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1、HPLC法测定甲肿消及大鼠血清中土贝母苷甲的含量甲肿消处方由夏枯草、土贝母等组成,按适当工艺制成浓度为3g/mL原药材的浸膏剂。动物和临床试验证明,该制剂具有较好的化痰散结、治疗甲状腺功能亢进型甲状腺肿大的作用。但其作用途径与机理尚不清楚,故我们采用血清药理学的方法,观察本制剂大鼠灌胃给药后的含药血清对甲状腺细胞增殖的影响,以阐明本方治疗甲状腺功能亢进的机理。土贝母为葫芦科植物土贝母[Bolbostemmapaniculatum(Maxim.)Franquet]的干燥块茎,有散结、消肿、解毒之功效。从中分离出的土贝母苷甲是其主要有效成分,具有抗肿瘤、抗病毒、免疫抑制等多种活性[1]
2、。因此,我们采用RP-HPLC法建立了大鼠含药血清中的代表性成分土贝母苷甲(土贝母)的含量测定方法,为进一步阐明本方治疗甲状腺功能亢进的机理提供分析方法。 1仪器与试药LC-10A高效液相色谱仪和SPD-10A紫外检测器(日本导津公司)；XE215P型分析天平(Sartorius)；DiamonsilC18分析柱(250mm×4.6mm,5μm)；Easyguard保护柱(迪马公司)；固相萃取小柱(C18SPE,200mg,3mL,瓦里安公司)。体重(330±10)g的雄性L/kg的剂量灌胃给予甲肿消浸膏剂,10只按体重给予同剂量生理盐水,每天2次,连续7d。末次灌胃后开始计时,
3、于60min后,用玻璃毛细管自乙醚麻醉大鼠眼底采血,收集血样于离心试管中,放置2h促凝,1500r/min离心10min,吸取上清液,0.22μm滤膜过滤,滤液即为含药血清和空白血清,-20℃冷冻保存。 2.2甲肿消和大鼠含药血清中土贝母苷甲的含量测定 2.2.1甲肿消样品的前处理 精密称取甲肿消浸膏约3g,分别用甲醇(15、15、10mL)超声(300in,0.45μm滤膜过滤,合并滤液,加甲醇定容至50mL。精密量取10mL,减压除去溶剂,残渣精密加入甲醇2mL,超声溶解,0.45μm滤膜过滤,取续滤液作为含量测试试液。 2.2.2血清样品中土贝母苷甲的前处理 冻存血
4、清于室温解冻备用。选取C18SPE柱(200mg,3mL,60μm),先用2mL甲醇冲洗,再用2mL纯水冲洗活化；精密量取血清1mL上样,弃去流出液,用2mL纯水冲洗,再用1mL甲醇洗脱,收集甲醇洗脱液作为供试液。护理论文发表 2.2.3色谱条件 色谱柱：DiamonsilC18(250mm×4.6mm,5μm)和Easyguard保护柱；流动相：甲醇-水(65∶35)；流速：1mL/min；检测波长：214nm；进样10μL。色谱图见图1。2.2.4标准曲线的测定 精密称取土贝母苷甲标准品11.8mg,用65%甲醇配成浓度为118μg/mL的标准溶液,然后分别用65%甲醇稀
5、释制成土贝母苷甲浓度为14.75、29.5、59、88.5、118μg/mL,按“2.2.3”项色谱条件测定。以土贝母苷甲的峰面积A和浓度C作图,进行线形回归,得标准曲线方程：A＝2503.1C－2300.5,R2＝0.9996,土贝母苷甲在14.75～118μg/mL的浓度范围内线性良好。 取土贝母苷甲浓度为118μg/mL的标准溶液,分别精密量取一定量,加入空白血清,使土贝母苷甲浓度为1.18、2.36、11.8、14.75、29.5、59、88.5μg/mL,按“2.2.2”和“2.2.3”项操作,记录土贝母苷甲的峰面积。以峰面积A和浓度C作图,进行线形回归,得标准曲线方程
6、：A＝2458.2C＋2127.8,R2＝0.9993,血清样品中土贝母苷甲在1.18～88.5μg/mL的浓度范围内线性良好。 2.2.5精密度和回收率测定 取土贝母苷甲浓度为59μg/mL的标准溶液,按“2.2.3”项色谱条件测定3次。将峰面积代入标准曲线方程,计算土贝母苷甲的浓度为(59.40±2.00)μg/mL,与配制浓度比较,计算精密度,RSD＝3.39%。取土贝母苷甲标准溶液加入空白制剂中,制成浓度为59μg/mL的样品溶液,分别按“2.2.1”和“2.2.3”项操作,测定3次。将峰面积代入标准曲线方程,计算土贝母苷甲的浓度,计算回收率为(103.49±3.49)
7、%。取土贝母苷甲标准溶液加入空白血清中,制成浓度为29.5μg/mL的血清样品溶液,按“2.2.2”和“2.2.3”项操作,记录土贝母苷甲的峰面积。将峰面积代入标准曲线方程计算浓度,与配制浓度比较,平均回收率为(104.70±4.69)%(n＝3)。 2.2.6甲肿消和大鼠血清样品中土贝母苷甲含量的测定护理论文发表 精密称取甲肿消浸膏3.086g,按“2.2.1”和“2.2.3”项操作；精密量取灌胃给予甲肿消后的大鼠血清1mL,按“2.2.2”和“2.2.3”项操
