋白酶及凝血因子Ⅶa,Xa〔11〕.　　我们的研究表明,胰蛋白酶对呼吸道上皮细胞IL8的分泌有显著促进作用,表明胰蛋白酶能通过激活PAR积极参与呼吸道的炎症过程，间接证明了PAR在哮喘和慢性阻塞性肺疾病的发病过程中起着一定的作用.胰蛋白酶可引起肺上皮细胞高达5倍的IL8释放，表明它对IL8的释放促进作用是高效的.IL8的释放量高达1.7μg/L，达到了IL8发

8、挥其生理和病理生理功能的浓度.胰蛋白酶抑制剂SBTI对胰蛋白酶诱导IL8释放的抑制作用，表明胰蛋白酶的作用是通过其水解活性实现的，也表明