乌头简单序列重复区间扩增条件的优化

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1、乌头简单序列重复区间扩增条件的优化作者：张岳峰万里翔侯大斌【摘要】　　目的保证乌头ISSR-PCR的稳定性、提高对乌头遗传多样性,亲缘关系分析、种质鉴定的可靠性。方法收集西南地区23个乌头材料，以Mg2+，dNTP，引物和聚合酶建立L9（34）正交设计，并同时考察模板和甲酰胺浓度及退火温度，建立适宜的ISSR-PCR体系。结果以Mg2+2.0mmol/L、dNTP0.25mmol/L、引物0.3μmol/L、rTaq酶1U、模板1.5ng/μl、甲酰胺2%及退火温度（Tm-3）℃的ISSR反应体系最优。结论实验建立的ISSR-PCR体系反应稳定，能用于乌头的ISSR分析

2、。【关键词】乌头简单序列重复区间优化　　Abstract：ObjectiveTokeepthestabilityofISSR_PCRandreliabilityofgeicdiversity,sibshipanalysisandsourceassessingforAconitumcarmichaelDexb.Methods23kindsAconitumcarmichaelDexb.samplesinsoutherandTaqpolymerase)and3levels(concentration)orthogonaldesignexperiment.Meanentsfor

3、forma-mide,templateconcentrationandannealingtemperatureaffectcouldbeentby23samplesISSR-PCRreactionassessing.ConclusionTheoptimizedISSR-PCRreactionsystemcanbestablyusedforAconitumcarmichaelDexb.geicanalysis.　　KeycarmichaelDexb.;Inter-SimpleSequenceRepeat;Optimization　　乌头Aconitumcarmichael

4、Dexb．为毛茛科乌头属植物，别名五毒根［1］。为毛茛科植物乌头，在中国西南地区四川盆地有较大栽培面积，其母根叫乌头或川乌，为镇痉剂，可用于治风痹、风湿神经痛。侧根（子根）入药，称附子(RadixAconitiLateralisPreparata)。　　ISSR-PCR技术，简单序列重复区间(Inter-SimpleSequenceRepeat，ISSR)，是Zietkie）已建立的附子资源圃200份附子种质资源类型中筛选出优势代表材料23份（见表1），上年种植，200707采摘顶部功能嫩叶数片，置4℃保存，提取DNA所用。　　表1乌头样品引种来源（略）　　2方法　　

5、2.1DNA提取采用陈亮［6］并稍加改良的CTAB方法提取DNA，通过紫外和琼脂糖电泳检测其纯度、浓度和完整性后，用以ISSR-PCR优化实验。　　2.2反应体系正交实验采用L9(34)正交实验设计，对Mg2+（大连TaKaRa提供），dNTP（TaKaRa），引物（上海生工提供）和rTaq聚合酶（TaKaRa）进行4因素3水平［7］筛选，方案如表2。根据表2制备总体积为20μl的反应体系，体系中还存在1×PCR缓冲液和30ng模板DNA，其余用过柱超纯水补充，引物选用哥伦比亚UBC系列847号引物，在德国EppendorfMastercyclerGradient仪上扩

6、增，PCR扩增程序为：94℃预变性3min，94℃变性30s，Tm847－3℃(52.8-3=49.8℃)退火45s，72℃延伸2min，40个循环；72℃延伸10min，4℃保存。　　扩增结束后，PCR产物在1.5%的含溴化乙锭(0.5μg/ml)琼脂糖凝胶电泳，电极缓冲液为0.5×TBE,电压3V/cm,电泳结束在Bio-Rad凝胶成像系统分析并拍照。　　2.3模板DNA浓度筛选应用表2中最佳组合，选用引物UBC846，20μl体系中模板浓度分别置为0.5，1.5，3.0ng/μl和6ng/μl共4个浓度处理。　　2.4甲酰胺对扩增稳定性实验选定的正交最佳反应体系,

7、选用引物UBC846，20μl体系中设空白对照；甲酰胺(绵阳荣盛AR)浓度分别为0.5%，1.0%，2.0%和4.0%。　　表2ISSR-PCR正交实验设计（略）　　2.5不同复性温度影响根据正交最佳体系，结合引物UBC846用梯度PCR仪设定PCR退火温度梯度范围45～55℃。　　3结果　　3.1PCR正交实验分析PCR扩增结果是由Mg2+，dNTP引物和DNA聚合酶综合交互共同决定的，从图1中可以看出，各种因素的浓度差异，扩增结果有显著的差别。其中8，7，9号谱带依次增强，其原因是由于rTaq酶的增加。2，4，8酶量相同，PCR产物随