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1、腺病毒介导心肌营养素-1对成年大鼠脊髓损伤的修复作用1.广东省深圳市宝安区中心医院深圳5181022.第三军医大学附属新桥医院重庆400037［关键词］:大鼠；腺病毒；心肌营养素；脊髓损伤；修复木研究用大鼠C3脊髓外侧索横切模型，腺病毒载体直接注射，观察心肌营养素-1(CT-1＞对红核神经元的存活、红核脊髓束轴突再生和前肢功能恢复的影响。1.材料与方法1.1实验动物及分组成年Wistar雌性大鼠，体重180-240g(大坪医院动物室提供)。随机分为5组：正常组(N):正常动物；损伤组(GF):SCI+明胶海绵(gelfoam)+病毒缓冲液；病毒对照组(Adv-eGFP):SCI+明胶海绵+
2、Adv-Egfp;Adv-CTl组(Adv-CTl):SCI+明胶海绵+Adv-CTl。每组动物在1、4、8周Fluord-Gold(FG)(Fluorochrome,Inc.)观察神经元存活，4周Dextran,Biotin,10,000MW,lysinefixable(BDA-10,000)(MolecularProbes,D-1956)观察轴突再生，2、3、4周观察动物行为学，每个时间点4只动物。1.2动物手术及观察C3脊髓外侧索横切模型(C3HX):常规麻醉和暴露颈段脊髓，用微型锐利刀片C3脊髓背根下方2mm垂直切下，并切除2-3mm,形成约l×2mm2大小的空洞。这种
3、切除范围括整个外侧索(包含红核脊髓束)、部分腹侧索和前后角部分灰质，背侧索完整。给药方式:病毒组:纯化病毒用10mmTris.HCI(pH7.4)稀释至107pfu/ml,用约5-10ul病毒液饱和明胶海绵，植入空洞。对照组：直接放入5-10ul10mmTris.HCI饱和的明胶海绵。CT-1组:CT-1100ug/ml饱和明胶海绵，放入空洞5min,取出15min后放入重新CT-1饱和明胶海绵，重复3次，最后再放入CT-1饱和明胶海绵。8-0丝线缝合硬脊膜，关闭伤U。术后肌肉20万U青霉素注射，分笼喂养。FG注射：动物取材前3d,动物重新麻醉。再生观察组暴露双侧C5外侧索，2%FGlul
4、微电极(成茂会社，日本)缓慢注入。存活观察组暴露双侧C2外侧索，并分别注入lul2%FG。关闭伤口，3d后取材。脑桥冠状面30m冰冻切片(CM1900,Leica),红核长度大约1000m,共30张切片左右，按顺序置于栽玻片上。每张切片于荧光显微镜(MPS1063,Leica)下紫色激发荧光观察FG标记的红核神经元，每张每侧标记的神经元计数。为避免过度计数，每张切片计数2次，取平均数。只奋能辨认神经元细胞核、核仁和细胞形态神经元才可计数。计数吋采取相邻切片对照观察，避免神经元重复计数。显微镜放大倍数为100倍。BDA注射：动物取材前15d，动物重新麻醉。动物置于立体定位仪(成茂会社，日本｝
5、上“零位”固定。切开颅顶皮肤，30%H2O2置于颅骨氧化颅骨缝，辩认前卤，牙科转颅骨开窗。微电极推进器(成茂会社，日本)控制玻璃尖端直径50um的微电极。右侧红核定位：Bregma点向后5.8mm，向外侧0.7mm,距卢页骨深为7.4mm(PaxinosG.Theratbraininsterotaxiccoordinates.Academicpress)o微电极缓慢刺入红核。注射参数：阳性脉冲直流电5uA,频率为注射7s后停7s;时间为30min,0.5ul10%BDA。关闭伤口，分笼喂养，15d后取材。脑切片30um,脊髓切片25um。按BDA试剂盒说明行BDA免疫组华染色。1.3行为学
6、试验所有动物采用前肢的不对称试验观察行为的改变。评分行为、评分内容、评分标准根据文献严格执行。每组动物在试验后2、3、4周评分，每只动物观察吋间为：正常前肢+伤肢+双肢靠壁吋间=5min。1.4统计学处理FG标记红核神经元计数用表示，行为学评分用正常前肢、伤肢、双肢靠壁吋间的百分比表示。t-test检验两组间的差异。2结果2.1FG神经逆行示踪(1)红核神经元存活计数SCI后在损伤区上一个节段双侧注射FG，FG逆行示踪标记的红核神经元作为神经元存活计数。发现双侧红核神经元均标记。在损伤后1-4周，标记红核神经元数几乎无变化。损伤后8周，损伤组、CT-1组、Adv-eGFP组、Adv-CTl
7、组标记神经元分别减少31%、29%、32%、19%。Adv-CTl组与损伤组相比，有显著性差异(P<0.05)。Adv-CTl明显支持红核神经元的存活(表1＞。2.1BDA神经顺行示踪损伤4周后，脊髓作损伤上区、损伤区和损伤下区的横切片观察BDA标记的轴突。损伤上区，正常组、治疗组和对照组均有大量标记的轴突，数0依次减少。在损伤区，由于RST处空洞没奋被完全充填，治疗组和对照组在白质内未见标记的轴突，但在后角可见散
