羌活和宽叶羌活简单重复序列区间扩增反应体系的正交优化

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1、羌活和宽叶羌活简单重复序列区间扩增反应体系的正交优化作者：古松蒋舜媛唐学芳孙辉杨志荣孙群【摘要】　　目的通过探讨羌活和宽叶羌活ISSR实验中各种因素的影响，以建立羌活和宽叶羌活的简单重复序列区间扩增（ISSR-PCR）最佳反应体系。方法利用正交实验设计L9(34)对羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系的4因素（Mg2+，dNTP，引物，Taq酶）在3个水平上进行优化实验，PCR结果用SPSS13.0统计软件分析，并设置梯度PCR进行引物退火温度筛选。结果在20μlISSR-PCR反应体系中，各组分的最适浓度为：2.0mmol/LMg2+，250μmol/LdNTPs，0

2、.50μmol/L引物，1UTaq酶，40ngDNA模板；模板DNA40～90ng，不同引物有不同的最佳退火温度，范围在48～52℃。结论该优化体系的建立为进一步进行羌活和宽叶羌活种群间遗传多样性研究提供了参考。【关键词】羌活宽叶羌活简单重复序列区间扩增正交实验设计　　Abstract:ObjectiveTheoptimalISSR-PCRreactionsystemforNotopergiumincisumTingandN.forbesiiBoissinerase,Mg2+,dNTPsandprimer)izeISSRPCRamplificationreactions

3、ystemofN.incisum.andN.forbesii.ThedataofPCRresultsperaturesalISSR-PCRreactionsystemcontained2.0mmol/LMg2+,1UTaqDNApolymerase，250μmol/LdNTPs,0.50μmol/Lprimerand40ngDNAtemplateinthetotalvolumeof20μl.TheAnnealingtemperaturerangedfrom48to52℃.ConclusionTheoptimalISSR-PCRreactionsystemprovidest

4、hebasisforfurtherstudyonthegeicdiversityamongthepopulationsofN.incisum.andN.forbesii.　　Keyincisum;N.forbesii;ISSR-PCR;Orthogonaldesign　　羌活NotopterygiumincisumTingexH.T.Chang和宽叶羌活N.forbesiiBoissieu是我国特有的伞形科羌活属的多年生草本植物［1］，均为中药羌活的基源植物，以干燥根茎及根入药［2］，系传统中藏羌药的常用药材之一。主要分布在四川、青海、甘肃、西藏等省的高寒山区，历来依靠野

5、生采挖。近年来的掠夺性采挖和生境破坏，致使各个道地产区面临资源枯竭和种质资源丧失的威胁，已被列入国家III级保护植物［3］，并进入中国濒危物种红色名录［4］。目前关于羌活在分子生物学方面的研究尚属空白。本次实验旨在建立一个适合于羌活和宽叶羌活ISSR-PCR反应体系，为下一步利用ISSR技术开展该类群的种质资源遗传多样性、遗传图谱构建和基因定位研究提供参考。ISSR（inter-simplesequencerepeats,简单重复序列区间扩增）是Zietkieer4个因素各3水平对羌活ISSRPCR反应体系的条件进行筛选比较，并通过统计分析确立较为可靠的优化组合，在此基

6、础上进行引物退火温度的梯度筛选。　　1材料与方法　　1.1材料　　分别于20050917在四川省阿坝州壤塘县南木达乡和20060606在岗木达乡单株采集到羌活（J155）和宽叶羌活（J276）鲜嫩叶片，置硅胶中快速干燥，编号保存，并提取其DNA作为PCR扩增的模板。　　1.2试剂与仪器　　ISSR引物采用加拿大大不列颠哥伦比亚大学（UniversityofBritishColumbia）提供的引物序列（set#9，NO.801-900），经筛选以UBC827，即(AC)8G作为此次正交实验的固定引物，由北京赛百胜基因技术有限公司合成；100bpDNALadder购

7、自Fermentas；DL2000购自清华天为时代；dNTP、TaqDNA聚合酶购自大连宝生物有限公司；琼脂糖为Sigma公司产品，其它试剂为国产分析纯。　　PCR反应在美国MJ公司的PTC-200型PCR循环仪上进行。DNA浓度和纯度测定使用英国Biochrom公司生产的GeneQuantPro核酸检测仪。　　1.3DNA的提取和测定　　参照邹喻萍等［9］改良CTAB稍加改动，提取其DNA，用核酸检测仪测定所提DNA的浓度和纯度，并在0.8%琼脂糖凝胶上通过电泳检测其是否降解，然后稀释成30ng/μl，备用。　　1.4PCR