紫杉醇对膀胱癌ej细胞株增殖抑制及诱导凋亡的作用

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1、紫杉醇对膀胱癌EJ细胞株增殖抑制及诱导凋亡的作用郭春龙黄艳丽朱晓敏张春阳冯禄王赞滔姜华茂【关键词】紫杉　　摘要：目的：探讨紫杉醇体外抑制膀胱癌EJ细胞株及诱导凋亡的作用。方法：体外培养膀胱癌EJ细胞株，以不同浓度紫杉醇处理12～72h后，通过MTT法测定细胞生长抑制作用，采用电镜观察和DNA琼脂糖凝胶电泳检测细胞凋亡。结果：紫杉醇能抑制EJ细胞的生长，并在一定剂量和时间范围内呈现出明显的时间、浓度依赖关系。电镜下凋亡细胞体积缩小，染色质浓缩致密，并沿核膜分布形成花瓣形。电泳见出现典型的凋亡DNA梯形带。结论：紫杉醇能抑制

2、膀胱癌EJ细胞株的生长，诱导凋亡可能为其抗肿瘤作用机制之一。　　关键词：紫杉醇；膀胱癌；细胞凋亡　　膀胱癌是泌尿系最常见的恶性肿瘤，手术切除是膀胱癌治疗的首选方法。但是膀胱癌的易复发性常使单纯采用手术疗法难以获得满意疗效，应用化疗作为辅助治疗手段可望减少肿瘤患者的复发率，提高其生存率。紫杉醇（Paclitaxel，商品名：Taxol）是从紫杉树皮中提取的一种新型抗微管广谱抗癌药，具有特异性地稳定细胞微管的作用〔1〕。本研究旨在体外观察紫杉醇对膀胱癌EJ细胞株的抑制和诱导凋亡作用，以探讨紫杉醇对膀胱癌的临床应用价值。　　1

3、材料与方法　　11试剂　　紫杉醇由上海华联制药有限公司提供，临用前稀释至所需浓度；RPMI1640培养基(含10％胎牛血清，青霉素及链霉素各100U/ml)；L谷氨酰胺2mmol/L、丙酮酸钠1mmol/L购自华美公司；四甲基偶氮唑蓝（MTT）购自Sigma公司。　　12细胞培养　　人膀胱癌EJ细胞株购自上海午立生物有限公司，培养于含有10％胎牛血清，100U/ml青霉素、链霉素的培养基中，在37℃、5％CO2培养箱内常规传代培养。取对数生长期细胞用于实验。　　13实验分组　　对照组：不加药，每天更换1640全培养液。实

4、验组：紫杉醇浓度分别为10、50、100、500nmol/L，接种细胞24h进入对数生长期后开始加药，每天换液以维持药物浓度恒定。　　14细胞毒性分析　　应用MTT比色法测定不同浓度紫杉醇对EJ细胞增殖的影响，并绘制剂量效应曲线。将对数生长期的EJ细胞以0.25％胰蛋白酶消化，用含10％胎牛血清的RPMI1640培养液配成单细胞悬液，细胞数为2×104/ml接种于96孔培养板。接种细胞24h进入对数生长期后开始加入不同终浓度的紫杉醇，每浓度设4个复孔，并设对照孔。置于37℃含5％CO2孵箱中分别培养12、24、48、72

5、h后每孔加MTT（5mg/ml）20μl。作用4h后弃上清，各孔加入100μlDMSO，振荡10min，使结晶物充分溶解。在酶标仪570nm波长处读取吸光度A值。细胞生长的抑制率（％）＝（对照组A值－实验组A值）/对照组A值×100％〔2〕。　　15透射电子显微镜观察　　取对照组及实验组细胞（细胞数量为106～107）倒出瓶中培养液，用PBS液（0.01mol/L，pH7.2）洗3min×3次，后加入2.5％戊二醛4℃放置10min。用接种环刮下细胞移入离心管中，2000r/min离心15min。用接种环刮起细胞块，将细

6、胞块与戊二醛一起转移到青霉素小瓶中，4℃放置2h。用PBS洗3min×3次（注意加液时一定不要冲散细胞团块），1％锇酸在4℃固定1h。PBS洗3min×3次，脱水（50％、70％、80％、90％、100％乙醇各1次15min/次；100％丙酮2次，10min/次）。吸弃瓶中的脱水剂，加3ml纯丙酮EPON812包埋剂（1：1体积比），室温下放置30min后，弃去稀释的包埋剂，加纯包埋剂1ml室温放置2h或过夜。吸混合包埋剂2滴于2号胶囊模块孔的底部，把细胞团块移入胶囊底部中心，注意混合包埋剂，置37℃、45℃分别12h，

7、置60℃24h，修块，制备半薄切片，定位后制备超薄切片，醋酸铅铀染色，透射电镜观察。　　16DNA提取及电泳分析　　取对数生长期的EJ单细胞悬液2×106个接种于培养瓶内，24h后待细胞进入对数生长期开始加入不同浓度的紫杉醇，培养48h收集贴壁及悬浮细胞，1000r/min，离心5min，弃培养液，再加入1mlPBS重悬细胞移入1ml微量离心管中，1000r/min，离心5min弃上清。加入50μl细胞裂解液，混匀，于37℃水浴至混合物变得清亮。在高速冷冻离心机中－4℃12000/min，10min，将上清转移至另一微量

8、离心管中。以等体积的苯酚/氯仿（1：1），苯酚/氯仿/异丙醇（25：24：1）和氯仿各抽提一次。在上清中加入1/10体积3mol/L醋酸钠和2倍体积的无水冷乙醇，于－20℃沉淀过夜。在－4℃12000r/min离心10min。收集将沉淀溶入20μlTBE缓冲液，加入1μlRNA酶，37℃保温1h。加入4μl样品缓冲液