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《针对趋化因子受体ccr5的spa_wga药物筛选方法》由会员上传分享，免费在线阅读，更多相关内容在教育资源-天天文库。
1、∀1266∀中国药理学通报ChinesePharmacologicalBulletin2006Oct;22(10):1266~71实验方法学针对趋化因子受体CCR5的SPAWGA药物筛选方法11111,2陈仁海,吕燕慧,胡琼莹,裴钢,陈力(1.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031;2.上海靶点药物有限公司,上海200233)中国图书分类号:R3412;R39211;R9651术要求高和操作复杂,有的需大量的时间和人力,有的则成文献标识码:A文章编号:1001-1978(2006)10-1266-06本花费很高,不适合药物的快速
2、初筛。因此迫切需要寻找方[4,5]摘要:目的建立针对趋化因子受体CCR5的药物筛选SPA便、灵敏、快速、适于高通量的药物筛选方法。相关文献WGA法[35S]GTPS结合实验方法。方法通过降低SPA表明SPAWGA法[35S]GTPS结合实验是一种能满足上述WGA小球用量和对其他各种因素进行优化,如细胞膜用量、要求的药物筛选方法。35GDP浓度、体系孵育时间和样品连续测量时间,建立了SPASPAWGA法[S]GTPS结合实验采用SPA(scintilla35WGA法[S]GTPS结合实验方法。结果最后优化得到tionproximityassay)技术,又称亲
3、和闪烁技术,测定GPCR激实验条件为:100l反应体系,01mgSPAWGA小球,10g活G蛋白的的水平。该法使用SPAWGA小球,该小球表面-1-135涂有发光分子和一种凝集素分子WGA(wheatgermagglutiCHOCCR5细胞膜,10mol∀LGDP和03nmol∀L[S]GTPS,室温孵育15h并且在1200min之内完成所有样nin,麦胚素)。小球通过WGA分子与细胞膜上的糖残基形品测量。该法与传统抽滤法比较,测量得到RANTES的成共价键与细胞膜结合,当激动剂作用CCR5激活细胞膜上-1-13535EC50分别为:140nmol∀L和290
4、nmol∀L,测量得到的G时,[S]GTPS取代下结合在G上的GDP,[S]-1-1GTPS释放出!粒子激活小球表面的分光分子而发出光SCHC的IC50分别为:295nmol∀L和273nmol∀L,测35量结果相似,均呈现出较好的剂量效应关系。利用该法筛选子。那些未与细胞膜G结合的[S]GTPS与SPAWGA-1小球相对较远,35S释放出的!粒子被极性溶剂吸收只能传54个化合物,筛到3个IC50在1~10nmol∀L的化合物。这3个化合物是否具有HIV1进入抑制剂的潜在开发价值,播几微米而无法激活小球表面的发光分子。全世界许多制[6]还有待体外抗HIV1实验的进
5、一步验证和筛选。结论此药公司已运用该法进行针对GPCR的高通量药物筛选。方法操作简便,灵敏性和重现性好,且可高通量和自动化,该为了减少了实验成本,本文通过减少SPAWGA小球用法适用于能与Gi家族蛋白偶联的GPCR的高通量药物筛量和优化实验体系,建立了适合国内实际情况的SPAWGA35选。法[S]GTPS结合实验方法,该法是一种针对CCR5的经35济的高通量药物筛选方法。关键词:趋化因子受体CCR5;亲和闪烁法;[S]GTPS结合1材料与方法实验方法;高通量筛选1.1药品和试剂GDP购自Sigma公司;考马斯亮蓝蛋白趋化因子受体CCR5是一种G蛋白偶联受体(Gpr
6、otein浓度测定试剂盒(Bioford,BioRadProteinAssay)购自Biocoupledreceptor,GPCR),其内源性激动剂有RANTES、MIP35Rad公司;[S]GTPS(26TBq/mmol)和WGASPA小球均1和MIP1!,它与很多人类疾病有着密切的联系,如多发购自Amersham公司;MEM培养基、胰蛋白酶和胎牛血清性硬化症、AIDS、风湿性关节炎等,因此CCR5为治疗这些疾均购自Gibco公司;重组人RANTES购自Peprotech公司;所病提供了一个新的靶点,特别是该受体作为HIV1进入人宿有化合物由上海靶点药物有限公司合成
7、提供。主细胞的辅助受体,对开发新型抗HIV药物有着很大的价1.2仪器液闪计数仪购自Beckman公司。[1~3]值。目前针对CCR5的基础研究和药物筛选研究的方1.3细胞和细胞培养CHOCCR5永久细胞系表面稳定高法有:放射性配体受体结合分析法、第二信使Ca2+或cAMP-1表达人CCR5,培养在含有10%胎牛血清和250mg∀L的检测、信号传导通路下游激酶活性或转录因子活性检测、G418的MEM中,培养条件为:37#,5%CO。每
