cik细胞对乳腺癌细胞株抗增殖及诱导凋亡的作用

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1、CIK细胞对乳腺癌细胞株抗增殖及诱导凋亡的作用【摘要】目的研究多种细胞因子诱导的杀伤细胞(Cytokineinducedkillcells,CIK)对ZK751乳腺癌细胞株的抗增殖和诱导凋亡作用，并探讨其作用机制。方法应用MTT法检测CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株的抗增殖作用的影响及细胞毒活性；通过倒置显微镜、HE染色、透射电镜观察凋亡细胞的形态学改变。结果MTT比色法表明随着CIK细胞与乳腺癌细胞效靶比增加及作用时间延长，抑制率明显增强（P<0.01）。CIK细胞作用于乳腺癌细胞24h后，形态学观察乳腺癌细胞发生凋亡或坏死。结论CIK细胞是一种新型高效具有较强

2、杀伤体外乳腺癌细胞的免疫活性细胞。【关键词】CIK细胞ZK751乳腺癌细胞抗肿瘤细胞凋亡　　0引言　　从80年代Rosenberg等观察到在患非免疫系统肿瘤的动物中给予重组白细胞介素2（IL2），动物的淋巴细胞可以调节肿瘤的消退和转移以来，细胞免疫治疗就迅速扩展开来，人们先后研究了淋巴因子激活的杀伤（LAK）细胞，肿瘤浸润淋巴(TIL)细胞，CD3单抗激活的杀伤(CD3AK)细胞，但是由于细胞来源困难、细胞扩增倍数低或者细胞毒力不高等原因，上述细胞的临床应用受到极大限制。为此，美国斯坦福大学医学院骨髓移植研究中心1991年首先报道了具有高增殖能力和高细胞毒性的多种细胞因子诱

3、导的杀伤细胞(Cytokineinducedkillcells,CIK)细胞[1]。目前，国内尚未见应用CIK细胞体外诱导肿瘤细胞凋亡的形态学观察和机制探讨。本课题通过光镜、电镜观察了CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞株作用的形态学变化。　　1材料与方法　　1.1材料　　1.1.1药品及试剂基因重组人IL2、鼠抗人CD3McAb、淋巴细胞分离液、基因重组人IFNγ、RPMIMedium1640培养基、IMDM培养基、胎牛血清、MTT。　　1.1.2肿瘤细胞ZK751乳腺癌细胞株由西安医科大学肿瘤研究所提供，由本科室体外传代培养。　　1.2方法　　1.2.1效应细胞制备取

4、健康者的成分白细胞用淋巴细胞分离液（比重为1.077±0.001）经Ficoll密度梯度离心法（densitygradientcentrifugation）提取单个核细胞（PBMC），此细胞被重悬并保存于IMDM培养液中（含10％FCS）。调至１×10６个/ml，第0d加入IFNγ2000u/ml，PHA100μg/ml放置37℃、5%CO2细胞培养箱中培养24h，第1d加CD3McAb5μg/ml,重组人IL21000u/ml,继续培养。每3d半量换液，同时补加IL21000u/ml，PHA100μg/ml调细胞浓度至１×10６个/ml，第14d收获细胞。　　1.2.2MT

5、T法测量细胞存活率取对数生长期乳腺癌细胞0.4％台盼蓝染色及计数，调整浓度至1×105个/ml细胞悬液为靶细胞，取培养14d的CIK细胞调整浓度为１×10６个/ml为效应细胞。按10∶1、20∶1、30∶1的效靶比混合加入96孔板，另设单独效应细胞组（效应细胞＋培养液）及单独靶细胞组为阴性对照组（靶细胞＋培养液）、每组重复8孔，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养24h、48h后取出，每孔加MTT20μl(5mg/ml),继续培养4h后小心弃去上清液，加入二甲基亚砜（DMSO）160μl,轻轻振荡10min后用酶联免疫检测仪λ＝490nm测吸光度（A）值，杀伤率计算公式为：抑制率

6、（%）＝[１－(实验孔A值－效应孔A值)/靶细胞孔A值]×100%　　1.2.3倒置显微镜观察将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1接种于24孔培养板内，置于37℃、5％CO2细胞培养箱中培养，随时在倒置显微镜下观察。设对照组为单纯培养的乳腺癌细胞。　　1.2.4HE染色观察将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1接种于已放置支持物小盖片的12孔培养板内。对照组：加等量生理盐水。连续培养24h后取出小盖片。将小盖片用4％多聚甲醛固定30min后，水洗3min，苏木素2min，水洗3min，0.5％盐酸酒精8s，水洗15min，90％乙醇5min，伊红30s，脱水、透明及封固。　　1.2.

7、5透射电镜观察将CIK细胞和靶细胞以效靶比30∶1混合的4、12及24h细胞离心，弃去上清液，剩下的细胞团用2.5%戊二醛固定、梯度丙酮脱水;Epon812混合树脂包埋;超薄切片机切片;醋酸钠和柠檬酸铅染色;透射电镜观察、照相。　　1.2.6统计学处理　　应用SPSS11.0软件：进行统计学处理，MTT法检测的抑制率之间的比较采用t检验。　　2结果　　2.1MTT法检测CIK细胞对ZK751乳腺癌细胞的抗增殖及细胞毒结果　　随着效靶比增加及作用时间延长，其细胞毒