趋化因子受体ccr5胞外段重组蛋白的克隆、表达、

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1、趋化因子受体CCR5胞外段重组蛋白的克隆、表达、【关键词】因子Cloning,expression,purificationandidentificationofCCR5extracellulardomainrebinantprotein【Abstract】AIM:ToconstructaprokaryoticexpressionvectorofCCR5extracellulardomainrebinantproteinandtopurifyandidentifyit.METHODS:Toobtainaminoa

2、cidsequenceofCCR5extracellulardomains,thefourpeptidesofCCR5（Nterm,ECL1,ECL2andECL3）edrCCR5.RCCR5geneproteininclusionbodies.TheprocedureincludedAbprotein.CONCLUSION:PurifiedrebinantproteinrCCR5isobtainedsuccessfully,，ECL1,ECL2和ECL3的氨基酸序列，应用柔性linker分别串联，模拟CCR5胞

3、外结构，依据大肠杆菌偏爱密码子人工合成基因.运用基因重组方法在大肠杆菌中进行表达,表达产物经纯化、复性后进行DYQVSSPIYDINYYTSEPCQKINVKQIAAR(31)；ECL1：YAAAQCQ(14)；ECL2:RSQKEGLHYTCSSHFPYSQYQF(22).应用柔性linker（氨基酸序列为GGGGS）分别串联，获得模拟CCR5胞外片段的氨基酸序列(命名为：rCCR5)，按照已公布的人CCR5的基因序列，于5′端插入NdeⅠ酶切位点,3′端引进终止密码子TGA并插入SalⅠ酶切位点，依据大肠杆菌

4、偏爱的密码子，送交上海生工生物技术公司合成目的基因.1.2.2pET22b(+)/rCCR5表达载体的构建将含有合成目的基因的质粒pUC57经NdeⅠ和SalⅠ双酶切后，回收360bp左右的小片段，同时用NdeⅠ和SalⅠ双酶切pET22b(+)，回收大片段.建立连接体系，16℃连接过夜.连接产物转化感受态DH5α细胞，提取质粒，经酶切鉴定和DNA测序正确后获得含有rCCR5基因原核表达载体，命名为pET22b(+)/rCCR5.1.2.3pET22b(+)/rCCR5原核载体的表达pET22b(+)/rCCR5

5、转化感受态BL21细胞，挑取含重组表达质粒的大肠杆菌BL21单菌落并接种于5mL含100mg/L氨苄青霉素（Amp）的新鲜LB培养液中,37℃摇床培养过夜,次日以1∶100接种于含100mg/LAmp的新鲜LB培养液中,37℃继续培养至细菌密度达到A600nm=0.4～0.6,1mmol/LIPTG诱导，4h后收菌，小规模培养及诱导后离心收集菌体,SDSPAGE检测目的蛋白的表达和存在形式.1.2.4工程菌的发酵从活化的LB平板上挑选单菌落接种于含LB的试管中,37℃培养10h,转种至含200mLLB的三角瓶中,

6、37℃培养过夜.次日将种子液接种于5L发酵罐.控制发酵温度37℃，转速250～450r/min、通气量3～5L/min，pH7.3.培养至A600nm=8时,1mmol/LIPTG诱导，继续培养4h,终止发酵,收集菌体、称质量，-20℃冰箱保存备用.取少量菌体处理后用SDSPAGE检测目的蛋白的表达.1.2.5目的蛋白包涵体的分离和洗涤取10g发酵菌体,按1g湿菌质量对7mL的比例,用裂解缓冲液STE(50mmol/LTrisHCl,pH8.0,50mmol/LNaCl,1mmol/LEDTA)重悬,-20℃过夜

7、.次日于室温水浴中融化,溶菌酶法裂菌，400in,弃上清,沉淀用包涵体洗涤液A(10mL/LTritonX100,1mmol/LEDTA,10g/LDOC，50mmol/LTrisHCl，pH8.5,100mmol/LNaCl)重悬,12000g4℃离心20min,弃上清.再用包涵体洗涤液B（50mmol/LTrisHCl，pH8.5,2.5mol/L尿素,100mmol/LNaCl,5mmol/Lβ巯基乙醇,1mmol/LEDTA）重复洗涤3次,直至离心后的上清液澄清为止.最后用包涵体洗涤液C(50mmol/L

8、TrisHCl，pH8.5,1mmol/LEDTA)洗涤1次后离心，离心条件不变.1.2.6表达产物变性条件下的纯化经洗涤的包涵体以100g/L溶于缓冲液（50mmol/LTrisHCl，pH8.5,5mmol/Lβ巯基乙醇,1mmol/LEDTA,8mol/L尿素）中,4℃搅拌过夜,12000g4℃离心30min,收集上清,即为目的蛋白粗提液.SephacrylS300